一種h5n1亞型禽流感病毒ns1蛋白多克隆抗體、制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】一種H5N1亞型禽流感病毒NS1蛋白多克隆抗體、制備方法及應用，涉及生物技術及動物免疫學領域，尤其涉及H5N1亞型禽流感病毒NS1蛋白多克隆抗體及其制備方法，所述H5N1亞型禽流感病毒NS1蛋白具有如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，其對應的DNA序列如SEQIDNO.1所示。發明以NS1作為研究靶點，通過對NS1基因的克隆、原核和真核載體的構建，重組蛋白的表達、純化和鑒定，制備NS1抗體，為進一步開發診斷NS1的ELISA檢測試劑盒做準備，為進一步深入研究流感病毒致病的分子機制以及研發治療H5N1感染的NS1功能抑制劑奠定基礎。
【專利說明】—種H5N1亞型禽流感病毒NS1蛋白多克隆抗體、制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術及動物免疫學領域，尤其涉及H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白多克隆抗體及其制備方法。
【背景技術】
[0002]人類感染高致病性禽流感病毒H5N1 (簡稱人禽流感)是人類在接觸該病毒感染的病禽/死禽或暴露在被H5N1病毒污染的環境后發生的急性呼吸道傳染病。1997年,我國香港特別行政區首次發生H5N1亞型人高致病性禽流感病例，并致6人死亡，在世界范圍內引起了廣泛的關注。2003年下半年，世界上多個國家暴發家禽和野生禽類的H5N1病毒感染，其中有14個國家出現人禽流感病例。截至2008年4月30日，由世界衛生組織(WHO)報道的全球確診病例共378例，其中238例患者死亡，病死率高達63%。我國大陸H5N1型人禽流感病毒感染呈高度散發，從2005年4月底確診第I例人禽流感病例以來，現已確診30例，其中17例患者死亡，病死率為56.7%。到目前為止，禽流感已造成全球超過1.5億只禽類被撲殺，直接經濟損失高達100億美元。H5N1型禽流感已經在15個亞洲和歐洲國家與地區傳播，雖然目前未出現禽流感病毒在人群中流行的現象，但根據WHO的估計，目前H5N1禽流感仍在一些國家的禽類中流行，且流行區在不斷擴大。因此，有跡象表明，H5N1型禽流感在人群中流行只是時間問題。
[0003]H5N1病毒的基因組由8個分節段的負鏈RNA組成，編碼9種結構蛋白和2種非結構蛋白(non-structoral protein I, NSl ;non_structoral protein 2, NS2)。一直以來，科學家們認為劃分病毒類型的血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)這兩種結構蛋白在禽流感病毒感染人類細胞過程中發揮主要作用，然而來自圣猶大兒童醫院的研究人員在分析比對了2196個包括流感基因和169個全基因組序列(包括了人類和豬流感病毒，這是迄今包括病毒種類最多、最廣泛的流感全基因組對照分析)之后，發現除了編碼血凝素和神經氨酸酶的基因發生變異外，編碼NSl蛋白質的基因也頻繁變異。在不同亞型的流感病毒中，編碼這三種蛋白質的基因序列變異最大，這表明它們決定了病毒的致病性。
[0004]NS基因是H5N1基因組中最小的基因節段，全序列為890個核苷酸，有兩個編碼區，分別編碼NSl和NS2兩種蛋白質。第I個編碼區編碼含202~237個氨基酸殘基的NSl蛋白，在不同病毒株系間有差異；第2個編碼區編碼含121個氨基酸殘基的NS2蛋白，其5'端有56個核苷酸與NSl相同，整個mRNA包含一個中斷的含473個核苷酸的區域。NSl蛋白含有2個核定位區，其中34位~38位氨基酸殘基處的信號區非常保守，在所有A型和B型流感病毒中都相同，其氨基酸排列順序為-Asp-Arg-Leu-Arg-Arg-。第2個信號區在203位~230位氨基酸殘基處，在大多數A型流感病毒中都有這一序列。有研究表明，NSl基因核苷酸替代大致是保守的，即 使突變也是不連續的。早期研究表明，這兩種蛋白質僅存在于被流感病毒感染的細胞中，而不出現在流感病毒粒子內，所以稱為非結構蛋白(NS)。NSl在感染的早期就被大量合成并很快轉移至核內，調節病毒RNA的合成、Pre mRNA的剪切、運輸及mRNA的翻譯過程；NS2主要在胞漿內，在感染的后期才會合成，與Ml蛋白密切作用，將RNP由細胞核輸送到細胞漿，在病毒的復制周期中起重要作用。隨著研究的進一步深入，發現NS2蛋白在成熟的病毒粒子中少量存在，所以NSl蛋白是流感病毒唯一的非結構蛋白。因此，研究人員認為血凝素和神經氨酸酶是流感病毒感染宿主細胞、破壞機體免疫系統的關鍵，而NSl蛋白只在病毒侵入機體細胞后才生成，表明其可能在破壞被感染細胞的過程中起關鍵作用，可能與多個細胞內受體結合，破壞細胞內的關鍵信號傳導通道，致使宿主細胞死亡。
