嘌呤核苷磷酸化酶及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及嘌呤核苷磷酸化酶及其制備方法，具體地公開了一種突變的假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶，與野生型的氨基酸序列相比，所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中第97位Asp突變為Tyr。本發明還公開了該酶的制備方法，本發明的制備嘌呤核苷磷酸化酶具有產量高且熱穩定性好的特點。本發明還公開了編碼該嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列的多核苷酸，含有該多核苷酸的載體和宿主細胞。
【專利說明】嘌呤核苷磷酸化酶及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程領域，具體地涉及一種嘌呤核苷磷酸化酶及其制備方法。
【背景技術】
[0002]嘌呤核苷憐酸化酶(purine nucleoside phosphorylase),簡稱PNP,是嘌呤補救合成途徑的關鍵酶之一，廣泛存在于哺乳動物、寄生蟲和微生物中。按照嘌呤核苷磷酸化酶的蛋白結構可分為兩類:低分子量的同源三聚體類和高分子量的同源六聚體類。其中哺乳動物和部分微生物(例如鼠傷寒沙門氏菌salmonella typhimurium,嗜熱古菌芝田硫化葉菌Sulfolobus solfataricus等)的嘌呤核苷磷酸化酶屬于同源三聚體類,其分子量約為80~IOOkDa,每個亞基的分子量為30~32kDa，通常此類嘌呤核苷磷酸化酶只能以鳥嘌呤核苷和肌苷作為底物。而同源六聚體類的嘌呤核苷磷酸化酶，底物專一性不強，既可接受鳥嘌呤核苷和肌苷作為底物，也可以腺嘌呤核苷作為底物。其分子量約為150kDa，亞基分子量為25kDa左右。
[0003]由于PNP特殊的生物活性，使得其在醫藥領域得到了較大的應用:①應用于核苷類藥物的合成，大量研究表明，核苷類(核苷及其類似物)具有廣泛的抗腫瘤抗病毒的效果。②應用于腫瘤靶向治療；③應用于無機磷和ATPase酶活力等的定量測定。
[0004]鑒于PNP的廣泛應用前景，近年來，關于PNP的基因工程研究越來越多，但多以大腸桿菌PNP和嗜熱菌PNP為主。而本發明選取克隆假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)的PNP，簡稱為PiPNP，其相對于其他菌屬的PNP有著一個顯著的優點，即該酶在低溫(小于400C )下的即有較高的催化效率，研究發現，在體外，催化低濃度或高濃度的肌苷反應時，PiPNP的最適溫度為30— 35°C或50— 60°C，明顯低于其他菌屬的PNP (例如大腸桿菌PNP催化低濃度或高濃度的肌苷反應最適溫度分別為50°C或60-70°C)，這就使得在常規反應溫度下(37°C )，PiPNP使用較少的量就可獲得較高的催化效率。但PiPNP相較于其他菌屬的PNP也存在其缺陷——溫度穩定性較低，將PiPNP保溫30min，在37-42°C時酶活發生急劇變化，50°C完全失活，EcPNP在50-55°C發生急劇變化，65°C時完全喪失失活。
[0005]另外，據已報道的各方面研究，重組菌發酵生產的PNP產量仍較低，多為100~200U/ml，對于工業化生產而言，仍不能達到很好的效果，產量有待提高。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在于提供一種經過分子改造并具有較高熱穩定性的嘌呤核苷磷酸化酶，以及高產量的制備該嘌呤核苷磷酸化酶的方法。
[0007]本發明第一方面提供了一種突變的假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶，與野生型的氨基酸序列相比，所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中第97位Asp突變為Tyr0
[0008]在另一優選例中，所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶具有以下一種或多種特性:
[0009](a)比酶活≥30U/mg,較佳地為≥45U/mg ；[0010](b)儲存在堿性環境中；
[0011](C)失活溫度<60°C ;
[0012](d)在O — 55°C，保存時間汕。
[0013]在另一優選例中，所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶的最適PH值為7.0-9.0，較佳地為7.5-8.5，更佳地為8.0。
[0014]在另一優選例中，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0015]本發明第二方面提供了一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼第一方面所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶。
[0016]在另一優選例中，所述多核苷酸序列中編碼氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45的密碼子AGG、CTA、CTA、ΑΤΑ、CTA和CTA中的一個或多個密碼子被替換為大腸桿菌相對應的偏愛密碼子。
[0017]在另一優選例中，所述多核苷酸序列中編碼氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45的密碼子AGG、CTA、CTA、ΑΤΑ、CTA和CTA中的一個或多個密碼子被替換為CGA、CTG、CTG、ATC、CTG 和 CTG。
[0018]在另一優選例中，所述多核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0019]本發明第三方面提供了一種載體，所述載體含有第二方面所述的多核苷酸。
[0020]在另一優選例中，所述載體為表達載體,更佳地為適合在大腸桿菌中表達的表達載體。
[0021]本發明第四方面提供了一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞包含第三方面所述的載體或基因組中整合有第二方面所述的多核苷酸。
[0022]在另一優選例中，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞。
[0023]在另一優選例中，所述宿主細胞為大腸桿菌(E.coli)細胞。
