分枝桿菌快速藥敏檢測方法及檢測靶標(biāo)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種分枝桿菌快速藥敏檢測方法和檢測靶標(biāo)，以及用于所述檢測方法的試劑盒；其中，所述檢測靶標(biāo)選自核糖體RNA的間隔序列中的任意一種或幾種的組合。本發(fā)明方法，僅需要少量的細(xì)菌即可進(jìn)行藥敏檢測，檢測時(shí)間僅需24-72h；而且RNA提取方法檢測，不需要去除基因組DNA即可進(jìn)行檢測；同時(shí)本發(fā)明方法具有較高的靈敏度和特異度。
【專利說明】分枝桿菌快速藥敏檢測方法及檢測靶標(biāo)
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及一種分枝桿菌的檢測方法和檢測靶標(biāo)，尤其涉及一種所需細(xì)菌少、檢測時(shí)間短、操作方便的藥敏檢測方法和靶標(biāo)。
【背景技術(shù)】
[0002]分枝桿菌是一類細(xì)長略彎曲的微生物，主要種類包括結(jié)核分枝桿菌、非典型分枝桿菌、腐物寄生性分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌等，其中含有多種致病菌。分枝桿菌不產(chǎn)生內(nèi)、外毒素，致病性可能與細(xì)菌在組織細(xì)胞中大量繁殖引起的炎癥、菌體成分和代謝物質(zhì)的毒性以及對(duì)菌體成分產(chǎn)生的免疫損傷有關(guān)。其中，麻風(fēng)病目前并沒有特異性的預(yù)防方法，而結(jié)核病自20世紀(jì)80年代以來由于與HIV混合感染、移民以及耐藥菌株的出現(xiàn)而全面復(fù)活。
[0003]中國是22個(gè)結(jié)核病高發(fā)國家之一，而且中國結(jié)核病人中攜帶耐藥菌株的患者占28%-40%，遠(yuǎn)高于其它國家，耐藥結(jié)核菌株的增加給結(jié)核病的防治帶來極大困難。目前結(jié)核的治療仍然以抗結(jié)核藥物化學(xué)治療為主，但是近年來對(duì)一種或多種抗結(jié)核藥物同時(shí)耐藥的菌株(多耐藥菌)明顯增多，因此準(zhǔn)確的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于指導(dǎo)臨床治療和合理用藥至關(guān)重要。
[0004]分枝桿菌藥敏檢測已有諸多報(bào)道，目前分枝桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)多采用絕對(duì)濃度法和比例法(全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程第三版)，如CN102010886A公開的結(jié)核分枝桿菌藥敏檢測方法。但是分枝桿菌生長緩慢，在傳統(tǒng)羅氏(L-J)培養(yǎng)基上，需要4-8周才能生長出菌落，在經(jīng)4周后才能得到藥敏結(jié)果。
[0005]CNlOl 130808B采用連續(xù)超千倍放大系統(tǒng)在早期培養(yǎng)過程中，觀察單個(gè)細(xì)菌的增殖和微小菌簇的增殖形態(tài)，從而可以早期判斷藥物作用的結(jié)果，但是該方法依然需要一周的時(shí)間獲得藥敏結(jié)果。
[0006]目前，PCR、探針雜交、DNA測序等分子生物學(xué)方法已應(yīng)用于分枝桿菌的直接檢測，DNA檢測時(shí)基因突變檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但是檢測成本過高，DNA芯片檢測在理論上可以對(duì)樣品大量序列進(jìn)行檢測和分析，但是目前尚未見到有適用于臨床的DNA芯片實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。實(shí)驗(yàn)室研究以及臨床檢測所用的核酸定量擴(kuò)增檢測方法主要以實(shí)時(shí)熒光定量PCR為主，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。但是實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測在操作方法和檢測成本上存在很大局限性，CN1661359B公開了一種核酸等溫?cái)U(kuò)增定量檢測方法，將等溫放大與TaqMan或TaqMan MGB熒光探針結(jié)合，該專利提出用逆轉(zhuǎn)錄酶的外切酶的酶活性降解所述熒光探針產(chǎn)生的應(yīng)該信號(hào)。CN101333565B公開了一種將核酸恒溫放大與檢測同步進(jìn)行的檢測方法，在密閉容器中進(jìn)行恒溫放大反應(yīng)，并同時(shí)檢測體系中熒光信號(hào)的變化，根據(jù)熒光信號(hào)的變化時(shí)間和強(qiáng)度對(duì)核酸樣品進(jìn)行定量或定性檢測。
