一株解淀粉芽孢桿菌及其液體制劑在防治核桃根腐病中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株解淀粉芽孢桿菌及其液體制劑在防治核桃根腐病中的應用，該菌株的分類命名為解淀粉芽孢桿菌，Bacillus?amyloliquefaciens，完整命名為解淀粉芽孢桿菌Ba4，已于2013年9月12日保藏在中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.8177。本發明提供的解淀粉芽孢桿菌Ba4對核桃根腐病有特效，且具有抗逆性，貯藏性好，抗高溫、低溫、耐干燥，適宜于商品化生產，而且施用一次可長期有效、能持續控病，大幅降低成本。
【專利說明】一株解淀粉芽孢桿菌及其液體制劑在防治核桃根腐病中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生態學領域，尤其涉及的是一株解淀粉芽孢桿菌及其液體制劑在防治核桃根腐病中的應用。
【背景技術】 [0002]核桃具有重要的經濟價值和生態作用，在我國林業建設和生態環境建設中有十分重要的地位，特別是對于提高山區農業經濟水平具有積極的作用。核桃根腐病(Fusariumsolani)以幼苗期受害為主，受害苗木輕者影響生長，重者造成大量死亡，成為育苗工作的一大障礙。感病的幼苗，主要表現為根部變黑腐爛，地上部葉片發黃、葉緣變黑，死亡率很高。現在四川栽培區成年大樹也可發病，對核桃產業是一潛在威脅。目前主要采用化學防治和營林技術，而生物防治措施研究尚未涉及。化學防治雖是一種有效的防治手段，但存在病原菌抗藥性、環境與食品安全、藥害等許多實際問題，一些化學殺菌劑在許多發達國家和地區已嚴格限制使用。而與環境友好的生物農藥越來越受到人們的青睞，是未來農業可持續發展的重要組成部分。
[0003]因此，現有技術存在缺陷，需要改進。

【發明內容】

[0004]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術對核桃根腐病防治的缺陷，提供了一株解淀粉芽孢桿菌及其液體制劑在防治核桃根腐病中的應用。
[0005]本發明的技術方案如下:
[0006]一株解淀粉芽孢桿菌，其分類命名為解淀粉芽孢桿菌，Bacillusamyloliquefaciens,已于2013年09月12日保藏在中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.8177。
[0007]所述的解淀粉芽孢桿菌的液體制劑的制作方法，包括以下步驟:
[0008]( I) 一級斜面種子:常規方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培養基，接種所述解淀粉芽孢桿菌后，培養，制成一級種子；
[0009](2) 二級液體種子:營養肉質培養液經高壓滅菌后，在通氧控制下，按IOOmL液體盛于300mL三角瓶比例裝瓶，然后在無菌狀態下接種所述解淀粉芽孢桿菌斜面種子，每瓶接種2支斜面種子，振蕩培養，制成解淀粉芽孢桿菌液體種子；
[0010](3)液體發酵:營養肉質培養液經高壓滅菌后，在通氧控制下按200mL液體盛于500mL三角瓶比例裝瓶，在無菌狀態下接種步驟(2)制得的解淀粉芽孢桿菌液體種子，接種量為液體總體積的10%，振蕩培養，制成解淀粉芽孢桿菌液體制劑，然后保存。
[0011]所述的解淀粉芽孢桿菌的液體制劑的制作方法，步驟(1)中，牛肉膏蛋白胨斜面培養基的成分為牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaC15g，瓊脂17g，水1000mL0
[0012]所述的解淀粉芽孢桿菌的液體制劑的制作方法，其營養肉質培養液的成分為牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaC15g，核桃枝浸潰液lOOOmL。
[0013]所述的制作方法得到液體制劑。
[0014]所述的液體制劑在防治核桃根腐病中的應用，未發病核桃林地用所述解淀粉芽孢桿菌液體制劑體積比的100-300倍稀釋度沿根系幅面灌根，每株100毫升，每年春季施用一次，可預防根腐病發生；發病核桃按所述解淀粉芽孢桿菌液體制劑體積比50-200倍稀釋度沿根系幅面灌根及附近土壤淋灌，每株200毫升，春、夏各一次，可效治療根腐病。
[0015]本發明篩選出了對核桃根腐病有特效的新菌株Ba4，其具有抗逆性強的芽孢體，貯藏性好，抗高溫、低溫、耐干燥，適宜于商品化生產，且施用一次可長期有效、能持續控病，大幅降低成本。
【具體實施方式】
[0016]以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。
[0017]1、內生細菌的分離、純化與保存
