一種環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)菌株及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)菌株，該菌株發(fā)酵得到的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用于不同濃度的L-抗壞血酸和β-環(huán)糊精，在pH5.0～6.0、25～40℃條件下，可以高效產(chǎn)生2-氧-α-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸。利用本發(fā)明菌株發(fā)酵得到的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)2-氧-α-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸生產(chǎn)方法簡單、轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)量高優(yōu)點，利于工業(yè)化放大生產(chǎn)。
【專利說明】一種環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)菌株及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)菌株，該菌株發(fā)酵所得環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶可用于高效生產(chǎn)2-氧- a -D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸，屬于酶工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]抗壞血酸(Ascorbic acid)即維生素C,簡稱VC,是一種人體自身不能合成的水溶性維生素，參與體內(nèi)很多的生理活動，在維持和促進人體健康中扮演著重要的角色。然而，VC分子二位上的羥基極不穩(wěn)定，受氧、水、光、高溫、重金屬離子的影響而氧化降解，因此，上世紀以來，開發(fā)穩(wěn)定的VC衍生物成為研究的熱點，研究者試圖尋找一種VC衍生物，既能保證VC正常生理功能又能有較好的穩(wěn)定性。如VC的金屬鹽衍生物及VC的酯類衍生物，但出于安全方面考慮，這些衍生物的應用范圍較窄。此外，VC的糖類衍生物因其儲存穩(wěn)定，安全環(huán)保而成為VC的最佳替代品。常見的VC糖類衍生物主要有2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸(AA-2G)、5-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸(AA-5G)、6-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸(AA-6G)，雖然AA-5G與AA-6G與VC相比具有具有較好的穩(wěn)定性，但是與AA-2G相比具有直接的還原性。因此AA-2G的合成及應用有效的解決了當前VC在使用和儲存中易氧化的問題。
[0003]AA-2G的結(jié)構(gòu)特征決定了其具有以下特點和功能:1)、AA-2G具有具有良好的非還原活性，在水溶液中特別穩(wěn)定；2)、AA-2G具有良好的耐光性和耐熱性，在100°C條件下放置30min仍保持其活性；3)、AA-2G進入細胞以后經(jīng)α -葡萄糖苷酶水解生成VC和葡萄糖，具有同VC —樣的生物活性，能促進膠原蛋白的合成、治療壞血病、預防牙齦萎縮、出血、預防動脈硬化、作為抗氧化劑、治療貧血、抗癌、提高人體免疫力等；4)、AA-2G是衛(wèi)生署公布認可的6種美白添加劑之一，在許多高端美白化妝品中有著廣泛的應用。
[0004]目前生物轉(zhuǎn)化法是合成AA-2G的唯一途徑，即利用糖基轉(zhuǎn)移酶的特異性轉(zhuǎn)糖基作用，將葡萄糖基供體上的葡萄糖苷轉(zhuǎn)移到VC的2-位C上。目前為止，已經(jīng)研究開發(fā)了 5種酶類用于AA-2G的生物轉(zhuǎn)化合成，包括α -葡萄糖苷酶、環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、α -淀粉酶、蔗糖磷酸酶和α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶。環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶因其具有特別強的底物特異性成為目前目前合成AA-2G使用最廣泛的酶源，在使用環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)AA-2G時，作為葡萄糖基供體主要有環(huán)糊精、部分淀粉水解物(膠凝淀粉)以及麥芽糊精。日本林原生物化學研究所與岡山大學藥學系首次利用生物轉(zhuǎn)化合成AA-2G，1991年，HajimeAga等人利用來自Bacillus stearothermophilus的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶,利用20% (w/V) L-抗壞血酸和20% (w/v) α-環(huán)糊精在60°C、PH5.5條件下處理20h，接著用葡萄糖淀粉酶處理得到AA-2G對L-抗壞血酸的摩爾轉(zhuǎn)化率達到38% ；2007年，A.A.Markoyan等人利用來自Bacillus stearothermophilus的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶,利用20% (w/v)L_抗壞血酸和20% (w/v) Y -環(huán)糊精在60°C、PH5.5條件下處理48h，接著用葡萄糖淀粉酶處理得到AA-2G對L-抗壞血酸的摩爾轉(zhuǎn)化率達到49%。