[0005]雖然對于流感病毒的研究已經持續了很多年，然而到目前為止人們對于流感病毒的致病致死機理還不很清楚。比較贊同的觀點是:流感病毒通過其表面的HA蛋白與宿主細胞表面受體結合，進入細胞內部快速復制，從而導致了宿主細胞凋亡，進而器官衰竭，最后導致宿主死亡。不過近年來研究發現，即使使用抗流感病毒藥物有效抑制了流感病毒的復制后，宿主的死亡率并沒有明顯下降。這就提示流感病毒的致病致死機理可能還有其他尚未發現的途徑。目前，NSl被證實能夠協助H5N1逃避人體免疫系統的監視作用，NSl作為干擾素和腫瘤壞死因子的拮抗物，可以調節機體的固有免疫和適應性免疫，并在病毒復制、細胞凋亡等過程中發揮重要作用，是流感病毒一個主要的毒力因子。
[0006]本發明以NSl作為研究靶點，通過對NSl基因的克隆、原核和真核載體的構建，重組蛋白的表達、純化和鑒定，制備NSl抗體，為進一步開發診斷NSl的ELISA檢測試劑盒做準備，為進一步深入研究流感病毒致病的分子機制以及研發治療H5N1感染的NSl功能抑制劑奠定基礎。

【發明內容】

[0007]本發明的一個目的在于提供一種H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白的多克隆抗體，本多克隆抗體效價高，能特異性的檢測人血清及其他體液中的NSl蛋白。
[0008]為實現上述目的，本發明所采用的技術方案為:` 一種基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白的多克隆抗體，所述H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0.2所示，其對應的DNA序列如序列表中SEQ IDN0.1所示。
[0009]本發明的另一目的在于提供所述多克隆抗體的制備方法，本方法操作簡單，成本低廉，適用于大規模生產。
[0010]為實現這一目的，本發明所采用的技術方案為:
一種基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白的多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟: (OH5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白的制備
以H5N1亞型禽流感病毒核酸鏈為模板，通過PCR方法擴增獲得含有完整H5N1亞型禽流感病毒NSl基因開放閱讀框的目的片段，并克隆于表達載體中得重組表達載體，將重組表達載體轉化入宿主細胞后誘導表達并純化，獲得H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白；
(2)動物免疫
用步驟I所得H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白免疫新西蘭大白兔，取血，得抗血清；
(3)多克隆抗體的獲得
分離并提純步驟2所得抗血清IgG，得多克隆抗體。
[0011 ] 進一步地，在步驟(1)中，提取H5N1亞型禽流感病毒核酸基因組，以H5N1亞型禽流感病毒核酸鏈為模板，以如序列表中SEQ ID N0.3所示的上游引物和序列表中SEQ ID N0.4所示的下游引物通過PCR的方法擴增獲得含有完整H5N1亞型禽流感病毒NSl基因ORF的目的片段，并克隆于大腸桿菌原核表達載體，將重組質粒轉化入大腸桿菌宿主細胞后用IPTG誘導表達，經蛋白柱純化，獲得H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白。
[0012]進一步地，在步驟(2)中，用所得的H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白作為免疫原免疫新西蘭大白兔,測血清效價并取血,得抗血清。
[0013]進一步地，在步驟(3)中，通過蛋白純化柱對步驟(1)所得抗血清IgG進行提取和純化，得多克隆抗體。
[0014]本發明的目的之三是提供一種基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白多克隆抗體的應用，該多克隆抗體能應用于檢測H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白，且特異性高。 [0015]為實現這一目的，本發明所采用的技術方案為:
上述基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白多克隆抗體在制備禽流感病毒檢測試劑中的應用。
[0016]進一步，基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白的多克隆抗體在制備禽流感H5N1病毒間接免疫熒光檢測試劑中的應用。
[0017]本發明的有益效果在于:本多克隆抗體效價高、特異性好，可以滿足H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白的相關檢測實驗；其應用包括免疫印跡(Western-blotting)、免疫熒光及ELISA試驗等。本制備方法以原核表達載體pET-28a(+)為基礎所構建的體外H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白表達系統能在大腸桿菌BL21 (DE3)中能高效地表達目的蛋白，進一步純化用于免疫動物，制得效價高特異性好的多克隆抗體，本方法操作簡單，適用于工業化生產。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為PCR獲得H5N1亞型禽流感病毒NSl基因的片斷。
[0019]圖2為重組質粒pET-28a(+)_NSl的雙酶切鑒定結果。
[0020]圖3為重組蛋白的SDS-PAGE分析結果。
[0021]圖4為重組蛋白的western-blotting分析結果。
[0022]圖5為兔抗H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白純化結果。其中，M:蛋白分子量標準；Lanel:總菌體裂解液(OmM IPTG，3小時后，37°C ) ;Lane2:總菌體裂解液(ImM IPTG，3小時后，37°C) ;Lane3:誘導菌體超聲破碎上清液；Lane4:誘導菌體超聲沉淀8M Urea溶解上清(純化前樣品)；Lane5:NTA純化柱流穿；Lane6 =IOmM咪唑濃度洗脫液；Lane7:40mM咪唑濃度洗脫液；Lane8:80mM咪唑濃度洗脫液；Lane9 =IOOmM咪唑濃度洗脫液；LanelO:200mM咪唑濃度洗脫液；Lanell:300mM咪唑濃度洗脫液；Lanel2:400mM咪唑濃度洗脫液；Lanel3:500mM咪唑濃度洗脫液。
[0023]圖6為本發明的兔抗H5N1亞型禽流感病毒NSl抗體的效價分析結果。
【具體實施方式】
[0024]為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面對本發明的優選實施例進行詳細的描述。[0025]實施例1:禽流感H5N1基因的PCR擴增
應用Oiig0軟件設計引物，為了便于基因的克隆及構建表達載體，同時參照原核表達載體pET-28a (+)的多克隆位點序列，分析NSl基因序列內的酶切位點，設計一對引物(下劃線標注為酶切位點):
Primer-Forward: 5’ -ccatggatggattccaacactgtgtc-3，
Primer-Reverse: 5’ -ctcgaggttaactcggtcttcaaaact-3，
Primer-Forward和Primer-Reverse分別為上游引物和下游引物，其5’端分別引入與質粒載體相同的NcoI (ccatgg)和XhoI (ctcgag)酶切位點，經Primer5.0軟件檢測，所設計的引物不含有自身互補序列，不形成發夾結構，兩引物間不形成引物二聚體。Primer-Forward和Primer-Reverse引物的跨幅為902bp,包含了完整的NSl基因片段(693bp);引物由寶生生物技術有限公司合成。合成后，以適量滅菌去離子水溶解，使其終濃度為 10mmol/L,-20 度保存。PCR 反應條件:95°C預變性 5min，95°C 30s, 58°C 30s, 72°C 60s,進行30個循環，72°C延伸10分鐘結束。(圖1)
實施例2:原核表達載體pET-28a(+)-NSl表達載體的構建、誘導表達及重組鑒定
PCR產物純化試劑盒回收目的片段，酶切，將酶切片段直接連接于pET-28a(+)載體，連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，挑取單克隆，進行PCR、酶切和測序鑒定。將連接產物轉化感受態宿主菌BL21 (DE3)，在Amp平板上挑取陽性克隆進行LB液體擴大培養，抽取重組質粒進行PCR、雙酶切和測序鑒定(圖2)。
