毛乳頭細胞的培養方法
【專利摘要】本發明公開了一種毛乳頭(DP)細胞的培養方法，該培養方法能夠長期培養DP細胞，并成功應用于DP細胞建系。
【專利說明】毛乳頭細胞的培養方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體而言，涉及一種毛乳頭細胞的培養方法。
【背景技術】
[0002]毛發在皮膚特定部位具有相應的密度及形態，它對人體具有防御、保護功能外，還具有增加信息交流和美觀的作用。毛發由毛囊生成，毛囊具有周期性再生的特性，即經歷生長期、退化期、靜止期的循環。其中，由靜止期向生長期的轉換，即生長期啟動為最關鍵的環節。當毛囊的周期性再生功能發生障礙時，就會出現脫發、斑禿等毛囊相關疾病。隨著社會發展，人們對具有保護與美觀作用的毛發越來越重視，對毛囊周期性再生的研究將顯得越來越重要。
[0003]由于毛囊具有周期性生長的特性，為組織再生研究提供了一個非常好的模型。毛囊的周期性生長由毛囊干細胞介導發生，和其他干細胞一樣，毛囊干細胞的靜息與活化受到干細胞微環境的調控。毛囊干細胞位于毛囊隆突區，人們對影響毛囊干細胞自我更新和分化的微環境因素了解的還不多。
[0004]特別引人注意的是，在毛囊干細胞的周期性活動過程中，毛乳頭(dermalpapilla,DP)居于非常特殊的地位。DP是真皮中的一群特化的間充質來源的細胞。大量研究表明:出生后的每一個毛囊周期中DP和毛囊干細胞均會發生定期的，規律性的接觸，而這種接觸在靜止期末或生長期啟動時最為緊密，說明DP細胞可能為毛囊干細胞提供微環境支持，并在毛囊周期性再生的起始階段發揮作用?；蚯贸芯堪l現，DP缺失，不能形成完整的毛囊2 ;隨后又發現，DP是一個分泌因子的中心，可以生成大量的信號分子；最近的研究表明，這些信號分子所激活的信號通路是毛囊周期性生長的重要調控因素，它們在毛囊生長的不同時期發揮著不同的調節作用。
[0005]已有報道，將DP細胞制成微囊能夠誘導大鼠耳毛囊再生，并有將人DP細胞條件培養液用于斑禿治療的臨床試驗報道。這些應用都需要大量的DP細胞，因此，DP細胞的大量培養是毛囊周期相關疾病治療需要解決的關鍵技術之一。不少學者嘗試進行DP細胞原代培養，發現隨著DP細胞培養代數的增加，其生物學活性快速改變；當傳代至第6代時，細胞喪失誘導毛囊生長的特性。
[0006]可見，DP細胞在毛囊周期中具有極其重要的作用。因此，獲取大量的DP細胞就成為治療毛囊周期障礙相關疾病的重要條件。

【發明內容】

[0007]本發明的目的是提供一種毛乳頭(DP)細胞的培養方法，該培養體系能夠長期培養DP細胞，并成功應用于DP細胞建系。
[0008]本發明一方面涉及一種毛乳頭細胞的培養方法，其特征在于包括如下步驟:
[0009]配制溶液:L 0.25% Dispase(中性蛋白酶,也稱為分散酶)溶液的配制:準確稱取0.25g Dispase酶粉末，加入100ml0.01M PBS溶液，完全溶解后抽濾分裝，4°C或_20°C保存；
[0010]2.2mg / ml 膠原酶的配制:用 TESCA 緩沖液(50mM TES, 0.36mM CaCl2, ρΗ7.4)在37°C配制，配好后-20°C分裝保存；
[0011]3.DP培養基的配制:a-MEM基礎培養基，加入10%胎牛血清，100X丙酮酸鈉，100Χ非必需氨基酸，1000Χ青鏈霉素，IOng / ml bFGF ；
[0012]培養過程:
[0013]1.取新生8~9d健康C57小鼠I只，頸椎脫臼處死，酒精棉球消毒觸須部位；眼科剪垂直皮膚剪下大鼠兩邊觸須皮膚，放入裝有D-Hank’s液的培養皿中；用鑷子夾著皮膚清洗，吸去多余D-Hank’s液；
[0014]2.解剖顯微鏡下用27號針頭將毛囊連同結締組織鞘一起分出來，并轉移到另一個裝有D-Hank’s培養基的培養皿中；
[0015]3.分離完畢后，在超凈臺中用吸管將D-Hank’s液吸干，加入質量分數為0.25%的Dispase,20min(10_30min)；
[0016]4.消化完成后，將毛囊轉移到大的培養皿中，加入D-Hank’s液將Dispase稀釋(少量多次)，手術顯微鏡下將毛囊從真皮鞘中分離出來
[0017]5.在手術顯微鏡下分離毛乳頭，收集移入離心管；
[0018]6.向離心管中加入0.2%`膠原酶，37°C消化5-6小時；
[0019]7.消化5-6小時后，離心管中加入DMEM培養基終止消化，吹打，離心lOOOrpm，3min ；
[0020]8.棄上清，細胞用DP培養基重懸，于6孔板中培養，培養4d后觀察，常規方法傳代；
[0021]9.細胞傳至第15代及以上時，收集細胞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1:免疫熒光鑒定傳代15代的原代培養的DP細胞的熒光顯微鏡照片。
【具體實施方式】
[0023]一、DP細胞培養體系的建立
[0024](一)1型膠原的包被
[0025]1.配制0.01mol / L的HCl, PBS,高壓滅菌后備用；
[0026]2.稀釋膠原:用0.01mol / L的HCl將I型膠原稀釋成50 μ g / ml
