一種乳桿菌三聯活菌制劑及制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種植物乳桿菌，其分類命名為植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum），該菌株已于2014年2月24號保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.8848。本發明還公開了一種乳桿菌三聯活菌制劑，該制劑是由益生菌混合物和保護劑組成，所述益生菌混合物為植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌冷凍干燥活菌粉組成。本發明還公開了制備乳桿菌三聯活菌制劑的方法。本發明在大量實驗的基礎上篩選出黏附定植力最強的植物乳桿菌為主要益生菌，與嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌以及保護劑混合，制成活菌凍干菌粉，成為保健作用更強，并可常溫長期保存的復合益生菌制劑。
【專利說明】
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物產品，具體涉及一種乳桿菌三聯活菌制劑及制備方法。 一種乳桿菌三聯活菌制劑及制備方法

【背景技術】
[0002] 乳桿菌是人體腸道內的重要的生理性有益菌，它具有維持胃腸道正常的微生態平 衡，抑制病原菌的入侵和感染，增強機體免疫力，預防和抑制腫瘤發生，降低膽固醇以及抗 氧化等作用。早在1 9〇5年，俄國微生物學家梅切尼科夫就發現，高加索地區居民長壽者較 多，其原因是食用了大量含乳酸菌的酸奶，并指出含有保加利亞乳桿菌的酸奶能使人長壽。 此后，大量的乳桿菌菌株被分離篩選出來，并廣泛應用于醫療和保健食品中。嗜酸乳桿菌 NCFM (Zacio知s NCFM)是一株已被廣泛應用的商業化菌株，它最初是由 美國北卡羅納州立大學的Μ. Speck、S. Cilliland和Τ· KlaenhammerTO年代從人體中分離 得到的，現被廣泛應用于液態奶、酸奶、固態液化食品、嬰幼兒食品和果汁。研究資料表明， 嗜酸乳桿菌NCFM產生的細菌素對金黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌、大腸桿菌以及梭菌等具 有較強的抑制能力，在體外對腸上皮樣細胞Caco-2、HT-29也具有較強的粘附性能，能夠緩 解乳糖不耐癥和調節腸道菌群。鼠李糖乳桿菌LGG (ATCC53103) aaciMaciBi/rfe應 LGG)是由美國的Sherwood Gorbach和Barry Goldin兩位研究人員于1980年從健康人體 的腸道中分離出來的。LGG可有效的降低革蘭氏陰性菌產生內毒素的水平，抑制腸素性大腸 桿菌和鼠傷寒沙門氏菌對腸上皮細胞的粘附和侵襲，增強IgA對食物抗原的抵抗力，維持 腸粘膜的完整性和功能；鼠李糖乳桿菌LGG對抗生素治療所引起的腹瀉、腹痛有明顯的治 療效果，且鼠李糖乳桿糖LGG在任何研究情況下都無不良反應。Oksanen等[Oksanen PJ， Salminen S,Saxelin M,Hamalainen Ρ,Ihantola-Vormisto A,Muurasniemi-Isoviita L, Nikkari S, Oksanen T, Porsti I, Salminen E. Prevention of travellers' diarrhoea by Lactobacillus GG. Ann Med. 1990,22:53-56.] 在土耳其對來自芬蘭的旅行者進行的研究中發現43. 8%旅行者患了腹瀉，若一天兩次 口服鼠李糖乳桿菌LGG后，治愈率可達98%以上；Hilton等【Hilton E，Kolakowski P， Singer C, Smith M. Efficacy of Lactobacillus GG as a Diarrheal Preventive in Travelers. J Travel Med. 1997，4:41-43】對美國去亞洲、東非、南美等地的旅行者腹瀉 發病情況進行了研究，發現每人口服1粒鼠李糖乳桿菌LGG膠囊可預防旅行腹瀉的發生，且 發現鼠李糖乳桿菌LGG對以前從未發生旅行者腹瀉的人群具備更為有效的治療效果。總 之，鼠李糖乳桿菌是一種安全的，且具有顯著調節腸道菌群、改善腸道功能、預防和治療腹 瀉、提高機體免疫力等功能的菌株，目前已在全球30多個國家廣泛應用。另外，還有植物桿 菌 2"V 299V)、干酪乳桿菌Z. casei Shirota、嗜酸乳桿菌 LB LB)以及大腸奸菌 Nisslel917 Nissle 1917)等菌株也在大量應用，且在臨床治療中具有較好的效果。
[0003] 乳酸菌進入腸道后，首先和腸黏膜表面相接觸，通過識別特異性的受體并與之結 合，黏附定植于腸黏膜表面。這種黏附一方面通過競爭性的占位定植形成生物屏障，以阻止 病原菌與腸黏膜受體結合；另一方面也延長了乳酸菌影響宿主腸道免疫系統和微生態區系 的時間，以維持腸道的內穩態。因此，乳酸菌對腸黏膜上皮細胞的黏附和定植是其發揮生理 作用的前提和基礎。
[0004]雖然目前在臨床和保健食品中已大量應用了一些乳酸菌菌株，但由于乳酸菌的益 生性能具有菌株特異性，各分離菌株在黏附性能方面存在很大的差異。另外分離源和宿主 也會影響菌株的黏附性能，從而使得一些產品中的菌株不能長期定植于腸道發揮其應有的 益生作用，極大地影響了此類產品的作用效果。


