一種沙門氏菌crispr分型方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種沙門氏菌的CRISPR分型方法，通過對(duì)沙門氏菌的CRISPR1位點(diǎn)和CRISPR2位點(diǎn)之間最新間隔序列的DNA測(cè)序，以確定待檢測(cè)菌株的CRISPR型別，進(jìn)而可以進(jìn)行血清型別的預(yù)測(cè)。所述方法簡(jiǎn)單，快速，費(fèi)用低，分辨率高，與沙門氏菌血清分型結(jié)果一致性高，對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備及軟件要求低，且新的CRISPR型別包含有細(xì)菌進(jìn)化及地域等諸多信息，并可聯(lián)合熒光探針等方法實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)快速檢測(cè)，具有推廣應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】—種沙門氏菌CRISPR分型方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種沙門氏菌分子分型方法，屬于分子流行病學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]沙門氏菌是一類危害人和動(dòng)物健康的重要致病菌，其菌屬型別繁多，抗原復(fù)雜，因此對(duì)沙門氏菌的防治造成了極大的困難。沙門氏菌的分子分型能對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷和溯源，在分子流行病學(xué)方面，這種便捷高效且高分辨率的分型方法對(duì)大規(guī)模的流行病檢測(cè)和沙門氏菌的進(jìn)化具有極其重要的意義；在臨床治療方面，由于沙門氏菌會(huì)在耐藥和毒力方面具有型別特異性，因此對(duì)其準(zhǔn)確的分型能在很大程度上對(duì)病情的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有一個(gè)提前的預(yù)見作用，且在臨床治療和用藥上也能提供一個(gè)可靠的依據(jù)。
[0003]此外，對(duì)于沙門氏菌的爆發(fā)監(jiān)測(cè)是疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)的重要任務(wù)之一，但目前的疾病控制機(jī)構(gòu)存在數(shù)量不足及高端分型設(shè)備不足等諸多問題。這種新型的分型方法由于原理簡(jiǎn)單、操作容易、成本低廉且對(duì)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備及技術(shù)人員的要求不高，因此能在更廣泛的范圍內(nèi)進(jìn)行疾病的監(jiān)測(cè)和預(yù)警，對(duì)我國(guó)的疾控事業(yè)將會(huì)起到一個(gè)有利的促進(jìn)作用。
[0004]沙門氏菌菌屬型別繁多，抗原復(fù)雜，目前已明確的血清型達(dá)2500多種，是引起食源性腹灣的重要病原菌之一；多為點(diǎn)序列分型(Multilocus Sequencing Typing,MLST)技術(shù)分辨率高、重復(fù)性好，但有時(shí)不穩(wěn)定；脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed Field GelElectrophoresis, PFGE)是細(xì)菌分型的金標(biāo)準(zhǔn)，其技術(shù)分辨率高，但比較費(fèi)時(shí)，且對(duì)儀器設(shè)備要求高，在圖像處理時(shí)主觀造成的偏差較難克服。
[0005]成族的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularlay interspaced shortpalindromic repeats, CRISPR)是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌針對(duì)卩遼菌體等外源DNA的獲得性免疫系統(tǒng)。CRISPR系統(tǒng)主要由CRISPR簇，前導(dǎo)序列(leader)和CRISPR相關(guān)蛋白基因(CRISPR-associated，cas)基因共同組成。CRISPR簇又由一段不連續(xù)的同向重復(fù)序列(direct repeat, DR)和插入其中的間隔序列(spacer)組成。DR序列在一個(gè)CRISPR簇中的大小和序列幾乎相同，其在沙門氏菌中的長(zhǎng)度基本為29bp。不同CRISPR系統(tǒng)中間隔序列(spacer)的長(zhǎng)度為17_84bp，而沙門氏菌中基本為32bp。研究表明，CRISPR的作用原理為:在噬菌體入侵宿主細(xì)胞后，CRISPR系統(tǒng)會(huì)從外來的噬菌體序列中選取一段序列加工成新的重復(fù)序列與間隔序列(repeat-spacer, R-S序列)后重組到CRISPR族內(nèi)，使得宿主獲得抵抗相應(yīng)噬菌體再次入侵的能力。這使得CRISPR系統(tǒng)具有了極其豐富的序列多態(tài)性。重要的是，這種CRISPR系統(tǒng)能作為一種記錄細(xì)菌與噬菌體相互斗爭(zhēng)的編年史被穩(wěn)定的遺傳下來，這不僅能在細(xì)菌的分子分型上開辟一個(gè)新的領(lǐng)域，還能為我們更好的研究細(xì)菌的進(jìn)化和遷徙史提供一條重要 的線索。