[0026]將鑒定正確的重組質粒轉化BL21 (DE3)宿主菌，挑取單克隆接種到含有50ug/mlAmp的LB培養基中，200轉/分鐘振蕩培養2小時左右，當0D600在0.4-0.6之間時，按終濃度ImM (mmol/L)加入IPTG誘導表達5小時，離心收集菌體。沉淀中加入80ul超純水和20ul 5xSDS上樣緩沖液，100°C水浴加熱變性10分鐘，進行質量分數為12%的SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍染色，觀察表達結果。重組質粒經誘導后表達了約61kDa的融合蛋白。對照組沒有相應條帶。(圖3)
Western-blotting分析:表達蛋白經SDS-PAGE電泳分離后轉移至醋酸纖維素膜(PVDF)上，用含有5% (w/v)脫脂奶粉的TBST 37°C緩慢搖動溫育1.5小時封閉NC膜；然后加入含5% (w/v)脫脂奶粉的TBST 稀釋的兔抗NSl血清，同時設兔陰性血清對照組，370C緩慢搖動溫育I小時；TBST洗滌膜3次，每次10分鐘；再加入含5%脫脂奶粉的TBST稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG 二抗，37°C緩慢搖動溫育I小時；TBST洗滌膜3次，每次10分鐘后，加入ECL化學發光顯色液進行反應，最后壓片，曝光，顯色，結果能觀察到特異性地反應條帶。(圖4)
實施例3:重組蛋白的純化
挑取單菌落于IOmlLB培養基中，37°C，250rpm培養過夜后，轉接1%過夜菌于500mlLB培養基，37°C，250rpm培養3小時，然后加入ImM IPTG誘導5小時。離心收集500ml表達目標蛋白的大腸桿菌培養物，超聲破菌于20ml破菌緩沖液中，離心后分別收集沉淀和上清。將沉淀重懸于5mlNTA-0緩沖液中，離心取上清。將上清上樣于預先平衡好的NTA純化柱(10倍柱體積NTAU-O緩沖液平衡);樣品上樣完成以后，使用NATU-O緩沖液洗柱10個柱體積；順序使用 NATU-10, NATU-40, NATU-80, NATU-100, NATU-200, NATU-300, NATU-400 和 NATU-500緩沖液各洗柱I個柱體積。分步收集不同組分并電泳檢測，最終將含目的蛋白的組分混合在一起。(圖5)
實施例4:制備基于禽流感病毒H5N1抗原的多克隆抗體
(I)多克隆抗體制備
用PBS將蛋白稀釋為0.5mg/ml，每管1ml，分裝凍存于_20°C冰箱。第一天取Iml抗原加入Iml弗氏完全佐劑，乳化(檢驗乳化程度:將一滴乳化抗原液滴入生理鹽水中，若不散開，表明已達到要求)，頸背部皮下多點(至少8點)注射，免疫2只新西蘭大白兔。第15天，取Iml抗原加入Iml弗氏不完全佐劑，乳化(檢驗乳化程度:將一滴乳化抗原液滴入生理鹽水中，若不散開，表明已達到要求)，頸背部皮下多點(至少8點)注射，免疫2只新西蘭大白兔。第29天，取Iml抗原加入Iml弗氏不完全佐劑，乳化(檢驗乳化程度:將一滴乳化抗原液滴入生理鹽水中，若不散開，表明已達到要求)，頸背部皮下多點(至少8點)注射，免疫2只新西蘭白兔。第43天，取Iml抗原加入Iml弗氏不完全佐劑，乳化(檢驗乳化程度:將一滴乳化抗原液滴入生理鹽水中，若不散開，表明已達到要求)，頸背部皮下多點(至少8點)注射，免疫2只新西蘭大白兔。第53天，頸動脈取血，將兔子處死，兔血在4°C放置過夜，離心(4°C, 1000Orpm) 30分鐘，收集上清。
[0027]取出ProgeinA柱(柱體積5ml)，用25mlPBS平衡，待pbs流干后，血清上樣過柱，收集流穿；用25mlPBS平衡，流干后，加入25ml洗脫液，分管收集洗脫峰，每管Iml樣品，每管加入90ul IM Tris溶液(pH8.8)中和；加入25mlPBS平衡，流感后加入2ml的20%乙醇，4度保存柱子；將抗體洗脫液用PBS透析過夜，Elisa檢測效價，將含有航提的組分合并；合并后的抗體檢測蛋白濃度(紫外吸收法)及Elisa效價。
[0028](2)多克隆抗體效價、靈敏度及特異性檢測 包被:把蛋白用包被液稀釋成lug/ml, IOOul/孔加至酶標板，4°C過夜；封閉，棄去包被液，自來水沖洗I遍，用封閉液封閉，每孔200ul，37°C放置1.5小時；加樣品，棄去封閉液，自來水沖洗I遍，將梯度稀釋的抗體加入酶標板，lOOOul、孔，37°C放置I小時(空白兔抗體作為陰性對照);自來水沖洗10遍，拍干；加酶標二抗，為酶標羊抗兔IgG，用封閉液稀釋，IOOul/孔，37°C放置30分鐘；自來水沖洗10遍，拍干；加顯色液TMB,即用即配，IOOul/孔，37°C放置15分鐘；終止反應，于各反應孔中加入2M的硫酸，50ul/孔；酶標儀讀數，450nm波長測定。(圖6)