[0024]本發明第五方面提供一種第一方面所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶的制備方法，包括以下步驟:
[0025](a)在適合表達的條件下，培養第四方面所述的宿主細胞，從而表達出第一方面所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶；
[0026](b)分離所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶。
[0027]在另一優選例中，所述的宿主細胞為大腸桿菌。
[0028]在另一優選例中，在步驟(a)之前，所述方法還包括以下步驟:
[0029](I)提供一假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；
[0030](2)將所述多核苷酸序列中對應于野生型假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中的第97位Asp的密碼子突變為編碼Tyr的密碼子，并且任選地，將所述多核苷酸序列中編碼氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45中的一個或多個密碼子AGG、CTA、CTA、ATA、CTA和CTA替換為大腸桿菌相對應的偏愛密碼子，從而制得編碼第一方面所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；
[0031](3)將上一步驟制得的所述多核苷酸序列導入宿主細胞，從而制得第四方面所述的宿主細胞。
[0032]在另一優選例中，步驟(I)中的多核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0033]在另一優選例中，所述野生型或野生型的酶是來自假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)的嘌呤核苷憐酸化酶。
[0034]在另一優選例中，將第97位Asp的密碼子GAC突變為編碼Tyr的密碼子TAT。
[0035]在另一優選例中，將所述密碼子AGG、CTA、CTA、ATA、CTA和CTA替換為CGA、CTG、CTG, ATC, CTG 和 CTG。
[0036]在另一優選例中，所述方法獲得的突變的嘌呤核苷磷酸化酶的表達活性> 300U/ml，較佳地為 350 - 450U/ml。
[0037]本發明第六方面提供了一種改造嘌呤核苷磷酸化酶的方法，所述方法包括步驟:
[0038](I)提供一假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；
[0039](2)將所述多核苷酸序列中對應于野生型假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中的第97位Asp的密碼子突變為編碼Tyr的密碼子，從而制得編碼突變的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；
[0040](3)表達上一步驟制得的所述多核苷酸序列，從而制得突變的嘌呤核苷磷酸化酶。
[0041]在另一優選例中，所述方法用于提高嘌呤核苷磷酸化酶的穩定性。
[0042]在另一優選例中，步驟(I)中的多核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0043]本發明第七方面提供了一種第一方面所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶的用途，其特征在于，用于催化肌苷進行磷酸解反應；或用作對肌苷進行磷酸解反應的催化劑。
[0044]本發明第八方面提供了一種催化反應，包括步驟:在第一方面所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶或第四方面所述的宿主細胞存在下，對肌苷進行酶催化反應(磷酸解反應)，生成次黃嘌呤。
[0045]本發明第九方面提供了一種酶制劑，所述的酶制劑含有第一方面所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶。
[0046]在另一優選例中,所述的酶制劑為固定化酶。
[0047]應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0048]圖1 為 PNP (O) -pET-28a (+)的質粒圖譜。
[0049]圖2A為PCR擴增的目的條帶電泳圖。
[0050]圖2B為PNP(0)-pET_28a(+)篩選陽性克隆電泳圖
[0051]圖3為pMD19-T載體的結構示意圖。
[0052]圖4為密碼子優化的工程菌PNP (O) -pET-28a (+) -BL21與未優化的工程菌PNP-pET-28a (+) -BL21 發酵液 SDS-PAGE 圖。
[0053]圖5為密碼子優化的工程菌PNP (O) -pET-28a (+) -BL21與未優化的工程菌PNP-pET-28a (+) -BL21的分泌表達產量對比數據圖。
[0054]圖6為將Ile87的密碼子改為ATT與改為ATC的工程菌之間表達活性的對比數據圖。
[0055]圖7為PiPNP與rPiPNP的酶保留活力隨溫度變化圖。
[0056]圖8為PiPNP與rPiPNP的酶保留活力隨時間變化圖?！揪唧w實施方式】
[0057]發明人經過廣泛深入的研究，意外地發現，通過將來自假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)的嘌呤核苷磷酸化酶PNP基因序列中編碼Asp97的密碼子GAC改為編碼Tyr的密碼子TAT，所制得的突變酶具有明顯提高的熱穩定性。此外，通過將PNP基因序列中分別編碼氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45的密碼子AGG、CTA、CTA、ATA、CTA和CTA改為CGA、CTG、CTG、ATC、CTG和CTG后，經過基因工程制備方法可進一步顯著提高PNP的產量。在此基礎上完成了本發明。
[0058]如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
[0059]本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
