一種骨髓間充質干細胞在體外向成骨細胞分化的誘導方法及誘導培養基的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種骨髓間充質干細胞在體外向成骨細胞分化的誘導方法及誘導培養基，本發明誘導培養基組成為：地塞米松1×10-8mol/L，抗壞血酸50μmol/L，β-甘油磷酸鈉10mmol/L，溶劑為骨片完全培養基的上清液，其成分為：胎牛血清10%，青霉素100U/mL，鏈霉素100mg/L，DMEM培養液和F12培養液的混合物以及骨片培養過程中骨細胞分泌的多種生長因子。本發明通過更換細胞培養液和細胞貼壁傳代的方法純化小鼠骨髓間充質干細胞，取獲得的第1代細胞進行誘導，以培養72-96小時的骨片完全培養基的上清液為成骨細胞分化誘導劑的溶劑，明顯提高了骨髓間充質干細胞的體外成骨分化效率。
【專利說明】一種骨髓間充質干細胞在體外向成骨細胞分化的誘導方法及誘導培養基
【技術領域】
[0001]本發明涉及骨髓間充質干細胞的體外成骨細胞誘導分化方法，以及所用的誘導培養基。
【背景技術】
[0002]骨髓間充質干細胞在適當的條件刺激下可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等細胞類型，而且易于分離培養，具有較強的自我更新、分化能力和免疫抑制等優點，使其在組織器官缺損性疾病、組織器官退行性疾病以及細胞治療和組織工程領域具有重要的應用前景。近來有眾多的國內外研究探索骨髓間充質干細胞向成骨細胞誘導分化的方法，以期作為骨組織工程的研究基礎和臨床骨相關疾病生物治療的理論指導。體外分離純化的骨髓間充質干細胞經過傳代后，相關的生物學特性發生改變，外形未見明顯變化，但是已逐漸失去其分化潛能，經過定向誘導分化后只有少量的細胞向所需的方向分化，影響其作為組織工程細胞來源的應用。近來有研究報道將一些與成骨細胞分化相關的細胞因子應用于干細胞成骨分化相關的研究中，對提高骨髓間充質干細胞的成骨分化效率具有一定的生物學效應。

【發明內容】

[0003]本發明所要解決的技術問題是提供一種骨髓間充質干細胞在體外向成骨細胞分化的誘導方法，能提高分化效率 。
[0004]本發明解決技術問題所采用的技術方案是:
一種骨髓間充質干細胞在體外向成骨細胞分化的誘導方法，所述方法包括:
(一)骨髓間充質干細胞的體外分離、培養和純化
取骨髓細胞，經篩網過濾后制成單細胞懸液接種于培養皿中進行貼壁培養，初始接種密度為5 X IO6個/mL細胞培養基，培養3小時后更換細胞培養基(組成同前)，此后每隔12小時更換一次細胞培養基(組成同前)，直到接種后72小時，然后再每隔3天更換細胞培養基(組成同前)繼續培養，直到細胞長至809^90%融合，以胰酶消化，消化時間不超過2分鐘，細胞傳代后繼續培養或直接接種于孔板中用于誘導向成骨細胞分化；所述細胞完全培養基終濃度組成如下:胎牛血清10% (體積百分比濃度),青霉素100U/mL，鏈霉素100mg/L，溶劑為基礎培養基，所述基礎培養基為DMEM培養液和F12培養液體積比為1:1的混合物。
[0005](二)骨貼片培養和培養基上清的獲取、保存
采用無菌的顯微鉗將已經取出骨髓內容物的小鼠股骨和脛骨分成約4_2大小的骨片，均勻放置于培養皿中，骨髓腔面接觸培養皿底，置于37°C、飽和濕度、含5% CO2的培養箱中進行骨片培養，待培養至72~96小時有大量細胞從骨片爬出時收集其上清液，離心后凍存于一 20°C。所述骨片完全 培養液終濃度組成如下:胎牛血清10%，青霉素100U/mL，鏈霉素100mg/L,溶劑為基礎培養基，所述基礎培養基為DMEM培養液和F12培養液體積比1:1的混合液。
[0006](三)骨髓間充質干細胞的成骨誘導分化
原代接種的第I代骨髓間充質干細胞長至80%~90%融合時，添加0.25%胰酶(含有
0.02%EDTA)室溫消化細胞2分鐘，添加完全培養基終止消化后經過離心分離獲得細胞沉淀，然后以相同的密度分接種于12孔板中，待細胞擴增至80%融合后添加誘導培養基進行誘導分化。
