制備特異性沙門氏菌h:6診斷血清的工程菌株及構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種能夠制備特異性沙門氏菌H:6診斷血清的工程菌株及其構建方法，它是利用現代分子生物學技術對傳統的多克隆抗體制備體系進行改造，構建表面鞭毛抗原合成基因缺失的宿主菌；將不同病原微生物的表面鞭毛抗原合成基因克隆到適合表達的載體中，并轉入抗原基因缺失的宿主菌中，得到一系列具有相同遺傳背景，含有不同病原微生物特異性表面鞭毛抗原基因的工程菌株。利用上述技術體系能夠構建一個包含若干種沙門氏菌的特異抗體庫。該抗體庫可補充現有抗血清種類，同時也可為其他免疫學技術的應用提供基礎。
【專利說明】制備特異性沙門氏菌H:6診斷血清的工程菌株及構建方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物制品【技術領域】，涉及能夠制備特異性沙門氏菌系列診斷血清的工程菌株，更具體說是一種能夠制備特異性沙門氏菌H: 6診斷血清的工程菌株及構建方法。
【背景技術】
[0002]沙門氏菌{Salmonella)屬于腸桿菌科(feieroAacieriaceae),是革蘭氏陰性菌。沙門氏菌廣泛分布于自然環境及動物的腸道中，大多數能引起家畜、鼠類和禽類等動物的疾病，有些菌株能造成人類的食源性疾病。
[0003]鞭毛是負責細菌運動的器官,對細菌致病性也有重要影響。細菌的鞭毛蛋白具有強的免疫原性，構成了細菌的鞭毛抗原(H antigen)。鞭毛蛋白與細菌的致病機理、生物膜的形成有密切的關系，也是被內在的免疫系統通過Toll-1ike 5受體所識別的一種與致病性相關的分子。鞭毛抗原(H抗原)是沙門氏菌等革蘭氏陰性菌表面的主要抗原之一，其血清學水平上的變異在種內分型上有重要意義。鞭毛相位變異(選擇性表達2個不同的鞭毛蛋白基因)是細菌的一種重要機制，可以使細菌適應不只一種生存環境，尤其是可以逃避宿主免疫系統。沙門氏菌有兩種表面抗原:0_抗原和鞭毛蛋白(H-抗原)。沙門氏菌的鞭毛蛋白是由或/7及基因所編碼的，約1.5 kb。沙門氏菌的H抗原分為第一相和第二相。一相由編碼，二相由/7及編碼，這兩個基因通過變位機制協同表達。目前，已經確定了沙門氏菌46種O抗原和114種H抗原，在不同的組合下，產生2523種血清型。
[0004]研制沙門氏菌診斷血清一直是生物制品領域的熱門課題。傳統制備診斷血清的方法包括免疫原及免疫血清的制備，吸收與檢定及穩定性試驗等相關步驟已經非常成熟。但傳統方法耗時長，工作量大。且獲得的是多克隆血清，其特異性不高，常發生一些交叉反應。本發明致力于改造傳統的多克隆抗體制備體系，利用當今生物學領域最經典的現代分子生物學技術，如基因缺失、克隆構建等技術實現了快速制備特異性的沙門氏菌診斷血清。利用本發明的技術能夠生產用傳統方法很難生產的血清，同時還可以構建一個包含若干種沙門氏菌的特異抗原庫。利用該抗原庫能夠建立包含多種沙門氏菌特異抗體的抗體庫，該抗體庫可補充現有抗血清種類。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是構建能夠制備特異性沙門氏菌H: 6診斷血清的工程菌株；
本發明的目的通過以下技術方案實現:
一種能夠制備特異性沙門氏菌H: 6診斷血清的工程菌株，其特征在于:它是將含有編碼鞭毛抗原6基因的重組質粒pTrC99a-/7及(6)，轉入表面鞭毛抗原合成基因缺失的沙門氏菌中得到的能夠有效表達鞭毛抗原6的工程菌株。
[0006]更具體地說是將基因用質粒pKD3上的氯霉素乙酰轉移酶基因替換，將fljB基因用質粒PKD4上的卡那霉素抗性基因替換，通過抗生素初步篩選出缺失菌株，再經過PCR鑒定及測序鑒定，得到相應的缺失菌株G4831 Δ fliC Δ fljB,然后再將構建的重組質、粒pTrc99a-/7及(6)轉入其中，篩選得到能夠有效表達鞭毛抗原6的工程菌株。