[0060]本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序列的蛋白質片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼本發明酶的功能。
[0061]如本文所用，術語“引物”指的是在與模板配對，在DNA聚合酶的作用下能以其為起點進行合成與模板互補的DNA鏈的寡居核苷酸的總稱。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)與模板上一條鏈上的一個特殊的序列互補。引物必須與模板上的一條鏈充分互補才能開始延伸，但引物的序列不必與模板的序列完全互補。比如，在一個3’端與模板互補的引物的5’端加上一段與模板不互補的序列，這樣的引物仍大致上與模板互補。只要有足夠長的引物能與模板充分的結合，非完全互補的引物也可以與模板形成引物-模板復合物，從而進行擴增。
[0062]本發明的酶的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據已公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0063]一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
[0064]此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
[0065]應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法被優選用于獲得本發明的基因。用于PCR的引物可根據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，并可用常規方法合成?？捎贸Ｒ幏椒ㄈ缤ㄟ^凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段 。
[0066]本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述酶的方法。
[0067]通過常規的重組DNA技術，可利用本發明的多核苷酸序列來表達或生產嘌呤核苷磷酸化酶。一般來說有以下步驟:
[0068](1).用本發明的編碼本發明蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；
[0069](2).在合適的培養基中培養宿主細胞；
[0070](3).從培養基或細胞中分離、純化嘌呤核苷磷酸化酶。
[0071]本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含本發明酶的編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
[0072]此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性。
[0073]包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
[0074]宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有:大腸桿菌，枯草芽胞桿菌，鏈霉菌屬的細菌細胞；真菌細胞如畢赤酵母、釀酒酵母細胞；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CH0、NS0,C0S7、或293細胞的動物細胞等。相應地，也可以將來源于假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列中分別編碼氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45的密碼子替換為上述宿主細胞偏愛的密碼子。
[0075]用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法:磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
[0076]獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的蛋白質。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
[0077]在上面的方法中的蛋白質可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于:常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
[0078]本發明包括以下主要優點:
[0079](I)本發明的嘌呤核苷磷酸化酶具有較高熱穩定性，酶失活溫度可提高至60°C以上，并且在O — 55°C，酶的保存時間延長至3h以上。[0080](2)本發明的嘌呤核苷磷酸化酶熱穩定性提高的同時，還保持較高的酶活性。
[0081](3)本發明的制備方法極大地提高了嘌呤核苷磷酸化酶的產量，產品的表達活性可以達到或超過400U/mL，這是目前的基因工程制備方法所無法企及的。從而有利于大規模工業化生產。
[0082]本發明提到的上述特征，或實施例提到的特征可以任意組合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何被提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。
[0083]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。
[0084]除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0085]本發明實施例中的實驗材料的來源如下所示:
[0086]pET_28a (+)購于 Novagen 公司
[0087]pMD19_T Simple Vector 購于 TaKaRa 公司
[0088]Solution I 購于 TaKaRa 公司
[0089]T4DNA連接酶購于TaKaRa公司
[0090]10*T4DNA連接酶緩沖液購于TaKaRa公司
[0091]胰蛋白胨購于上海源聚生物科技有限公司
[0092]酵母粉購于安琪酵母股份有限公司
[0093]NaCl購于國藥集團化學試劑有限公司
[0094]實施例1假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)PNP基因序列的優化及克隆載體的構建
[0095]①基因序列的優化