[0006]目前國(guó)內(nèi)外已有利用CRISPR進(jìn)行細(xì)菌分型的相關(guān)研究，但由于現(xiàn)存的CRISPR分型方法依據(jù)的是對(duì)全部CRISPR位點(diǎn)中所有的間隔序列(spacer)進(jìn)行測(cè)序分析后實(shí)現(xiàn)的，雖說分辨率極高，但這種分型方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力且建立相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)需要的信息量巨大。
[0007]研究發(fā)現(xiàn)，間隔序列在細(xì)菌進(jìn)化過程中存在插入和選擇剔除的現(xiàn)象，使得CRISPR結(jié)構(gòu)具有多態(tài)性，并且在同一物種的不同菌株間存在一定的差異。因此，CRISPR結(jié)構(gòu)可以作為細(xì)菌分型溯源與進(jìn)化研究的理想位點(diǎn)。目前關(guān)于沙門氏菌的CRISPR分型方法國(guó)外有4篇有文獻(xiàn)報(bào)道(1.Liu, et al.Appl Environ Microbiol77:4520-4526 ;2.Liu, F et al.ApplEnviron Microbiol77:1946-1956.3.Fabre, et al.PLoS 0ne7:e36995.4.Shariat, N.，etal..BMC Microbiol 13:254.)，但由于其分析對(duì)象為沙門氏菌兩個(gè)CRISPR位點(diǎn)的全部間隔序列(spacer)，甚至有些為了提高其分辨率，聯(lián)合兩個(gè)沙門氏菌毒力基因sseL和fimH，建立了 CRISPR-MLVA的多位點(diǎn)分型系統(tǒng)。但以上關(guān)于沙門氏菌的CRISPR分型方法仍具有諸多不足，比如分析的spacer數(shù)量繁多，且每個(gè)CRISPR結(jié)構(gòu)的spacer數(shù)量不等,這都不便于實(shí)驗(yàn)室快速的分子分型，具有耗時(shí)，不經(jīng)濟(jì)等缺點(diǎn)。
[0008]沙門氏菌病是感染性腹瀉的主要病原菌之一。世界衛(wèi)生組織證實(shí)沙門氏菌病是當(dāng)前重新出現(xiàn)的最重要的傳染性疾病之一。近年來，病原微生物的分子分型技術(shù)發(fā)展較快，如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (RAPD-PCR)、重復(fù)性核酸擴(kuò)增(Rep-PCR)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)、多位點(diǎn)序列分析(MLST)、多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)等，其中一些成熟的高通量且便于推廣應(yīng)用的分子分型技術(shù)，如PFGE、MLST, MLVA已經(jīng)應(yīng)用于傳染病爆發(fā)流行監(jiān)測(cè)，并在傳染源的追溯、傳播鏈的確認(rèn)、新的流行菌株的發(fā)現(xiàn)、遺傳變異、系統(tǒng)發(fā)生分析甚至于疫情的預(yù)警預(yù)報(bào)等方面發(fā)揮了重要作用。以上各種分型方法都有利有弊，RFLP方法重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便，但分辨率有限；AFLP方法分辨率高、重復(fù)性好，但技術(shù)難度也很高；RAPD-PCR和Rep-PCR分辨率高，但重復(fù)性差；PFGE技術(shù)分辨率高、重復(fù)性好，被譽(yù)為病原微生物分子分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其對(duì)專業(yè)設(shè) 備和軟件要求高，不適合基層疾控單位和設(shè)施較簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)室開展，而且通過分析電泳圖像帶有一定的主觀性，加之不可避免的手動(dòng)調(diào)圖也使得該方法不能很好地進(jìn)行高通量分析詮釋及數(shù)據(jù)交換。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明旨在建立一種十分簡(jiǎn)便的沙門氏菌的CRISPR分型方法。所述方法包括以下步驟:
[0010](I)提取待檢測(cè)菌株培養(yǎng)物的DNA ；
[0011](2)分別取適量的步驟(1)DNA提取物，進(jìn)行CRISPR1位點(diǎn)和CRISPR2位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增，其中CRISPR1位點(diǎn)擴(kuò)增的上游引物為SEQ ID NO:1，下游引物選自SEQ ID NO:2-7中的一種；CRISPR2位點(diǎn)擴(kuò)增的上游引物為SEQ ID NO:8，下游引物選自SEQ ID NO:9或SEQID NO:10 ；