2011年，Hong-Ki Jun等人利用來自Paenibacillus sp .的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶,利用3% (w/v)L-抗壞血酸分別與7% (w/v) a -環(huán)糊精、0 -環(huán)糊精、Y-環(huán)糊精在45°C、PH6.0條件下處理24h，接著用葡萄糖淀粉酶處理得到AA-2G對L-抗壞血酸的摩爾轉(zhuǎn)化率分別為5.1%,3.5%,5.9% ;2011年，ZichenZhang等人利用對來自Paenibacillus macerans的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化酶,利用5% (w/v) L-抗壞血酸和5% (w/v) ^ -環(huán)糊精在45°C、PH5.5條件下處理5d得到AA-2G對L-抗壞血酸的摩爾轉(zhuǎn)化率為22%。
[0005]目前生產(chǎn)AA-2G存在的主要問題是缺乏一種定向以廉價底物獲得高轉(zhuǎn)化率的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明涉及一種環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)菌株，分類命名為芽孢桿菌WSH13-117(Bacillusp.WSH13-117)，于2013年9月12日保藏于中國典型微生物保藏中心(中國.武漢.武漢大學)，保藏編號為CCTCC M2013413。該環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)菌株是從吉林省長白山土壤中經(jīng)平板菌落特征初篩，采用一級發(fā)酵逐一搖瓶培養(yǎng)，經(jīng)酶活測定，比較環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶活大小而得到。以該菌為出發(fā)菌株，經(jīng)種子培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，并以發(fā)酵所得粗酶液或濃縮酶液為催化劑生產(chǎn)AA-2G，具體步驟為:在反應器中分別添加L-抗壞血酸和(6-環(huán)糊精作為底物，添加某種抗氧化劑，用氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)PH，加入發(fā)酵所得粗酶液或濃縮酶液，在150rpm的水浴搖床中反應一定時間后加入葡萄糖淀粉酶，在150rpm的水浴搖床中進行反應得到AA-2G。
[0007]所述平板分離培養(yǎng)基(g/L)及培養(yǎng)條件:
[0008]可溶性淀粉10，蛋白胨 5，酵母膏 5，K2HPO4 ? 12H201，MgSO4 ? 7H200.2，Na2C035，瓊脂15，酚酞0.3，甲基橙0.1。37°C培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)2-3d，測量D/d(黃色透明圈/菌落直徑)值，挑選值較大的進行初篩。
[0009]所述種子培養(yǎng)基(g/L)及培養(yǎng)條件:
[0010]蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，pH7.0，60°C，搖瓶轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)時間為20-24小時。
[0011 ] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)及培養(yǎng)條件:
[0012]可溶性淀粉10，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸銨2.5，七水硫酸鎂0.3，無水氯化鈣0.2，ImL(v/v)微量元素液，pH7.0，60°C，搖瓶轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵時間44-48小時。
[0013]所述微量元素液(g/L):
[0014]ZnCl22，F(xiàn)eS042，H3BO30.065，MoNa2O40.135。
[0015]所述L-抗壞血酸的終濃度為50g/L~200g/L。
[0016]所述0 -環(huán)糊精的終濃度為50g/L~300g/L。
[0017]所述抗氧化劑可以選做亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫脲等，終濃度為5g/L~20g/L。
[0018]所述重組環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的濃度為300~600U/g ^ -⑶。
[0019]所述重組環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶催化的反應在pH5.0~6.0,25~40°C下進行16 ~24h。
[0020]所述葡萄糖淀粉酶的濃度為50~150U/mL反應液。
[0021]所述葡萄糖淀粉酶催化的反應在50~60°C下進行16~24h。