[0007]但是具體到分枝桿菌的藥敏檢測，找到有效的檢測靶標(biāo)是進(jìn)行藥敏檢測的根本和基礎(chǔ)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的是尋找分枝桿菌藥敏檢測靶標(biāo)、并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行快速藥敏檢測的問題。
[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種分枝桿菌快速藥敏檢測方法及靶標(biāo)。
[0010]本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了一種用于分枝桿菌快速藥敏檢測的靶標(biāo)，所述靶標(biāo)選自一種或幾種核糖體RNA的間隔序列。
[0011]其中，所述核糖體RNA的間隔序列優(yōu)選為選自5s rRNA與16s rRNA之間的間隔序列(pre-16s RNA)、16s rRNA與23s rRNA之間的間隔序列(pre_23s RNA)、及含有此部分序列全部或者部分的序列中的任意一種作為擴(kuò)增或者檢測靶標(biāo)。
[0012]本發(fā)明第二個(gè)方面是提供一種分枝桿菌快速藥敏檢測方法，所述方法包括如下步驟:
[0013]以本發(fā)明第一個(gè)方面所述任意一種或幾種靶標(biāo)RNA序列設(shè)計(jì)RNA探針和引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶的作用下，對(duì)靶標(biāo)RNA進(jìn)行RNA擴(kuò)增，通過比較對(duì)照組和加藥組內(nèi)靶標(biāo)RNA量的差異，判斷藥物敏感性。
[0014]其中，所述的RNA探針的兩端優(yōu)選為用熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記。
[0015]其中，本發(fā)明所述的RNA探針優(yōu)選為莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0016]其中，本發(fā)明所述的RNA引物，優(yōu)選地，其中一條引物與所述靶標(biāo)RNA序列相匹配，并且?guī)в蠺7啟動(dòng)子；另一條引物為合成cDNA互補(bǔ)鏈的引物。
[0017]在本發(fā)明第二個(gè)方面所述的方法的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述RNA擴(kuò)增反應(yīng)在40-45°C條件下進(jìn)行，優(yōu)選為41-44°C，更優(yōu)選為42_43°C，最優(yōu)選為42°C。
[0018]在本發(fā)明第二個(gè)方面所述的方法的一種優(yōu)選實(shí)施例中，在所述RNA擴(kuò)增過程中，每一次擴(kuò)增循環(huán)檢測一次熒光信號(hào)，共檢測至少30個(gè)循環(huán)，優(yōu)選為至少35個(gè)循環(huán)，更優(yōu)選為至少40個(gè)循環(huán)。
[0019]在本發(fā)明第二個(gè)方面所述的方法的一種優(yōu)選實(shí)施例中，以檢測到的熒光信號(hào)值的log值為縱坐標(biāo)，循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行繪圖，確定檢測曲線達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù)，即dt值；其中加藥組dt減去對(duì)照組dt得到的△ dt與判斷界值對(duì)比，如果大于判斷界值則判斷為敏感，如果小于判斷界值則判斷為耐藥。
