專利名稱：一種用β-環糊精葡萄糖基轉移酶提高甜菊糖苷味質的方法
技術領域：
本發明屬涉及一種用β-環糊精葡萄糖基轉移酶提高甜菊糖苷味質的方法屬生物技術領域。
背景技術：
甜菊糖(Steviasugar)是從甜葉菊、Stevia rebaudianum Bertoni)的葉子中提取的一種雙萜糖苷的混合物，是天然的強力甜味劑，其甜度為蔗糖的150-300倍。經過大量而長期的毒理及藥理學研究，已經證明甜菊糖在體內沒有潛在性、遺傳性等危害，其安全性已經得到了 FAO和WHO等國際組織的認可，2004年7月6日世界聯合衛生組織正式通過允許甜菊糖在世界范圍內通用的決議，伴隨著其安全性被世界認可，其經濟效益進一步加大。 近年來，人們對于健康飲食愈發重視，作為甜味劑，甜菊糖因其穩定性強，熱量低，熱量只相當于蔗糖的1/300，無毒、無副作用等特點，成為人們尤其是肥胖病、糖尿病、高血壓、動脈硬化、齲齒病患者等青睞的食品，具有廣泛而深遠的發展前景。隨著甜菊糖的推廣，人們發現其具有一種苦澀的后味，雖然甜菊糖具有眾多的優點，但在人們多年來形成的口味習慣的影響下，其經濟效益在某些地區受到了嚴重的沖擊。 近年來，關于甜菊糖味質改善的研究成為了繼甜菊糖安全性研究之后的又一熱點問題；可以預見，建立一種高效的專一性的改善甜菊糖味是的方法必然會使整個甜菊糖產業達到一個新的高度。甜菊糖轉化技術的現狀，化學方法產物復雜，不易分離，可控性差，且效率不高；國內有使用呋喃果糖苷酶作用甜菊糖與蔗糖的混合物達到甜菊糖味質改善的先例，但其產物也是具有多樣性和不易分離的缺點，也有利用環糊精糖葡萄糖基轉移酶轉化甜菊糖苷以改善其味質，采用的酶以α型為主，其產物成分復雜，是具有多種葡糖基一甜菊糖苷的混合物，不利于甜菊糖產業后續的分離提純步驟，增加的生產成本。

發明內容
本發明的目的正是為了克服上述己有技術的缺點與不足而提供一種用環糊精葡萄糖基轉移酶提高甜菊糖苷味質的方法，用β-環糊精葡萄糖基轉移酶對甜菊糖苷進行轉化，產生葡萄糖基一甜菊糖苷，從而甜度可以得到顯著提升、而且成分單一、分離提純簡單。本發明的目的是通過下列技術方案實現的
一種用環糊精葡萄糖基轉移酶提高甜菊糖苷味質的方法，它按下述步驟進行 用水配制成含2-5重量％的甜菊糖苷和2-5重量％的淀粉的反應液，將酶活為60-70U/ ml的β-環糊精葡萄糖基轉移酶加入反應液中充分混合均勻，轉移酶的加入量為300-500 U/甜菊糖苷重量g，在溫度為37-50°C進行轉化反應48-72小時，再進行分離、提純得到單一的轉化產物葡萄糖基-甜菊糖苷產品，所述的β-環糊精葡萄糖基轉移酶是用從甜葉菊種植地土壤樣品中分離獲得β -環糊精葡萄糖基轉移酶菌株Υ-6接種到產酶培養基中， 37°C進行產酶發酵48-72小時，得到的酶活為60-70 U/ml的β -環糊精葡萄糖基轉移酶。
所述的高產β-環糊精葡萄糖基轉移酶菌株Υ-6菌落呈圓形凸起，邊緣不整齊，淺黃色，半透明，表面濕潤，有光澤。細胞直桿狀，單個或短鏈狀存在，不運動，可生長溫度為 15-45°C，可生長ρΗ為7-12，經生理生化及16S rRNA基因序列分析與同源性比較，該菌株 Y-6為類芽孢桿菌(Ami如以7ΛΛ5 sp.)，用脫脂牛奶做成凍干管，-70 °C保存或30%甘油于-80 °C保存。
本發明的類芽孢桿菌(J^ienibacillus sp. Y_6)的保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，類芽孢桿菌保藏編號為CGMCC No. 5316，保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏時間2011年10月10日。