[0007]本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種用于骨髓間充質干細胞的體外誘導向成骨分化的誘導培養基，所述誘導培養基的終濃度如下:地塞米松1X10—8 mol/L，抗壞血酸50 μ mol/L,甘油磷酸鈉10 mmol/L,溶劑為所述骨片培養72~96小時的上清液。
[0008]優選的，所述誘導培養基終濃度組成如下:地塞米松1X10_8 mol/L，抗壞血酸50 μ mol/L, β -甘油磷酸鈉10 mmol/L,溶劑為所述骨片培養72小時的上清液，所述上清液為骨片完全培養液以及在骨片培養過程中骨細胞分泌的多種細胞因子。
[0009]本發明在以往的研究基礎上，采用骨片培養上清液和成骨誘導培養基結合的方法，取傳代后的第I代骨髓間充質干細胞進行成骨細胞分化，明顯提高了骨髓間充質干細胞的成骨分化效率。
[0010]本發明的骨髓間充質干細胞在體外向成骨細胞分化的誘導方法，具有如下優點:
(I)早期誘導可充分體現骨髓間充質干細胞的分化能力。
[0011](2)骨片培養過程中釋放到培養液中的多種細胞因子不僅有利于骨髓間充質干細胞的存活，還有利于純化的骨髓間充質干細胞向成骨細胞方向分化。
`[0012](3)骨片培養上清液來源方便，獲取方法簡單可行。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為實施例1的成骨細胞分化染色結果圖。
[0014]圖2為實施例2的成骨細胞分化染色結果圖。
[0015]圖3為實施例3的成骨細胞分化染色結果圖。
[0016]圖4為骨片培養至72小時的細胞爬片圖。
[0017]其中，圖中箭頭所示為鈣結節沉淀，紅色為鈣化物沉淀，圖片的放大倍率均為100倍。
【具體實施方式】
[0018]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此。
[0019]實施例1:
所用試劑:胎牛血清(Hyclone)，青霉素、鏈霉素、DMEM培養液、F12培養液(Gibco)Ji塞米松、抗壞血酸、甘油磷酸鈉、5’ 一氮胞苷(Sigma)。
[0020]1、取6周左右的ICR雄性成年小鼠(購買于浙江省醫學科學院實驗動物中心)，頸椎脫白處死，無菌條件下取出股骨和脛骨。
[0021]2、無菌剪刀剪開兩端骨骺，用注射器吸取完全培養基沖洗骨髓腔，完全培養基組份:10%(v/v)胎牛血清，青霉素100U/mL，鏈霉素100mg/L，溶劑為DMEM/F12培養液(即DMEM與Fl2體積比1:1的混合液)。
[0022]3、獲得的骨髓細胞懸液經200目篩網過濾，接種于10 cm的培養皿中，初始接種密度約為5 X IO6個/mL，細胞培養基為完全培養基，初始接種的細胞培養基體積為2mL，可覆蓋培養皿底。
[0023]4、初始接種的骨髓細胞置于37°C、飽和濕度、含5% CO2的培養箱中培養3小時后更換細胞培養基，體積為2 mL。
[0024]5、初次更換培養基12小時后，再次更換細胞培養基，體積仍為2 mL, 12小時后，再次更換細胞培養基，至初次接種后72小時，更換細胞培養基體積增加為8 mL,之后每3天更換一次細胞培養基，體積為8 mL,待細胞長至80%融合時進行消化傳代接種于12孔板中，在倒置顯微鏡下觀察培養不同時間的細胞形態。
[0025]6、收集骨髓細胞的同時，用顯微鉗將已經取出骨髓內容物的股骨和脛骨用分為約4_2的骨片，骨髓腔面向下均勻放置于30_的培養皿中，每只小鼠的骨片放置于同一個培養皿中培養，每個培養皿中添加的完全培養液體積為2mL，置于37°C、飽和濕度、含5% CO2的培養箱中培養72小時，骨片周圍有大量細胞爬出時(如圖4所示)，吸取上清液至離心管中，10000轉/分鐘離心5分鐘，收集上清液，凍存于一 20°C備用(收集的上清液即為步驟6中成骨誘導分化所用的骨片培養上清液)。
[0026]7、細成骨誘導分化:接種于12孔板中的第I代細胞長至80%融合時，PBS緩沖液洗滌細胞三次后，添加0.25% (w/v)胰酶(含有0.02% (w/v) EDTA)室溫消化細胞2 min，細胞完全培養基終止消化，細胞懸液經300g離心5 min后，完全培養基懸浮細胞接種于12孔板中繼續培養，待細胞長至80%融合時，更換為骨片培養上清液，添加地塞米松I X 10_8mol/L、抗壞血酸50 ii mol/L、(6-甘油磷酸鈉10 mmol/L后進行成骨誘導分化,每3天更換一次誘導培養基，分化21天后采用茜素紅S染色檢測小鼠骨髓間充質干細胞的成骨細胞分化結果,所述誘導培養基的終濃度組成為:地塞米松I X 10-8 mol/L,抗壞血酸50 u mol/L,^ -甘油磷酸鈉10 mmol/L，溶劑為培養72小時的骨片培養上清液。