[0007]本發明所述的能夠制備特異性沙門氏菌H:6診斷血清的工程菌株，其中所述一相鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831缺失后基因大小為IlOObp (氯霉素乙酰轉移酶基因)，其序列為SEQ ID NO =10
[0008]本發明所述的能夠制備特異性沙門氏菌Η:6診斷血清的工程菌株，其中所述二相鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831 ΛΛ/7及，缺失后基因大小仍為1500bp (卡那霉素抗性基因)，其序列為SEQ ID NO:2。
[0009]本發明進一步公開了能夠制備特異性沙門氏菌H:6診斷血清的工程菌的構建方法，其特征在于按如下的步驟進行:
(1)表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株(G4831及)的構建；
(2)重組質粒pTrc99a-/7及(6)的構建；
(3)含有重組質粒pTrc99a-/7及(6)的克隆菌株的構建。[0010]本發明利用現代分子生物學技術對傳統的多克隆抗體制備體系進行改造，構建表面鞭毛抗原合成基因缺失的宿主菌；將不同病原微生物的表面鞭毛抗原合成基因克隆到適合表達的載體中，并轉入抗原基因缺失的宿主菌中，得到一系列具有相同遺傳背景，含有不同病原微生物特異性表面鞭毛抗原基因的工程菌株。用制備的工程菌抗原免疫動物，用具有相同遺傳背景但不含鞭毛抗原的宿主菌吸附除去非目的抗體，能夠實現交叉反應的有效去除和抗體制備的標準化和工程化。利用本發明的技術可以獲得能夠制備特異性H:k，H:r, H:y, H:z, H:ζ6, Η:zlO, Η:zl3, Η:zl5, Η:z28, Η:z29, Η:v, H:w, H:6 等多種沙門氏菌診斷血清的工程菌株。
[0011]本發明更加詳細的構建方法如下:
1、表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株(G4831及)的構建
本發明選用本實驗室編號為G4831 (格羅斯出浦沙門氏菌)為目的菌株，利用噬菌體λ的Red重組系統介導鞭毛基因和/7及的缺失。現針對基因說明一下主要過程，先合成一對引物，每一條引物的5'端有39 bp與基因同源，3'端與抗氯霉素基因同源(用于篩選)，以抗氯霉素模板質粒pKD3 (Genebank AY048742)的氯霉素乙酰轉移酶基因為模板，通過PCR擴增獲得中間為一個約1033bp的氯霉素乙酰轉移酶基因，其兩端為39bp同源臂的線性打靶DNA片段，通過切膠回收純化得到該片段。將該線性打靶DNA片段電擊轉化到提前導入Red重組系統的G4831中誘導Red重組系統適量表達，λ核酸外切酶結合到線性打靶DNA片段兩39bp同源臂末端，酶切產生游離3'單鏈DNA區段，從而使兩同源臂和G4831染色體間以鏈侵入的方式發生重組。線性打靶DNA片段插入到G4831染色體上基因兩同源臂之間，而G4831染色體上兩同源臂間的基因序列被其置換，從而完成了 fliC基因的缺失，得到的fliC基因缺失菌株。
[0012]本發明中的Red重組系統由pSim質粒完成，需要提前導入到目的菌株中。pSim質粒載有適用于很多腸道細菌的DNA重組系統，是一種溫度敏感性質粒，在42°C時表達，溫度高于32°C時即丟失。
[0013]/7及基因的缺失是在基因缺失菌株基礎上引入另一個抗性篩選片段完成的，和基因的缺失的原理相同。經過上述兩次缺失，得到/7Y基因和fljB基因均缺失的菌株。[0014]2、重組質粒pTrc99a_/7及(6)的構建
本發明通過比對ncbi上和鞭毛抗原6相關的fljB基因序列，經過比對分析設計fljB基因通用擴增引物，在兩條引物的5 '端分別加入NcoI和BamH I的酶切位點。