[0096]基因序列的優化是將Pseudoalteromonas sp.1590的PNP基因序列(GEN BANKEF222283，SEQ ID N0.3)進行了部分分子改造，分為兩項:一是將整條序列中的編碼氨基酸的 Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34、Leul45 的密碼子 AGG、CTA、CTA、ATA、CTA、CTA 改為CGA、CTG、CTG、ATC、CTG、CTG ;二是將97位Asp改造為Tyr，密碼子由GAC改為TAT。優化后的基因序列進行全基因合成。
[0097] 全基因合成:
[0098]委托上海生工合成。首先從NCBI數據庫中獲得Pseudoalteromonas sp.1590的野生型的PNP基因序列，并第97位氨基酸殘基的密碼子從Asp97改為Tyr。此外，本發明人為了在大腸桿菌中實現高效表達，對基因序列進行了優化，其中主要對六處密碼子替換為大腸桿菌偏愛密碼子(即將Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45的密碼子AGG、CTA、CTA、ATA、CTA和CTA中的六個密碼子被替換為CGA、CTG、CTG、ATC、CTG和CTG)。所述序列的全合成采用人工合成法進行合成。
[0099]人工合成是將所要合成的寡聚核苷酸鏈的3’ -末端先以3’ -OH與一個不溶性載體連接，然后依次從3’-5’的方向將核苷酸單體加上去，所使用的核苷酸單體的活性官能團都是經過保護的，在添加到核苷酸鏈上時，去除3’端的保護，而后再釋放5’端用以連接下一個核苷酸單體。
[0100]②引物的設計
[0101]根據上述優化后的基因序列和pET_28a ( + )(購于Novagen公司)的酶切位點,利用Primerf.0引物設計軟件進行引物的設計:
[0102]上游引物(引物I) 5，-ctagctagcatgcgaactccgcatatcaatg-3’ (SEQ ID N0.4)
[0103]下游引物(引物2)5，_ccgctcgagttagatagactctaatgcaattttaac_3 (SEQ ID N0.5)
[0104]③基因的擴增
[0105]以化學合成的全基因產物為模板，在DNA Taq酶的催化下進行PCR反應。反應體系及反應條件分別如表1和表2所示:
[0106]表1反應體系
[0107]
【權利要求】
1.一種突變的假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶，其特征在于，與野生型的氨基酸序列相比，所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中第97位Asp突變為Tyr。
2.如權利要求1所述的嘌呤核苷磷酸化酶，其特征在于，所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶具有以下一種或多種特性: (a)比酶活≥30U/mg，較佳地為≥45U/mg； (b)儲存在堿性環境中； (c)失活溫度≥600C ； (d)在O— 55°C，保存時間≥3h。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸編碼權利要求1所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶。
4.一種載體，其特征在于，所述載體含有權利要求3所述的多核苷酸。
5.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞包含權利要求4所述的載體或基因組中整合有權利要求3所述的多核苷酸。
6.如權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為大腸桿菌(E.coli)細胞。
7.—種權利要求1所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (a)在適合表達的條件下，培養權利要求5所述的宿主細胞，從而表達出權利要求1所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶； (b)分離所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶。
8.如權利要求7所述的制備方法，其特征在于，在步驟(a)之前，所述方法還包括以下步驟: (1)提供一假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列； (2)將所述多核苷酸序列中對應于野生型假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中的第97位Asp的密碼子突變為編碼Tyr的密碼子，并且任選地，將所述多核苷酸序列中編碼氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45中的一個或多個密碼子AGG、CTA、CTA、ATA、CTA和CTA替換為大腸桿菌相對應的偏愛密碼子，從而制得編碼權利要求I所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列； (3)將上一步驟制得的所述多核苷酸序列導入宿主細胞，從而制得權利要求5所述的宿主細胞。
9.一種改造嘌呤核苷磷酸化酶的方法，其特征在于，所述方法包括步驟: (1)提供一假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列； (2)將所述多核苷酸序列中對應于野生型假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中的第97位Asp的密碼子突變為編碼Tyr的密碼子，從而制得編碼突變的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列； (3)表達上一步驟制得的所述多核苷酸序列，從而制得突變的嘌呤核苷磷酸化酶。
10.一種權利要求1所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶的用途，其特征在于，用于催化肌苷進行磷酸解反應；或用作對肌苷進行磷酸解反應的催化劑。
【文檔編號】C12N15/70GK103468656SQ201310451323
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月27日 優先權日:2013年9月27日
【發明者】李子樵, 沈露 申請人:上海藍怡科技有限公司