[0020]本發(fā)明第三個(gè)方面是提供一種分枝桿菌快速藥敏檢測試劑盒，包括針對(duì)本發(fā)明第一個(gè)方面所述任意一種或幾種靶標(biāo)設(shè)計(jì)的RNA引物和RNA探針。
[0021]在本發(fā)明一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述RNA引物和RNA探針如下:
[0022]正向引物:5’-GTCTTGACTCCATTGCCGGA-3’ ；
[0023]反向引物:5’-TGACAAAACAAACGGCCACG-3’ ；
[0024]探針序列:5’-CGUGGAUUAGACUGGCAGCCACG-3’。
[0025]在本發(fā)明另一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述RNA引物和RNA探針如下:
[0026]正向引物:5’-CCGTGAGGGGTTCTTGTCTG-3’ ；
[0027]反向引物:5’-AAGTCCGAGTGTTGCCTCAG-3’ ；
[0028]探針序列:5’-CGACGGCAACACUCGGACUUGGUCG-3’。
[0029]在本發(fā)明一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述分枝桿菌為結(jié)核分枝桿菌。
[0030]本發(fā)明所提供的新型分枝桿菌快速藥敏檢測方法，通過比較對(duì)照管和加藥管內(nèi)分枝桿菌特定靶標(biāo)RNA的差異，判斷藥物敏感性。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于，僅需要少量的細(xì)菌即可進(jìn)行藥敏檢測，檢測時(shí)間僅需24-72h，且RNA提取方法檢測，不需要去除基因組DNA即可進(jìn)行檢測；另外本發(fā)明方法還具有較高的靈敏度和特異度。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為本發(fā)明以pre_16s RNA為檢測靶標(biāo)的藥敏檢測方法的靈敏度和特異度檢測
結(jié)果;
[0032]圖2為本發(fā)明以pre-23s RNA為檢測靶標(biāo)的藥敏檢測方法的靈敏度和特異度檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0033]實(shí)施例1
[0034]結(jié)核分枝桿菌臨床分離株共計(jì)96份，每一份均分為均等的兩份，一份加入液體培養(yǎng)基培養(yǎng)(對(duì)照組)，另一份加入含有利福平藥物的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)(加藥組)，利福平濃度lug/ml，在 37°C C 培養(yǎng) 2 天。
[0035]將培養(yǎng)后樣本13000r/min離心5min，棄上清，加入50ul樣本稀釋液(用DEPC處理過的無菌H2O配制10mmol/L檸檬酸鈉,pH值為8.0),重懸后放入超聲清洗器中進(jìn)行超聲處理15min，超聲功率300W。
[0036]超聲結(jié)束后，各取2ul處理物加入預(yù)先混合好的30ul擴(kuò)增檢測液，擴(kuò)增檢測液中含 40mmol/L 的 Tris-HCl 緩沖液(pH 值為 8.l),8mmol/L 氯化鎂，25mmol/L 氯化鈉，2mmol/L亞精胺，5mmol/L 二硫蘇糖醇，80mg/L牛血清白蛋白，脫氧核糖腺苷三磷酸、脫氧核糖胸苷三磷酸、脫氧核糖鳥苷三磷酸和脫氧核糖胞苷三磷酸各200 μ mol/L,腺苷三磷酸、鳥苷三磷酸、胞苷三磷酸和尿苷三磷酸各lmmol/L，引物濃度和探針濃度均為0.5mmol/L。
[0037]其中，所述引物和探針以pre-16s RNA為檢測靶標(biāo)進(jìn)行設(shè)計(jì)，探針5’端進(jìn)行FAM標(biāo)記，3’端進(jìn)行DABCYL標(biāo)記。所述引物和探針序列如下:
[0038]正向引物:5’ -GTCTTGACTCCATTGCCGGA-3 ’
[0039]反向引物:5’ -TGACAAAACAAACGGCCACG-3 ’
[0040]探針序列:5’-CGUGGAUUAGACUGGCAGCCACG-3’