[0027]實施例2:
本實施例步驟7中進行誘導分化的的骨髓間充質干細胞是通過細胞貼壁培養和胰酶消化傳至第3代的細胞，本實施例的其他步驟與實施例1相同。
[0028]實施例3:
本實施例中的誘導培養基的成分是細胞完全培養基添加與實施例1中相同濃度的地塞米松、抗壞血酸和(6-甘油磷酸鈉。
[0029]骨髓間充質干細胞的成骨細胞誘導分化結果鑒定:
實施例1和實施例2、3中的小鼠骨髓間充質干細胞成骨誘導分化21天后，PBS洗滌細胞，4%多聚甲醛固定30分鐘，蒸餾水洗滌3遍，0.2%的茜素紅S室溫染色30分鐘，然后棄去染色液，蒸餾水洗滌3遍，顯微鏡下觀察小鼠骨髓間充質干細胞的成骨細胞分化結果。
[0030]結果如附圖，圖1為實施例1的成骨分化細胞菌素紅S染色結果顯示細胞密度較高，視野中幾乎所有的細胞均染成紅色，且有眾多的鈣化物和鈣結節沉淀(圖1所示)，分化效果明顯；實施例2采用傳至第3代的細胞進行成骨誘導分化，只有少量的鈣結節形成，而且細胞已經失去原來的形態，變得寬大扁平，細胞界限模糊(圖2所示)；實施例3采用細胞完全培養基添加誘導劑各成 分對第1代細胞進行成骨誘導，經過21天的誘導后，細胞密度相對較低’有鈣化物和鈣結節沉淀形成(圖3所示)，顯然實施例1中的分化效果好，分化效
率明顯 提高。
【權利要求】
1.一種骨髓間充質干細胞在體外向成骨細胞分化的誘導方法，其特征在于:所述方法包括:獲取骨髓細胞制成單細胞懸液接種于培養皿中進行貼壁培養，培養3飛小時后首次更換細胞培養基，此后每隔12小時再次更換細胞培養基，直到接種后72小時，然后再每隔3天更換細胞培養基繼續培養，直到細胞長至80%~90%融合，以胰酶消化，消化時間不超過2分鐘，獲得純化骨髓間充質干細胞； 取小鼠的股骨和脛骨進行骨片培養，培養至72~96小時有細胞爬出時，收集骨片培養的上清液； 取純化骨髓間充質干細胞進行體外成骨細胞的誘導分化，每3天更換一次誘導培養基，至誘導21天進行染色鑒定；所述誘導培養基的終濃度組成如下:地塞米松IX 10-8mol/L,抗壞血酸50 μ mol/L, β -甘油磷酸鈉10 mmol/L,溶劑為所述骨片培養72~96小時的上清液。
2.如權利要求1所述的一種骨髓間充質干細胞在體外向成骨細胞分化的誘導方法，其特征在于:所述細胞培養基的終濃度組成如下:胎牛血清10%，青霉素100U/mL，鏈霉素100mg/L,溶劑為基礎培養基；所述基礎培養基為DMEM培養液和F12培養液體積比1:1的混合液。
3.如權利要求1所述的一種骨髓間充質干細胞在體外向成骨細胞分化的誘導方法，其特征在于:所述骨片培養基的終濃度組成如下:胎牛血清10%，青霉素100U/mL，鏈霉素100mg/L,溶劑為基礎培 養基；所述基礎培養基為DMEM培養液和F12培養液體積比1:1的混合液。
4.如權利要求1所述的一種骨髓間充質干細胞在體外向成骨細胞分化的誘導方法，其特征在于:所述純化骨髓間充質干細胞為傳代后的第I代細胞。
5.一種骨髓間充質干細胞在體外向成骨細胞分化的誘導培養基，其特征在于:所述誘導培養基的終濃度組成如下:地塞米松I X 10-8 mol/L,抗壞血酸50 μ mol/L, β_甘油磷酸鈉10 mmol/L，溶劑為骨片培養72~96小時的上清液。
6.如權利要求5所述的一種骨髓間充質干細胞在體外向成骨細胞分化的誘導培養基，其特征在于:所述成骨細胞分化培養基終濃度組成如下:地塞米松1X10-8 mol/L，抗壞血酸50μπιΟ1/1，β-甘油磷酸鈉10 mmol/L，溶劑為骨片培養72小時的上清液。
【文檔編號】C12N5/077GK103667182SQ201310514265
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年10月25日 優先權日:2012年12月17日
【發明者】李靜, 周國順, 戴利成 申請人:湖州市中心醫院