[0027]3.包被:六孔板每孔加入2ml (終濃度10 μ g / cm2)；
[0028]4.室溫放置Ih
[0029]5.吸掉上清
[0030]6.PBS清洗包被板3次
[0031]7.包被板置于4°C備用(可保存I周)
[0032](二)常用試劑的配制
[0033]1.0.25% Dispase(中性蛋白酶，也稱為分散酶)溶液的配制:準確稱取0.25gDispase酶粉末，加入100ml0.01M PBS溶液，完全溶解后抽濾分裝，4°C或_20°C保存。[0034]2.2mg / ml 膠原酶的配制:用 TESCA 緩沖液(50mM TES，0.36mM CaCl2, ρΗ7.4)在37°C配制，配好后-20°C分裝保存
[0035]3.DP培養基的配制:a-MEM基礎培養基，加入10%胎牛血清，100Χ丙酮酸鈉，100Χ非必需氨基酸，1000Χ青鏈霉素，IOng / ml bFGF。
[0036](三)實驗步驟
[0037]1.取新生8~9d健康C57小鼠I只，頸椎脫臼處死，酒精棉球消毒觸須部位。眼科剪垂直皮膚剪下大鼠兩邊觸須皮膚，放入裝有D-Hank’s液的培養皿中。用鑷子夾著皮膚稍做清洗，吸去多余D-Hank’s液；
[0038]2.解剖顯微鏡下(X3.2)用27號針頭將毛囊連同結締組織鞘一起分出來，并轉移到另一個裝有D-Hank’s培養基的培養皿中；
[0039]3.分離完畢后，在超凈臺中用吸管將D-Hank’s液吸干，加入質量分數為0.25%的Dispase,20min(10_30min)；
[0040]4.消化完成后，將毛囊轉移到大的培養皿中，加入D-Hank’s液將Dispase稀釋(少量多次)，手術顯微鏡下將毛囊從真皮鞘中分離出來
[0041]5.在手術顯微鏡下分離毛乳頭，收集移入離心管；
[0042]6.向離心管中加入0.2%膠原酶，37°C消化5-6小時；
[0043]7.消化5-6小時后，離心管中加入DMEM培養基終止消化，吹打，離心lOOOrpm，3min ；
`[0044]8.棄上清，細胞用DP培養基重懸，于6孔板中培養，培養4d后觀察，常規方法傳代；
[0045]9.細胞傳至第15代及以上時，收集細胞。
[0046]10.傳代至第15代時，用建立的培養體系培養的DP細胞仍表達DP細胞特異性標記物FGF7和a-SMA進行鑒定，鑒定結果顯示(如圖1所示)所建立的DP細胞培養體系，培養DP細胞15代后，細胞仍保持原代細胞特性，實驗進一步證實其仍具有誘導毛囊生長的特性。因此，利用該方法可以獲取足量的DP細胞，用于科學研究和臨床治療。所建立的DP細胞株，具有與原代DP細胞相同的基因表達模式。因此，除用于科學研究和臨床治療外，還可用于大規模的中試研究。
[0047]以上所述是本發明的優選實施例，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明所述原理的前提下，還可以作出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種毛乳頭細胞的培養方法，其特征在于包括如下步驟: 配制溶液: 0.25% Dispase (中性蛋白酶,也稱為分散酶)溶液的配制:準確稱取0.25g Dispase酶粉末，加入100ml0.01M PBS溶液，完全溶解后抽濾分裝，4°C或_20°C保存； 2mg / ml 膠原酶的配制:用 TESCA 緩沖液(50mM TES, 0.36mM CaCl2, pH7.4)在 37。。配制，配好后_20°C分裝保存； DP培養基的配制:a-MEM基礎培養基，加入10%胎牛血清，100Χ丙酮酸鈉，100Χ非必需氨基酸，1000Χ青鏈霉素，IOng / ml bFGF ； 培養過程: 1)取新生8~9d健康C57小鼠I只，頸椎脫臼處死，酒精棉球消毒觸須部位；眼科剪垂直皮膚剪下大鼠兩邊觸須皮膚，放入裝有D-Hank’ s液的培養皿中；用鑷子夾著皮膚清洗，吸去多余D-Hank’s液； 2)解剖顯微鏡下(X3.2)用27號針頭將毛囊連同結締組織鞘一起分出來，并轉移到另一個裝有D-Hank’s培養基的培養皿中； 3)分離完畢后，在超凈臺中用吸管將D-Hank’s液吸干，加入質量分數為0.25 %的Dispase,室溫消化 10_30min,優選 20min ； 4)消化完成后，將毛囊轉移到大的培養皿中，加入D-Hank’s液將Dispase稀釋，手術顯微鏡下將毛囊從真皮鞘中分離出來； 5)在手術顯微鏡下分離毛乳頭，收集移入離心管； 6)向離心管中加入0.2%膠原酶，37°C消化5-6小時； 7)消化5-6小時后，離心管中加入DMEM培養基終止消化，吹打，離心lOOOrpm，3min； 8)棄上清，細胞用DP培養基重懸，于6孔板中培養，培養4d后觀察，常規方法傳代； 9)細胞傳至第15代及以上時，收集細胞。
2.權利要求1所述的培養方法所構建的毛乳頭細胞系。
【文檔編號】C12N5/071GK103497930SQ201310451331
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月29日 優先權日:2013年9月29日
【發明者】李玉紅 申請人:李玉紅