[0041 ] 將反應(yīng)管置于PCR儀上60°C、IOmin, 42°C、5min,同時(shí)將酶液預(yù)熱至42°C。預(yù)熱后，向每支反應(yīng)管中加入IOul酶液(含M-MLV和T7RNA轉(zhuǎn)錄酶各2000U)，混勻后將反應(yīng)管快速轉(zhuǎn)至實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中啟動(dòng)反應(yīng)程序。反應(yīng)程序?yàn)闊晒馔ǖ涝O(shè)定為FAM,每個(gè)循環(huán)為42 0C、Imin，共40個(gè)循環(huán)；熒光信號(hào)收集I次/min，共檢測40次。
[0042]樣本曲線與閾值線交叉點(diǎn)的橫坐標(biāo)讀數(shù)(檢測時(shí)間)。
[0043]將加藥組的dt值減去對(duì)照組的dt值,得到Λ dt值。用Λ dt與判斷界值相比較，大于判斷界值則判斷為敏感，小于等于判斷界值也判定為耐藥。
[0044]同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)藥敏檢測方法Bactec MGIT960相比較，本方法檢測利福平藥敏的靈敏度和特異度分別達(dá)到90.2%和88.7% (`圖1)。
[0045]采用上述方法，以表1和2中的RNA序列為檢測靶標(biāo)，檢測結(jié)核分枝桿菌對(duì)主要抗結(jié)核藥物的藥敏性，并與標(biāo)準(zhǔn)藥敏檢測方法Bactec MGIT960相比較，檢測靈敏度和特異度。[0046]實(shí)施例2
[0047]結(jié)核分枝桿菌菌株共計(jì)20份(敏感株和耐藥株各10份)，每一份均分為均等的兩份，一份加入液體培養(yǎng)基培養(yǎng)(對(duì)照組)，另一份加入含有利福平藥物的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)(加藥組)，利福平濃度lug/ml，在37 °C培養(yǎng)2天。
[0048]將培養(yǎng)后樣本13000r/min離心5min，棄上清，加入50ul樣本稀釋液(用DEPC處理過的無菌H2O配制10mmol/L檸檬酸鈉,pH值為8.0),重懸后放入超聲清洗器中進(jìn)行超聲處理15min，超聲功率300W。
[0049]超聲結(jié)束后，各取2ul處理物加入預(yù)先混合好的30ul擴(kuò)增檢測液，擴(kuò)增檢測液中含 40mmol/L 的 Tris-HCl 緩沖液(pH 值為 8.l),8mmol/L 氯化鎂，25mmol/L 氯化鈉，2mmol/L亞精胺，5mmol/L 二硫蘇糖醇，80mg/L牛血清白蛋白，脫氧核糖腺苷三磷酸、脫氧核糖胸苷三磷酸、脫氧核糖鳥苷三磷酸和脫氧核糖胞苷三磷酸各200 μ mol/L,腺苷三磷酸、鳥苷三磷酸、胞苷三磷酸和尿苷三磷酸各lmmol/L，引物濃度和探針濃度均為0.5mmol/L。
[0050]其中，所述引物和探針以pre-23s RNA為檢測靶標(biāo)進(jìn)行設(shè)計(jì)，探針5’端進(jìn)行FAM標(biāo)記，3’端進(jìn)行DABCYL標(biāo)記。所述引物和探針序列如下:
[0051 ]正向引物:5，-CCGTGAGGGGTTCTTGTCTG-3 ’
[0052]反向引物:5’ -AAGTCCGAGTGTTGCCTCAG-3 ’
[0053]探針序列:5’-CGACGGCAACACUCGGACUUGGUCG-3，
[0054]按照實(shí)施例1所述的 方法僅藥敏檢測，同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)藥敏檢測方法Bactec MGIT960相比較，本方法檢測利福平藥敏的靈敏度和特異度分別達(dá)到100%和100% (圖2)。
[0055]采用同樣的方法，以pre_16s RNA和pre_23s RNA為檢測祀標(biāo),檢測結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼、吡嗪酰胺和乙胺丁醇等一線抗結(jié)核藥物的藥敏性，結(jié)果顯示，本發(fā)明方法也具有良好的靈敏度和特異度。
[0056]因此，pre_16s RNA和pre_23s RNA可以作為檢測分枝桿菌藥敏性的檢測祀標(biāo),用于藥物合成、篩選等領(lǐng)域，此外，以pre_16s RNA和pre_23s RNA為檢測祀標(biāo),進(jìn)行分枝桿菌藥敏性檢測，用菌量少、檢測速度快，可以快速的提供檢測結(jié)果，作為結(jié)核等分枝桿菌感染的用藥和治療的參考和依據(jù)。