[0022]本發(fā)明篩選了一種·表達環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的芽孢桿菌，用該酶進行酶反應生2-氧- a -D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸，具有反應方法簡便、低能耗、物料成本低等優(yōu)點，在較高底物濃度下能得到高底物轉(zhuǎn)化率，為工業(yè)化放大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
【具體實施方式】
[0023]實施例1:菌種篩選
[0024]從吉林省長白山附近土壤，按“五點取樣法”采取土樣10份，從中分離菌株。將少量樣品，放入烘箱80°C熱處理20min，后稱取樣品5g加入裝有45mL無菌水的小三角瓶中，靜置lOmin，上清液取0.1mL梯度稀釋(10_5，10_4，10_3)涂布于分離篩選平板上，37°C培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)2-3d，選取平板上黃色透明圈較大的菌落作為生產(chǎn)CGTase的菌株。挑取單菌落進行3-4次平板劃線。之后將篩選得到的幾株菌純化后在60°C進行液體發(fā)酵培養(yǎng)44-48h，取培養(yǎng)液離心后收集上清進行酶活測定，選取酶活高的菌株進行劃線傳代培養(yǎng)，最終得到一株產(chǎn)酶穩(wěn)定且有較高酶活的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生菌株。純化的菌株接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，4°C保藏，保藏編號為CCTCC M2013413，保藏機構(gòu)為中國典型培養(yǎng)物保減中心，保減地址為武漢市武昌洛咖山。
[0025]平板分離培養(yǎng)基(g/L):
[0026]可溶性淀粉10，蛋白胨 5，酵母膏 5，K2HPO4.12H201，MgSO4.7Η200.2，Na2C035，瓊脂15，酚酞0.3，甲基橙0.1。
[0027]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):
[0028]可溶性淀粉10，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸銨2.5，七水硫酸鎂0.3，無水氯化鈣0.2，ImL(v/v)微量元素液，pH7.0，55°C，搖瓶轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵時間44-48小時。
[0029]微量元素液(g/L):
[0030]ZnCl22，F(xiàn)eS042，H3BO30.065，MoNa2O40.135。
[0031]實施例2:發(fā)酵產(chǎn)酶
[0032](I)發(fā)酵培養(yǎng)
[0033]將實施例1中篩選得到的產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株接種于種子培養(yǎng)基中，在60°C下培養(yǎng)20~24h后以5%接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，60°C恒溫培養(yǎng)44~48h產(chǎn)酶。發(fā)酵結(jié)束后，離心收集上清液即為粗酶液。
[0034]種子培養(yǎng)基(g/L):
[0035]蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，pH7.0。
[0036]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):
[0037]可溶性淀粉10，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸銨2.5，七水硫酸鎂0.3，無水氯化鈣0.2，ImL(v/v)微量元素液，pH7.0。
[0038](2)酶活測定
[0039]以可溶性淀粉為底物利用甲基橙法測定該酶的酶活。酶活測定體系為2.5mL(含終濃度為2%的可溶性淀粉，50mM KH2PO4-Na2HPO4緩沖液，pH6.0)，在50°C下加入100 μ L適當稀釋的酶液反應10min后，加入3Μ鹽酸溶液200 μ I終止反應，在16°C下加入0.44mM甲基橙200 μ L顯色,在分光光度計505nm處測定吸光值。該條件下每分鐘生成I μ mo I α -環(huán)糊精所需的酶量定義為一個酶活單位(U)。
[0040]實施例3:粗酶液的濃縮[0041]將實施例2中獲得的酶液邊攪拌邊緩慢加入濃度為相對于酶液質(zhì)量體積分數(shù)26%的硫酸銨，攪拌至硫酸銨溶解，在4°C條件下靜置8~10小時沉淀蛋白。混合物經(jīng)離心(8000rpm, lOmin)收集沉淀，再用最小體積的50mM KH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH6.0)復溶，復溶后經(jīng)過再次離心除去固形物，收集上清透析后獲得濃縮酶液。
[0042]實施例4:酶法制備2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸
[0043]酶法生產(chǎn)工藝:
[0044]在反應器中投入終濃度為50g/L的L-抗壞血酸、200g/L的P -環(huán)糊精和10g/L的亞硫酸氫鈉，用20%的氫氧化鈉水溶液將pH調(diào)節(jié)到5.0，加入1000U實例3中獲得的濃縮酶液，在35°C，150rpm的水浴搖床中反應24小時，反應結(jié)束后加入60U葡萄糖淀粉酶，在60°C,150rpm的水浴搖床中反應24小時。
[0045]HPLC 檢測:
[0046]取樣并加入同體積的三氯乙酸溶液(10%，v/v)終止反應并沉淀蛋白，沉淀4小時后將樣品12000rpm離心lOmin，取上清液適度稀釋后用0.45 y m超濾膜過濾，并進行HPLC分析。色譜條件如下:Agilentl200HPLC色譜儀,Agilent自動進樣器，AgilentSB-Aq5 V- m(4.6mmX 250mm), LC-9A紫外檢測器；流動相為20mM的稀磷酸,流速0.8mL mirT1 ；柱溫35°C。
[0047]結(jié)果見表1，2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸對底物L-抗壞血酸的摩爾轉(zhuǎn)化率達58%。
[0048]表1不同實施例下a -CGT的生產(chǎn)情況
[0049]
【權(quán)利要求】
1.一種環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)菌株，分類命名為Bacillus sp.，于2013年9月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M2013413。
2.權(quán)利要求1所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)菌株的篩選方法，其特征是從吉林省長白山土壤中經(jīng)平板菌落特征初篩，采用一級發(fā)酵逐一搖瓶培養(yǎng)，經(jīng)酶活測定，比較環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶活大小而得到。
3.應用權(quán)利要求1所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)菌發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，其特征是采用Bacillus sp.為出發(fā)菌株，經(jīng)種子培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵制得環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是所述種子培養(yǎng)中，種子培養(yǎng)基成分為(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10 ;培養(yǎng)條件為:60°C，搖瓶轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分；培養(yǎng)時間為:20-24小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是所述液體深層發(fā)酵中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/L):可溶性淀粉10，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸銨2.5，七水硫酸鎂0.3，無水氯化鈣0.2，ImL(v/v)微量元素液；培養(yǎng)條件為:60°C，搖瓶轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分；發(fā)酵時間為:44-48小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述微量元素液成分為(g/L):ZnCl22,FeS042，H3BO30.065，MoNa2O40.135。
7.權(quán)利要求3所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶用于合成2-氧-a-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸(AA-2G)，包括以下步驟:以環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)菌發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；以發(fā)酵所得粗酶液或濃縮酶液為催化劑生產(chǎn)AA-2G，其特征在于，是在反應器中分別添加L-抗壞血酸和β -環(huán)糊精作為底物，添加某種抗氧化劑，用氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH，加入發(fā)酵所得粗酶液或濃縮酶液，在150rpm的水浴搖床中進行反應1，反應一定時間后加入葡萄糖淀粉酶，在150rpm的水浴搖床中進行反應2。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述L-抗壞血酸的終濃度為50g/L~200g/L ;所述β -環(huán)糊精的終濃度為50g/L~300g/L ;所述抗氧化劑可以選做亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫脲等，終濃度為5g/L~20g/L ;所述重組環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的濃度為300~600U/gP -CD ;所述反應I在pH5.0~6.0,25~40°C下進行16~24h ;所述葡萄糖淀粉酶的濃度為50~150U/mL反應液；所述反應2在50~60°C下進行16~24h。
【文檔編號】C12N1/20GK103667102SQ201310463782
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月23日
【發(fā)明者】吳敬, 熊艷軍, 王蕾 申請人:江南大學