從甜葉菊葉片提取出的甜菊糖中，甜菊糖苷(St)是其主要成分，約占60%_70%，甜度為蔗糖的270-300倍，由于甜菊糖苷結構的特殊性，食用后具有一定的不愉快后苦味；其次是甜菊糖A苷(RA)，約占15%-20%，甜度為蔗糖的350-450倍，且其甜味最接近蔗糖，口感較好；其他組分含量均較少。
環糊精糖基轉移酶(EC 2. 4.1.19)是α -淀粉酶家族中的一員，系統分類名稱為1，4- α -D-葡萄糖基-4- α -D-轉移酶，能夠催化淀粉發生葡萄糖基轉移反應產生環糊精，根據酶主要催化產生的環糊精種類而分為α-、β-和γ-環糊精糖基轉移酶三類。本發明選用的β -環糊精葡萄糖基轉移酶，它具有多種催化活性，能進行環化、偶合、歧化、水解等反應，是一類具有廣泛應用的酶，用β -環糊精葡萄糖基轉移酶對甜菊糖苷進行轉化， 能夠在甜菊糖苷的13或19位碳上引入糖基，使其轉化為葡萄糖基甜菊糖苷，明顯改善甜菊糖苷的甜度、口感及味質，轉化后的甜菊糖苷產品品質更好，甜度更高，一般轉化率可達 70-85%。
nPaenibaciIlus sp. Υ_6接種到產酶培養基中，進行產酶發酵，利用其產生的 β -環糊精葡萄糖基轉移酶作為催化劑，以淀粉作為糖基供體，甜菊糖苷作為糖基受體，經過轉化作用后甜菊糖苷整體分子將變成疏水性，得到味質改善的葡萄糖基一甜菊糖苷。
β -環糊精葡萄糖基轉移酶菌株的選育采用平皿梯度稀釋涂布、透明圈、定性及定量的篩選方法，從甜葉菊種植地土壤樣品中分離獲得高產β-環糊精葡萄糖基轉移酶菌株Υ-6。該菌株可在溫度為25-50°C的條件下良好生長，并且可以耐受較廣的PH7 - 12范圍，環境適應能力很強。
β -環糊精葡萄糖基轉移酶的制備將菌株Ami如sp. Y-6接種到產酶培養基中，進行產酶發酵，對培養液進行分離得到的酶液即為反應所需的β -環糊精葡萄糖基轉移酶，酶活為60-70U/ml。
由于釆取上述技術方案使本發明技術與已有技術相比具有如下優點及效果(a)本發明選擇菌株Y-6為高產β-環糊精葡萄糖基轉移酶菌株，β-環糊精葡萄糖基轉移酶具有多種催化活性，能進行環化、偶合、歧化、水解等反應，是一類具有廣泛應用的酶，此菌株的獲得可以豐富現有的環糊精葡萄糖基轉移酶菌株資源。
(b)菌株Υ-6可在溫度為25_50°C的條件下生長，并且可以耐受較廣的ρΗ7- 12，環境適應性強，具有進一步開發成高效工程菌株的潛力。
(C)本發明利用菌株Υ-6進行環糊精葡萄糖基轉移酶的生產，通過以淀粉作為糖基供體，甜菊糖苷作為糖基受體的反應體系，經過轉化作用后得到味質改善的葡萄糖基一甜菊糖苷，降低了其苦澀味，明顯的提高了甜菊糖的味質，為甜菊糖的市場化推廣提供了 一定的基礎。(d)本發明的方法，利用該菌株產生的環糊精葡萄糖基轉移酶對甜菊糖苷進行轉化，產物甜度可以得到顯著提升，且具有轉化率高、成分單一等優點，不僅可以顯著提高其味質，還可以解決以往環糊精葡萄糖基轉移酶轉化產物成分復雜、不易分離提純等問題。(e)該方法簡單、易控制、產品口感好、甜度高。
具體實施例方式實施例1