[0057]以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于分枝桿菌快速藥敏檢測的靶標(biāo)，其特征在于，所述靶標(biāo)選自一種或幾種核糖體RNA的間隔序列，所述核糖體RNA的間隔序列選自5s rRNA與16s rRNA之間的間隔序列、16s rRNA與23s rRNA之間的間隔序列、及含有此部分序列全部或者部分的序列中的任意一種作為擴(kuò)增或者檢測靶標(biāo)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶標(biāo)，其特征在于，所述分枝桿菌為結(jié)核分枝桿菌。
3.一種分枝桿菌快速藥敏檢測方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:以權(quán)利要求I所述任意一種或幾種靶標(biāo)RNA序列設(shè)計(jì)RNA探針和引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶的作用下，對(duì)靶標(biāo)RNA進(jìn)行RNA擴(kuò)增，通過比較對(duì)照組和加藥組內(nèi)靶標(biāo)RNA量的差異，判斷藥物敏感性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3快速藥敏檢測方法，其特征在于，所述的RNA探針的兩端用熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求4快速藥敏檢測方法，其特征在于，所述的RNA引物中，其中一條引物與所述靶標(biāo)RNA序列相匹配，并且?guī)в蠺7啟動(dòng)子；另一條引物為合成cDNA互補(bǔ)鏈的引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4快速藥敏檢測方法，其特征在于，在所述RNA擴(kuò)增過程中，每一次擴(kuò)增循環(huán)檢測一次熒光信號(hào)，共檢測至少30個(gè)循環(huán)； 以檢測到的熒光信號(hào)值的log值為縱坐標(biāo)，循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行繪圖，確定檢測曲線達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù)，即dt值；其中加藥組dt減去對(duì)照組dt得到的Λ dt與判斷界值對(duì)t匕，如果大于判斷界值則判斷為敏感，如果小于判斷界值則判斷為耐藥。
7.根據(jù)權(quán)利要求4快速藥敏檢測方法，其特征在于，所述靶標(biāo)選自5srRNA與16s rRNA之間的間隔序列、16s rRNA與23s rRNA之間的間隔序列、及含有此部分序列全部或者部分的序列中的任意一種作為擴(kuò)增或者檢測靶標(biāo)。
8.一種分枝桿菌快速藥敏檢測試劑盒，其特征在于，包括針對(duì)權(quán)利要求1所述任意一種或幾種檢測靶標(biāo)設(shè)計(jì)的RNA引物和RNA探針。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述RNA引物和RNA探針為: 正向引物:5 ’ -GTCTTGACTCCATTGCCGGA-3，；
反向引物:5 ’ -TGACAAAACAAACGGCCACG-3 ’ ； 探針序列:5’ -CGUGGAUUAGACUGGCAGCCACG-3’。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述RNA引物和RNA探針為: 正向引物:5 ’ -CCGTGAGGGGTTCTTGTCTG-3，； 反向引物:5 ’ -AAGTCCGAGTGTTGCCTCAG-3，； 探針序列:5’ -CGACGGCAACACUCGGACUUGGUCG-3’。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103555828SQ201310471718
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月10日
【發(fā)明者】崔振玲, 胡忠義, 程松, 張長明, 于明輝 申請(qǐng)人:上海市肺科醫(yī)院, 上海仁度生物科技有限公司