[0012](3)分別對(duì)步驟⑵所述CRISPRl位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物和所述CRISPR2位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序；
[0013](4)確定CRISPR1位點(diǎn)序列和CRISPR2位點(diǎn)序列中的最新間隔序列，根據(jù)二者的間隔序列組合確定所述沙門氏菌的CRISPR型別。
[0014]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，步驟(2)所述的CRISPR1位點(diǎn)擴(kuò)增用的下游引物為 SEQ ID NO:2o
[0015]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，步驟(2)所述的CRISPR2位點(diǎn)擴(kuò)增用的下游引物為 SEQ ID NO:9。[0016]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，步驟(3)所述的DNA測(cè)序?yàn)榉聪蛞餃y(cè)序，所用引物為步驟⑵所述PCR擴(kuò)增的下游引物。
[0017]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，步驟⑷所述的最新間隔序列分別為CRISPR1位點(diǎn)和CRISPR2位點(diǎn)的最后兩個(gè)重復(fù)序列之間的序列。
[0018]如圖1所示，所述最新間隔序列(new spacer)為CRISPR位點(diǎn)最靠近前導(dǎo)序列(leader)的間隔序列，可運(yùn)用CRISPRdb網(wǎng)站中的CRISPRfinder功能進(jìn)行CRISPR結(jié)構(gòu)的整理(http: //crispr.u~psud.fr/crispr/),也可直接通過序列分析軟件DNAstar將最靠近下游引物的一個(gè)間隔序列直接找出。
[0019]優(yōu)選地，所述的最后兩個(gè)重復(fù)序列由SEQ ID NO:11所示。，通常CRISPR的第一個(gè)重復(fù)序列為SEQ ID NO: 12所示，其余重復(fù)序列為SEQ ID NO:11所示，而最后兩個(gè)重復(fù)序列之間的間隔序列即為最新的間隔序列(有關(guān)重復(fù)序列的類型可見巴斯德數(shù)據(jù)庫(kù)http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/crispr/CRISPRDB.html)。
[0020]可將找出的CRISPRl位點(diǎn)和CRISPR2位點(diǎn)中的最新間隔序列在間隔序列代碼表(來自巴斯德數(shù)據(jù)庫(kù) http: / / www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/crispr/CRISPRDB.html)中轉(zhuǎn)化為spacer代碼。隨后將兩個(gè)間隔序列代碼按照CRISPR1在前，CRISPR2在后的順序組成一個(gè)間隔序列組合，并以此代表改型沙門菌的CRISPR型別。
[0021]本發(fā)明方法還可以包括步驟(5)，即，通過待檢測(cè)菌株的CRISPR型別確定所述菌株的血清型(CRISPR型別-血清型預(yù)測(cè)表可見表1)，實(shí)現(xiàn)對(duì)其血清型的預(yù)測(cè)。
[0022]本發(fā)明方法省時(shí)，經(jīng)濟(jì)，分辨率高，易于操作，且與沙門氏菌血清分型一致度高，對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備及軟件要求低，可聯(lián)合熒光探針等實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)快速的檢測(cè)，且能通過最新間隔序列的報(bào)告探針實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。在分辨率方面較依靠七個(gè)管家基因的多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing,MLST)略高,但花費(fèi)卻僅有傳統(tǒng)MLST的四分之一(僅需兩個(gè)短序列的測(cè)序)。
[0023]對(duì)于沙門氏菌的爆發(fā)監(jiān)測(cè)是疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)的重要任務(wù)之一，但目前的疾病控制機(jī)構(gòu)存在數(shù)量不足及高端分型設(shè)備不足等諸多問題。這種新型的分型方法由于原理簡(jiǎn)單、操作容易、成本低廉且對(duì)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備及技術(shù)人員的要求不高，因此能在更廣泛的范圍內(nèi)進(jìn)行疾病的監(jiān)測(cè)和預(yù)警，對(duì)我國(guó)的疾控事業(yè)將會(huì)起到一個(gè)有利的促進(jìn)作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1.沙門氏菌的CRISPR分型示意圖；