[0015]本發明選用pTrc99a這一低拷貝質粒作為克隆載體，以本實驗室編號為G4819(倫敦沙門氏_基因組為模板，用nJB基因通用擴增引物PCR擴增fljB基因(鞭毛抗原6基因)，用Nco I和BamH I做雙酶切，與同樣經過雙酶切的載體連接，得到含有鞭毛抗原6基因的重組質粒。
[0016]3、含有重組質粒pTrc99a_/7及(6)的克隆菌株的構建
將經過酶切和PCR鑒定正確的重組質粒電轉化入基因和fljB基因均缺失的菌株中，經過抗性篩選轉化子和菌落PCR鑒定，得到含有能夠表達鞭毛蛋白6的重組質粒的克隆菌株。
[0017]4、驗證克隆表達實驗:
利用細菌動力實驗和血清學實驗驗證重組質粒的表達情況。
[0018]細菌動力實驗具體是利用細菌鞭毛的游動性原理，長鞭毛的細菌能在半固體培養基中游動，不長鞭毛的細菌則無法游動，如果重組質粒能夠表達出鞭毛蛋白，同時該鞭毛蛋白可以組裝到鞭毛缺失菌的表面，使其長出鞭毛，恢復動力。本發明將利用克隆菌株在半固體培養基上的游動情況驗證重組質粒的表達情況。
[0019]血清學實驗具體是利用鞭毛抗原與相應抗體的特異性結合反應，有鞭毛的細菌能和相應的抗體發生凝集反應，沒有鞭毛的細菌則不能，如果重組質粒能夠表達出鞭毛蛋白，該鞭毛蛋白能夠組裝到鞭毛缺失菌的表面，使其長出鞭毛，就可以用血清來檢測鞭毛抗原的存在情況。本發明將利用克隆菌株與相應血清有無凝集反應這一情況來驗證重組質粒的表達情況。
[0020]本發明制備的能夠制備特異性沙門氏菌H:6診斷血清的工程菌株與現有技術相t匕，具有如下優點
1、可行性好:本發明利用實驗室最基本的分子生物學技術對傳統的多克隆抗體制備體系進行改造，通過做缺失，建克隆等途徑得到能夠有效表達鞭毛蛋白6的菌株，從而獲得特異性的沙門氏菌H: 6診斷血清，方法實用，可行；
2、實用性強:通過本發明制備特異性的沙門氏菌H:6診斷血清。和傳統方法相比減少了大量的吸收去除工作，更省時，且工作量降低，生產的血清特異性高，交叉少，大大降低了生產血清的成本；
3、靈活性好:利用本發明的技術能夠生產用傳統方法很難生產的血清，同時還可以構建一個包含若干種沙門氏菌的特異抗原庫。利用該抗原庫能夠建立包含多種沙門氏菌特異抗體的抗體庫，該抗體庫可補充現有抗血清種類，同時也可為其他免疫學技術的應用提供基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是本發明所使用的嗤囷體XRed重組系統的原理不意圖；
圖2是本發明基因缺失菌G4831 Δ fliC PCR篩選電泳結果圖；圖中M:DNA Marker (DL2000) ；U ddH20 control ;2、野生型 strain G4831 ;3_5、G4831 Δ fliCmutants ；
圖3是本發明fljB基因缺失菌G4831 Δ fliC Δ fljB PCR篩選電泳結果圖；圖中 M:DNA Marker (DL2000) ;1、ddH20 control ;2、野生型 strain G4831 ;3_5、G4831 Δ fliC Δ flJB mutants ；
圖4是本發明制備的沙門氏菌缺失菌株G4831 Δ fliC Δ fljB的fliC和fljB的缺失的遺傳穩定性鑒定，M:DNA Marker (DL2000) ;1 和 6、ddH20 control ；2 和 7、野生型 strainG4831 ；3-5>three generations of G4831 A fliC mutant ;8_10、three generations ofG4831 Δ fliC Δ flJB mutant ；
圖5是本發明構建的表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831 AfliCAflJB的生長曲
