本發明涉及凍存液技術領域，尤其涉及一種間充質干細胞凍存液。

背景技術：

目前干細胞凍存液的使用方法為：在細胞培養達到一定密度后，需要冷凍保存在液氮中保持細胞的活性，在日后的使用復蘇后能夠正常的培養，因此在凍存時需要添加一定比例的凍存液在凍存時保持細胞的完整和對細胞的傷害降至最低。

現有技術中的細胞凍存液往往由胎牛血清與二甲基亞砜按體積比為9：1混合得到，由于使用動物源的胎牛血清，導致細胞凍存液中摻入非人源物質，造成殘留或者污染，而且現有的細胞凍存液在干細胞后續復蘇培養過程中干細胞的貼壁率為80％左右，死細胞較多，獲得的最終細胞數為1.2×10⁷/瓶左右，成本也較高。

技術實現要素：

基于背景技術存在的技術問題，本發明提出了一種間充質干細胞凍存液，更適合間充質干細胞的凍存，間充質干細胞重新復蘇后貼壁率達到90％以上，死細胞較少，培養7天后收獲得到的細胞數為2×10⁷/瓶，大大提高了細胞的數量；同時檢測細胞表型時，CD44⁺達到99％以上，CD105⁺達到99％以上。

本發明提出的一種間充質干細胞凍存液，其原料按體積百分比包括：1640培養液65.5～75.4％，二甲基亞砜9.8～10.1％，人血白蛋白9.8～11.2％，羥乙基淀粉9.9～10.8％，成纖維細胞生長因子0.5～1.5％。

具體實施方式中，1640培養液的體積百分比可以為65.5％、66％、66.5％、 67％、67.5％、68％、68.5％、69％、69.5％、70％、70.5％、71％、71.5％、72％、72.5％、73％、73.5％、74％、74.5％、75％、75.4％，二甲基亞砜的體積百分比可以為9.8％、9.9％、10.0％、10.1％，人血白蛋白的體積百分比可以為9.8％、9.9％、10％、10.1％、10.2％、10.3％、10.4％、10.5％、10.6％、10.7％、10.8％、10.9％、11％、11.1％、11.2％，羥乙基淀粉的體積百分比可以為9.9％、10％、10.1％、10.2％、10.3％、10.4％、10.5％、10.6％、10.7％、10.8％，成纖維細胞生長因子的體積百分比可以為0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％。

優選地，其原料按體積百分比包括：1640培養液68～72％，二甲基亞砜9.9～10.0％，人血白蛋白10～11％，羥乙基淀粉10.0～10.2％，成纖維細胞生長因子0.8～1.2％。

優選地，人血白蛋白、羥乙基淀粉、成纖維細胞生長因子的重體積比為10.2：10：1.1。

優選地，人血白蛋白、羥乙基淀粉、成纖維細胞生長因子的重體積比為10.8：10.1：1。

優選地，人血白蛋白、羥乙基淀粉、成纖維細胞生長因子的重體積比為10.5：10.2：0.9。

優選地，其原料按體積百分比包括：1640培養液69％，二甲基亞砜10％，人血白蛋白10％，羥乙基淀粉10％，成纖維細胞生長因子1％。

本發明采用1640培養液、人血白蛋白、羥乙基淀粉、成纖維細胞生長因子相互配合，能滋養間充質干細胞，促進間充質干細胞處于半休眠狀態，使間充質干細胞的能量消耗維持在較低的水平，促進間充質干細胞在液氮中保持細胞的活性，使之復蘇后能夠進行正常的培養；其中1640培養液、人血白蛋白、羥 乙基淀粉為凍存間充質干細胞提供營養成分，而人血白蛋白、羥乙基淀粉和二甲基亞砜相互配合能降低細胞內水熔點，維持細胞內外滲透壓平衡，成纖維細胞生長因子能使間充質干細胞在凍存期間進行緩慢修復，維持細胞活性。綜上所述，本發明相比于現有技術中的凍存液更適合間充質干細胞的凍存。

使用本發明進行間充質干細胞的凍存，當間充質干細胞重新復蘇后貼壁率達到90％以上，死細胞較少，培養7天后收獲得到的細胞數為2×10⁷/瓶，大大提高了細胞的數量；同時檢測細胞表型時，CD44⁺達到99％以上，CD105⁺達到99％以上。

附圖說明

圖1為本發明實施例5所得間充質干細胞凍存液與現有凍存液進行細胞凍存、復蘇，復蘇干細胞貼壁率對比圖。

圖2為本發明實施例5所得間充質干細胞凍存液與現有凍存液進行細胞凍存、復蘇，復蘇干細胞活性對比圖。

圖3為本發明實施例5所得間充質干細胞凍存液與現有凍存液進行細胞凍存、復蘇，復蘇干細胞表型檢測圖。

具體實施方式

下面，通過具體實施例對本發明的技術方案進行詳細說明。

實施例1

本發明提出的一種間充質干細胞凍存液，其原料按體積百分比包括：1640培養液67.6％，二甲基亞砜9.8％，人血白蛋白11.2％，羥乙基淀粉9.9％，成纖維細胞生長因子1.5％。

實施例2

本發明提出的一種間充質干細胞凍存液，其原料按體積百分比包括：1640 培養液68.8％，二甲基亞砜10.1％，人血白蛋白9.8％，羥乙基淀粉10.8％，成纖維細胞生長因子0.5％。

實施例3

本發明提出的一種間充質干細胞凍存液，其原料按體積百分比包括：1640培養液67.9％，二甲基亞砜9.9％，人血白蛋白11％，羥乙基淀粉10％，成纖維細胞生長因子1.2％。

實施例4

本發明提出的一種間充質干細胞凍存液，其原料按體積百分比包括：1640培養液69％，二甲基亞砜10％，人血白蛋白10％，羥乙基淀粉10.2％，成纖維細胞生長因子0.8％。

實施例5

本發明提出的一種間充質干細胞凍存液，其原料按體積百分比包括：1640培養液69％，二甲基亞砜10％，人血白蛋白10％，羥乙基淀粉10％，成纖維細胞生長因子1％。

將實施例5所得間充質干細胞凍存液進行細胞凍存并對復蘇細胞進行檢測，具體操作如下：

1、將實施例5所得間充質干細胞凍存液加至干細胞重懸后，保存在凍存管中，5×10⁶/管，程序降溫的方式凍存，24h后轉移到液氮管中保存；

2、取出一根含凍存細胞的凍存管，37℃水浴復溶后，加到培養瓶中，再加入30mL干細胞專用培養基，放置37°CO₂培養箱中培養；

3、第2日更換培養瓶中培養液，觀察細胞貼壁情況；

4、第4日傳代，檢測細胞數及活性；

5、第7日收獲貼壁細胞，檢測細胞數及活性，以及干細胞表型。

其結果如圖1-3所示，圖1為復蘇干細胞貼壁率對比圖，圖2為復蘇干細胞活性對比圖，圖3為復蘇干細胞表型檢測圖。由圖1和圖2可知：采用本發明實施例5所得間充質干細胞凍存液進行凍存、復蘇后，細胞的活性和貼壁率遠遠高于現有的凍存液，其貼壁率和活性均可達到90％以上；而由圖3可知：采用本發明實施例5所得間充質干細胞凍存液進行凍存、復蘇后，細胞表型中CD44⁺達到99％以上，CD105⁺達到99％以上。

以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。