用從甜葉菊種植地土壤樣品中分離獲得高產β -環糊精葡萄糖基轉移酶菌株Υ-6接種到產酶培養基中，在溫度為37°C進行產酶發酵48-72小時，得到酶活為60-70 U/ml的 β-環糊精葡萄糖基轉移酶，備用，取2g甜菊糖苷和2g淀粉溶解于水中得到IOOml的反應液，將8. 57ml酶活為70U/ml的β -環糊精葡萄糖基轉移酶加入反應液中充分混合均勻，在溫度為37°C進行轉化反應72小時，再進行分離、提純得到單一的轉化產物葡萄糖基-甜菊糖苷產品，轉化率可達70%。實施例2
取3g甜菊糖苷和3g淀粉溶解于水中得到IOOml的反應液，將35ml酶活為60U/ml的 β -環糊精葡萄糖基轉移酶加入反應液中充分混合均勻，在溫度為37°C進行轉化反應72小時，再進行分離、提純得到單一的轉化產物葡萄糖基-甜菊糖苷產品，轉化率可達75%。實施例3
取4g甜菊糖苷和4g淀粉溶解于水中得到IOOml的反應液，將26. 67ml酶活為60U/ml 的β -環糊精葡萄糖基轉移酶加入反應液中充分混合均勻，在溫度為50°C進行轉化反應48 小時，再進行分離、提純得到單一的轉化產物葡萄糖基-甜菊糖苷產品，轉化率可達78%。實施例4
取5g甜菊糖苷和5g淀粉溶解于水中得到IOOml的反應液，將35. 71ml酶活為70U/ml 的β -環糊精葡萄糖基轉移酶加入反應液中充分混合均勻，在溫度為50°C進行轉化反應48 小時，再進行分離、提純得到單一的轉化產物葡萄糖基-甜菊糖苷產品，轉化率可達85%。
權利要求
1.一種用β-環糊精葡萄糖基轉移酶提高甜菊糖苷味質的方法，其特征在于它按下述步驟進行用純凈水配制成含2-5%重量的甜菊糖苷和2-5%重量的淀粉的反應液，將酶活為 60-70U/ml的β-環糊精葡萄糖基轉移酶加入反應液中充分混合均勻，轉移酶的加入量為 300-500U/甜菊糖苷重量g，在溫度為37-50°C進行轉化反應48-72小時，再進行分離、提純得到單一的轉化產物葡萄糖基-甜菊糖苷產品，所述的β-環糊精葡萄糖基轉移酶是用從甜葉菊種植地土壤樣品中分離獲得β-環糊精葡萄糖基轉移酶菌株Υ-6接種到產酶培養基中，37°C進行產酶發酵48-72小時，得到的酶活為60-70U/ml的β-環糊精葡萄糖基轉移酶。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的高產β-環糊精葡萄糖基轉移酶菌株Υ-6菌落呈圓形凸起，邊緣不整齊，淺黃色，半透明，表面濕潤，有光澤，細胞直桿狀，單個或短鏈狀存在，不運動，可生長溫度為15_45°C，可生長ρΗ為7-12，經生理生化及16S rRNA 基因序列分析與同源性比較，該菌株Y-6為類芽孢桿菌(Ami如以7ΛΛ5 sp.)，該菌株在中國科學院微生物菌種保藏中心的保藏號為CGMCC No. 5316，利用脫脂牛奶做成凍干管，-70 °C保存或30%甘油于-80 °C保存。
全文摘要
本發明涉及一種用β-環糊精葡萄糖基轉移酶提高甜菊糖苷味質的方法，其特征在于用水配制成含2-5％重量的甜菊糖苷和2-5％重量的淀粉的反應液，將酶活為60-70U/ml的β-環糊精葡萄糖基轉移酶加入反應液中充分混合均勻，轉移酶的加入量為300-500U/甜菊糖苷重量g，在溫度為37-50℃進行轉化反應48-72小時，再進行分離、提純得到單一的轉化產物葡萄糖基-甜菊糖苷產品，該方法具有方法簡單、易控制、產品口感好、甜度高的優點及效果。
文檔編號C12P19/56GK102492757SQ20111037973
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月25日 優先權日2011年11月25日
發明者于學健, 袁紅莉 申請人:中國農業大學