[0025]圖2.沙門氏菌CRISPR的PCR擴(kuò)增電泳圖譜；
[0026]圖3.沙門氏菌血清型分型和CRISPR分型的一致性分析圖；
[0027]圖4A.沙門氏菌PFGE圖譜；
[0028]圖4B.沙門氏菌PFGE圖譜；
[0029]圖5A.MLST分型分辨率示意圖；
[0030]圖5B.CRISPR分型分辨率示意圖； [0031 ]圖5C.PFGE分型分辨率示意圖。
【具體實(shí)施方式】[0032]下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求所定義的保護(hù)范圍構(gòu)成任何限制。
[0033]實(shí)施例1:82株沙門氏菌的分子分型及血清型預(yù)測(cè)
[0034]1.菌株:
[0035]此次試驗(yàn)選取的菌株為我中心保存的來自我國(guó)多個(gè)地區(qū)82株沙門氏菌，已完成傳統(tǒng)血清學(xué)鑒定，確定為沙門氏菌，并分屬21種血清型(82株菌傳統(tǒng)血清學(xué)分型結(jié)果見表2)。
[0036]2.引物合成:選用引物表中擴(kuò)增范圍最廣的兩對(duì)引物Al，A2和BI，B2
[0037]Al(5/ -GTRGTRCGGATAATGCTGCC-3')
[0038]A2(5/ -CGTATTCCGGTAGATBTDGATGG-3')
[0039]BI (5' -GAGCAATACYYTRATCGTTAACGCC-3')
[0040]B2(5/ -GTTGCDATAKGTYGRTRGRATGTRG-3')
[0041]由上海生工公司合成(Sangon Biotech) [0042]3.細(xì)菌基因組DNA提取:
[0043]細(xì)菌基因組DNA的抽提使用天根公司(Tiangen Biotech)的細(xì)菌DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)，按說明書操作。提取的DNA于_20°C保存。
[0044]4.PCR 擴(kuò)增 CRISPR 位點(diǎn):
[0045]PCR反應(yīng)體系:
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種沙門氏菌的CRISPR分型方法，所述方法包括以下步驟: (1)提取待檢測(cè)菌株培養(yǎng)物的DNA； (2)分別取適量的步驟⑴DNA提取物，進(jìn)行CRISPR1位點(diǎn)和CRISPR2位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增，其中CRISPR1位點(diǎn)擴(kuò)增的上游引物為SEQ ID NO:1，下游引物選自SEQ ID NO:2_7中的一種；CRISPR2位點(diǎn)擴(kuò)增的上游引物為SEQ ID NO:8，下游引物選自SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:10 ； (3)分別對(duì)步驟(2)所述CRISPR1位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物和所述CRISPR2位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物； (4)確定CRISPR1位點(diǎn)序列和CRISPR2位點(diǎn)序列中的最新間隔序列，根據(jù)二者的間隔序列組合確定所述沙門氏菌的CRISPR型別。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的CRISPR1位點(diǎn)擴(kuò)增用的下游引物為SEQ ID NO:2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的CRISPR2位點(diǎn)擴(kuò)增用的下游引物為SEQ ID NO:9。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述的DNA測(cè)序?yàn)榉聪蛞餃y(cè)序，所用引物為步驟⑵所述PCR擴(kuò)增的下游引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述的最新間隔序列分別為CRISPR1位點(diǎn)和CRISPR2位點(diǎn)的最后兩個(gè)重復(fù)序列之間的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的最后兩個(gè)重復(fù)序列由SEQID NO:11所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟(5):通過待檢測(cè)菌株的CRISPR型別確定所述菌株的血清型。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103981256SQ201410147709
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年4月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月15日
【發(fā)明者】宋宏彬, 邱少富, 李 浩, 李鵬, 易勝杰, 謝靖, 吳志豪, 郝榮章, 王立貴, 柳楠, 楊超杰 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍疾病預(yù)防控制所