【發明內容】

[0005]發明目的：本發明的第一個目的提供了一種植物乳桿菌。本發明的第二個目的 是提供了一種乳桿菌三聯活菌制劑。本發明的第三個目的提供了上述乳桿菌三聯活菌制劑 的制備方法。
[0006] 技術方案：為實現上述目的，本發明通過下述技術方案實現：一種植物乳桿菌，其 分類命名為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum),該菌株已于2014年2月24號保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 8848。
[0007] -種乳桿菌三聯活菌制劑，該制劑是由益生菌混合物和保護劑組成，所述益生菌 混合物為植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌冷凍干燥活菌粉組成。
[000S]按重量份數，上述植物乳桿菌5?15份、嗜酸乳桿菌3?5份、鼠李糖乳桿菌3?5份、 保護劑1(Γ20份。
[0009] 其中，上述益生菌混合物組成比為植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌分別 為 5 :3 :3。
[0010] 其中，上述保護劑為15-20%的脫脂奶粉、5-10%的植物淀粉和5-20%的β -環糊 精。
[0011] -種制備乳桿菌三聯活菌制劑的方法，該方法包括下列步驟：將MRS液體培養基 置于高壓鍋內，121°C滅菌2(Γ25分鐘，冷卻至30?37°C后，在無菌條件下分別接10%-15%的 植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌以及鼠李糖乳桿菌，然后置于37°C恒溫培養箱中培養18-24h，獲 得細菌培養物，將菌液以250(T3000rpm/min離心15~20min，得濕菌泥，加入等量保護劑后， 冷凍干燥獲得凍干菌粉，然后將三種菌的凍千粉混合后，加入保護劑，過40目篩混合后灌 裝膠囊或按常規方法制成顆粒劑。 t〇〇12] 本發明的菌種來源及生物學特性如下： 1.菌種來源 1)植物乳桿菌L2,由本室分離自健康人的腸道。腸鏡檢查時采用活檢鉗夾取腸黏膜組 織，立即置入無菌的勻漿器內研磨。待組織塊完全勻漿后，加入無菌PBS進行系列稀釋，最 后取相應稀釋樣品涂布于LAMVAB選擇性培養基上，分別置于37°C的生化培養箱和厭氧培 養箱內孵育24lT48h。待平板長出菌落后，挑取黃綠色平板中呈淺綠色或淺白色光滑的中 小菌落，經革蘭氏染色鏡檢，確定為革蘭氏陽性桿菌的菌落進行反復劃線分離，直至菌株形 態均一。篩選的菌株L2在LAMVAB平板上呈現出淺綠色或綠色的光滑菌落，直徑約Γ2πιπι, 邊緣整齊，呈白色環狀，在MRS固體培養基上呈現出無色或白色的光滑菌落。革蘭氏染色陽 性，無芽孢，菌體呈桿狀或短桿狀，長約1. 5飛μ m。在有氧和厭氧條件下均可生長，且在厭氧 狀態下生長良好，產酸，不還原硝酸鹽，不液化明膠，不產生H2S，吲哚試驗陰性，觸酶和氧化 酶試驗均為陰性，聯苯胺反應陰性，最適生長溫度為35°C、0°C。采用API 50 CHL試劑盒的 不同種類的碳水化合物進行生化反應，生化結果鑒定為植物乳桿菌(見表1)。以菌株L2的 總DNA為模板，用引物10F和1500R進行PCR擴增，得到一段長約1. 4kb的PCR產物（圖 1)，菌株 L2 的 1仍 rRNA 基因序列 GenBank 登錄號為（Accession number: ER)88327)。將 菌株L2的16S rDNA序列與GenBank中的序列進行比較，表明與其同源性最高的模式菌株 相似性最局的是植物乳桿菌(Zactofecii/iAs 所以該菌株命名為植物乳桿菌 L2。該菌株已于2014年2月24號保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101，保 藏編號為 CGMCCNo. 8848。
[0013] 表1 L2對碳水化合物代謝的分析

【權利要求】
1. 一種植物乳桿菌，其特征在于，其分類命名為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum),該菌株已于2014年2月24號保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心，保藏編號為CGMCC No. 8848。
2. -種乳桿菌三聯活菌制劑，該制劑是由益生菌混合物和保護劑組成，其特征在于，所 述益生菌混合物為權利要求1所述的植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌冷凍干燥活 菌粉組成。
3. 根據權利要求2所述的乳桿菌三聯活菌制劑，其特征在于，按重量份數，所述植物乳 桿菌5?15份、嗜酸乳桿菌3飛份、鼠李糖乳桿菌3?5份、保護劑1(Γ20份。
4. 根據權利要求2所述的乳桿菌三聯活菌制劑，其特征在于，所述益生菌混合物組成 比為植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌分別為5 :3 :3。
5. 根據權利要求2所述的乳桿菌三聯活菌制劑，其特征在于，所述保護劑為15-20%的 脫脂奶粉、5-10%的植物淀粉和5-20%的β -環糊精。
6. -種制備權利要求2的乳桿菌三聯活菌制劑的方法，其特征在于，該方法包括下列 步驟：將MRS液體培養基置于高壓鍋內，121°C滅菌20?25分鐘，冷卻至30~37°C后，在無菌 條件下分別接1〇%_15%的植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌以及鼠李糖乳桿菌，然后置于37°C恒溫 培養箱中培養18-24h，獲得細菌培養物，將菌液以2500?3000 rpm/min離心15~20min，得濕 菌泥，加入等量保護劑后，冷凍干燥獲得凍干菌粉，然后將三種菌的凍千粉混合后，加入保 護劑，過40目篩混合后灌裝膠囊或按常規方法制成顆粒劑。
【文檔編號】A61K35/74GK104189015SQ201410110029
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年3月24日 優先權日:2014年3月24日
【發明者】王斌, 曹振芳 申請人:南京久騰醫藥科技有限公司