制得的基于H5N1亞型禽流感病毒的NSl蛋白多克隆抗體具有效價高、特異性好的特點，可以滿足H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白的相關檢測試驗，并能在試驗中檢測出H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白，相關檢測試驗包括免疫印跡(Western-blotting)、免疫熒光及ELISA試驗等。
[0029]最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離權利要求書所限定的本發明的精神和范圍。
【權利要求】
1.基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白多克隆抗體，其特征在于:所述H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白具有如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，其對應的DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
2.基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白多克隆抗體的制備方法，其特征在于:所述制備方法包括以下步驟: (OH5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白制備 以H5N1亞型禽流感病毒核酸鏈為模板，通過PCR方法擴增獲得含有完整NSl基因開放閱讀框的目的片段，并克隆于表達載體中，得重組表達載體，將重組表達載體轉化入宿主細胞后誘導表達并純化，獲得H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白； (2)動物免疫 用步驟(1)所得H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白免疫動物，取血，得抗血清； (3)多克隆抗體的獲得 分離并提純步驟(2)所得抗血清NS1，得多克隆抗體。
3.根據權利要求2所述的基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白多克隆抗體的制備方法，其特征在于:步驟(1)中，提取H5N1亞型禽流感病毒核酸鏈為模板，以如SEQ ID N0.3所示的上游引物和SEQ ID N0.4所示的下游引物通過PCR方法擴增獲得含有完整NSl基因ORF的目的片段，并克隆于大腸桿菌原核表達載體，將重組質粒轉化入大腸桿菌宿主細胞后用IPTG誘導表達，經蛋白柱純化，獲得H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白。
4.根據權利要求2所述的基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白的多克隆抗體的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，用所得H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白作為免疫原免疫新西蘭大白兔，測血清效價并取血，得抗血`清。
5.根據權利要求2所述的基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，通過蛋白純化柱對步驟(1)所得抗血清IgG進行提取和純化，得多克隆抗體。
6.如權利要求1所述的基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白多克隆抗體在制備禽流感病毒檢測試劑中的應用。
7.如權利要求6所述的基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白多克隆抗體在制備禽流感病毒檢測試劑中的應用，其特征在于:所述多克隆抗體在制備禽流感H5N1病毒間接免疫熒光檢測試劑中的應用。
【文檔編號】C12N15/70GK103755803SQ201310514317
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年10月25日 優先權日:2013年10月25日
【發明者】蔣培余, 戴利成, 黃惠蓮 申請人:湖州師范學院