[0018]在四川廣元市朝天區核桃根腐病發生地采集健康核桃根系，帶回實驗室分離。采回的樣本用無菌水沖洗干凈，稱取1.0g根組織，用70%的酒精消毒30s，無菌水洗3次后，再用4%的NaClO消毒3min后，無菌水洗3次，吸取最后一次洗滌液100 μ I涂抹NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂粉15-20g，蒸餾水1000ml，pH7.0，混勻分裝后121°C高壓滅菌30min)，28°C黑暗培養24h，用于表面消毒的對照，檢查表面消毒是否徹底。
[0019]將已表面消毒的根部組織剪碎，放入無菌的研缽，加入滅菌的石英砂和IOml無菌7jC,充分研磨，靜置30min,稀釋10-1，10_2，10_3，10_4，10_5共5個梯度，分別吸取100 μ 110_3，10_4，10_5這3個梯度研磨液 分別涂布NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂粉15-20g,蒸餾水1000ml，pH7.0,混勻分裝后121 °C高壓滅菌30min)，每個處理3次重復，28°C黑暗培養48h，選取生長最為均勻的梯度，進行平板計數。
[0020]依據菌落的大小、顏色、是否突起，邊緣特征、表面光滑與否、透明度等方面的差異，挑取單菌落在NA平板上劃線純化，純化后轉接NA斜面于4°C保藏備用。共獲10個內生細菌。
[0021]2、內生細菌對核桃根腐病病菌的平板拮抗作用
[0022]平板對峙法:在培養皿中央接種7d的核桃根腐病病菌(Fusarium solani)菌餅(直徑5mm)，離該病菌餅約3cm處，分別用接種環沾取培養2d的內生菌，在病菌對稱兩側各劃一條細線，28°C培養，以只接種病菌的平板為對照，待對照長滿皿時測量病菌的菌落生長直徑，每處理重復3次。按下式計算菌落生長抑制率:
[0023]菌落生長抑制率=(對照菌落凈生長直徑一處理菌落凈生長直徑)/對照菌落凈生長直徑X 100%
[0024]表1是內生細菌對核桃根腐病病菌(Fusarium solani)的拮抗作用，結果顯示:7d之后，有4種內生細菌菌落生長抑制率達61.54%以上，其中Ba4菌株抑制率達100%。
[0025]表1內生細菌對核桃根腐病病菌的拮抗作用(7天)
[0026]
【權利要求】
1.一株解淀粉芽孢桿菌，其特征在于，保藏編號為CGMCC N0.8177。
2.根據權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌的液體制劑的制作方法，其特征是，包括以下步驟: (1)一級斜面種子:常規方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培養基，接種所述解淀粉芽孢桿菌后，培養，制成一級種子； (2)二級液體種子:營養肉質培養液經高壓滅菌后，在通氧控制下，按IOOmL液體盛于300mL三角瓶比例裝瓶，然后在無菌狀態下接種所述解淀粉芽孢桿菌斜面種子，每瓶接種2支斜面種子，振蕩培養，制成解淀粉芽孢桿菌液體種子； (3)液體發酵:營養肉質培養液經高壓滅菌后，在通氧控制下按200mL液體盛于500mL三角瓶比例裝瓶，在無菌狀態下接種步驟(2)制得的解淀粉芽孢桿菌液體種子，接種量為液體總體積的10%，振蕩培養，制成解淀粉芽孢桿菌液體制劑，然后保存。
3.根據權利要求2所述的解淀粉芽孢桿菌的液體制劑的制作方法，其特征是，步驟(O中，牛肉膏蛋白胨斜面培養基的成分為牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaC15g，瓊脂17g，水1000mLo
4.根據權利要求2所述的解淀粉芽孢桿菌的液體制劑的制作方法，其特征是，營養肉質培養液的成分為牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaC15g，核桃枝浸潰液lOOOmL。
5.根據權利要求2-4任一所述的制作方法得到的液體制劑。
6.根據權利要求5所述的液體制劑在防治核桃根腐病中的應用，其特征是，未發病核桃林地用所述解淀粉芽孢桿菌液體制劑體積比的100-300倍稀釋度沿根系幅面灌根，每株100毫升，每年春季施用一次，`可預防根腐病發生；發病核桃按所述解淀粉芽孢桿菌液體制劑體積比50-200倍稀釋度沿根系幅面灌根及附近土壤淋灌，每株200毫升，春、夏各一次，可效治療根腐病。
【文檔編號】C12N1/20GK103555616SQ201310493899
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月21日 優先權日:2013年10月21日
【發明者】朱天輝, 朱涵明月, 李姝江, 張靜, 劉洋, 韓珊, 譙天敏, 張麗娜, 鄭磊 申請人:四川農業大學