線.圖6是本發明中重組質粒pTrc99a-/7及(6)構建的流程圖；
圖7是本發明中構建的重組質粒pTrc99a-/7及(6)的物理圖譜；
圖8是對重組質粒的鑒定，其中:圖8A:是重組質粒pTrc99a-/7及(6)的酶切鑒定結果，圖中 M:DNA Marker (DL2000 Plus) ;1_3、pTrc99a-/7j^(6)/Nco I +BamHi 圖 8B:是重組質粒pTrc99a-/7及(6)的PCR鑒定結果，圖中M:DNA Marker (DL2000) ；UddH2O control ；2-4> PCR product of pTrc99a-/7JB(6)；
圖9為本發明野生型G4831與G4831 Δ fliC Δ fljB缺失菌動力板對比圖；
圖10為本發明G4831 Δ fliC Δ flJB缺失菌與所建克隆菌株G4831 Δ fliC Δ flJB(pTrc99a-/7j^(6))動力板對比圖。 【具體實施方式】
[0022]下面結合說明書附圖和具體實施例，進一步闡述本發明。應理解這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人,分子克隆:實驗室手冊(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件。本發明所用到的各種試劑均有市售。
[0023]本發明所用菌株編號和來源見下表:_
實驗室編號原編號中文名稱_來源
G48195010~倫敦沙門氏菌CMCC
G4831丨50752 |格?出浦沙門氏菌 |巧疋
本發明所用質粒來源見下表:
【權利要求】
1.一種能夠制備特異性沙門氏菌H:6診斷血清的工程菌株，其特征在于:它是將含有編碼鞭毛抗原6基因的重組質粒pTrC99a-/7及(6)，轉入表面鞭毛抗原合成基因缺失的沙門氏菌G4831 Δ fliC Δ fljB中得到的能夠有效表達鞭毛抗原6的工程菌株。
2.權利要求1所述的能夠制備特異性沙門氏菌H:6診斷血清的工程菌株，其特征在于:它是將基因用質粒pKD3上的氯霉素乙酰轉移酶基因替換，將fljB基因用質粒pKD4上的卡那霉素抗性基因替換，通過抗生素初步篩選出缺失菌株，再經過PCR鑒定及測序鑒定，得到相應的缺失菌株G4831 Δ fHC AfljB,然后再將構建的重組質粒pTrc99a_/7及(6)轉入其中，篩選得到能夠有效表達鞭毛抗原6的工程菌株。
3.權利要求2所述的能夠制備特異性沙門氏菌H:6診斷血清的工程菌株，其中所述一相鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831 缺失后基因大小為IlOObp (氯霉素乙酰轉移酶基因)，其序列為SEQ ID NO =10
4.權利要求2所述的能夠制備特異性沙門氏菌H:6診斷血清的工程菌株，其中所述二相鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831 ΛΛ/7及，缺失后基因大小仍為1500bp (卡那霉素抗性基因)，其序列為SEQ ID NO:2。
5.一種能夠制備特異性沙門氏菌H: 6診斷血清的工程菌的構建方法，其特征在于按如下步驟進行: (1)表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株(G4831及)的構建； (2)重組質粒pTrc99a-/7及(6)的構建； (3)含有重組質粒pTrc99a-/7及(6)的克隆菌株的構建。
【文檔編號】C12R1/42GK103468626SQ201310446593
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月27日 優先權日:2013年9月27日
【發明者】馮露, 蔣新蕾, 王磊 申請人:南開大學