棉酚對新疆多浪羊淋巴細胞il-18基因表達影響的研究方法
【專利摘要】本發明涉及一種棉酚對新疆多浪羊淋巴細胞IL-18基因表達影響的研究方法，屬于生物【技術領域】。其具體方法和步驟如下：(1)分離和培養淋巴細胞；(2)提取總RNA；(3)合成cDNA；(4)cDNA的純化；(5)設計引物；(6)生成標準曲線；(7)根據2-△△CT法分析棉酚作用后的IL-18基因的表達；(8)分析研究不同濃度、不同時間下棉酚作用后表達量變化。該發明較好地分析研究了棉酚對新疆多浪羊淋巴細胞IL-18基因表達的影響，并能以此作為解除棉酚對新疆多浪羊危害方面研究的重要依據。
【專利說明】棉酚對新 疆多浪羊淋巴細胞jL-18基因表達影響的研究方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種棉酚對新疆多浪羊淋巴細胞IL-18基因表達影響的研究方法，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]新疆多浪羊產于喀什地區麥蓋提縣，該羊具有體格大、生長發育快、產肉率高、繁殖率高、遺傳性穩定等特點，被廣泛養殖于喀什和阿克蘇各縣市，是南疆畜牧業發展的主要養殖家畜之一。
[0003]棉酹(gossypol)是通過棉花中倍半職(十五碳)的法尼基焦磷酸環化后合成的次生代謝產物，存在于錦葵科某些植物的根、莖、種子中，曾作為男性節育藥為人們所熟知，具有明顯的誘導腫瘤細胞凋亡的能力，并能抑制細胞能量代謝導致細胞死亡。新疆是我國主要棉產區，而南疆的廣大牧民主要以棉副產品作為主要的飼料來源養殖綿羊，棉副產品中含有的棉酚會對綿羊的健康產生一定程度的影響，當超過一定量會使綿羊中毒甚至死亡，因而綿羊的棉酚中毒是亟待解決的問題。目前，解決綿羊棉酚中毒的問題大多是從飼養的角度入手，減少綿羊對棉副產品中棉酚的攝入量來解決棉酚中毒問題。綿羊對棉酚有一定的耐受現象，中毒后一段時間不攝入棉酚，綿羊的中毒癥狀會逐漸消失。為何會出現此現象，未見有相關研究來揭示其機理。因而，該研究試圖從免疫分子角度來揭示綿羊棉酚中毒后逐漸康復的機理，試圖從免疫學角度來解決綿羊棉酚中毒的問題。
[0004]IL-18是通過NK細胞的活性發揮抗腫瘤作用，對細胞的損傷具有修復作用，能顯著刺激TH1細胞產生干擾素，同時具有很強免疫調節作用。應用熒光定量PCR技術探討IL-18基因的mRNA表達量的變化，確定棉酚作用的最佳濃度和最佳作用時間，探討IL-18在綿羊棉酚損傷細胞中的變化規律，試圖尋找免疫分子在解除多浪羊棉酚中毒方面的作用。

【發明內容】

[0005]本發明通過對不同濃度的棉酚作用于新疆多浪羊淋巴細胞不同時間，應用熒光定PCR技術，分析棉酚對新疆多浪羊淋巴細胞IL-18基因表達的影響，確定棉酚作用的最佳濃度和最佳作用時間，探討IL-18在綿羊棉酚損傷細胞中的變化規律，試圖尋找免疫分子在解除多浪羊棉酚中毒方面的作用，并以此作為解除棉酚對新疆多浪羊危害方面研究的重要依據。
[0006]為了實現上述目的，本發明的技術方案如下:
[0007]—種棉酚對新疆多浪羊淋巴細胞IL-18基因表達影響的研究方法，具體方法和步驟如下:
[0008](I)分離和培養淋巴細胞:采集健康成年多浪羊新鮮抗凝血與Hank' s液等比例混勻，然后加一定體積的人淋巴細胞分離液，以2000g / min的離心速度離心20min后，得到淋巴細胞，然后將淋巴細胞懸浮于RPMI1640中混勻，分別于細胞培養瓶中加入棉酚，使終濃度為(5ymol / L、IOymol / L> 15 μ mo I / L>20 μ mo I / L>25 μ mo I / L>30 μ mo I /L、35ymol / L)于 37°C、C02 培養箱(5% CO2)中培養；
[0009](2)提取總RNA:采用Trizol法提取多浪羊外周血淋巴細胞的總RNA。不同濃度、不同時間棉酹作用的淋巴細胞培養液ImL /管分裝，以2000g / min,離心15min中后棄上清，加入ImLTrizol后充分混勻，室溫靜置5_10min裂解，然后加入200 μ L氯仿，渦旋15s，靜置2min，再以12000g離心15min，加500 μ L異丙醇，放在15_30°C的環境中孵育IOmin后，12000g離心10min,棄去上清,加入ImL的75%乙醇,潤旋混勻，4°C, 7500g離心5min,棄去上清液，室溫或真空干燥5~lOmin，然后將RNA溶于20 μ L的DEPC水中，55~60°C水浴IOmin,于_70°C保存，通過瓊脂糖凝膠電泳對所提取的總RNA進行檢測，并用核酸測定儀測定其濃度和純度；
[0010](3)合成cDNA:將檢測好的總RNA取出，放于冰盒中，去16 μ L總RNA為模板，加入dNTP2 μ L, Oligod(T) 2 μ L,混合后于65 °C溫浴5min后，置冰上2min，瞬時離心10s，然后再依次加入 5XPrimerscript buffer8 μ L, RNAse Inhibitorl μ L, PrimerscriptRTrase2 μ L，RNAsefree H209 μ L，總計40 μ L的反應體系，放入42°C水浴鍋孵育45min，再放入70°C水浴鍋，15min，保存于_20°C冰箱備用；
[0011](4 ) cDNA 的純化:米用 QIAquick PCR Purification Kit 進行 cDNA 的純化；
[0012](5)設計引物:用引物設計軟件oligo6.0對多浪羊IL-18基因進行引物設計，可以同時用primierf.0引物設計軟件對所設計引物的擴增效率進行分析，挑選最優引物。
[0013](6)生成標準曲線:將純化后的cDNA按原倍、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍的濃度梯度稀釋，使用 QuantiTect SYBR GEEN 試劑(Qiagen)進行 Real-timePCR (Real-time PCR儀-Light Cycler480)生成IL-18基因的標準曲線；以β-Actin基因作為參照，對棉酚作用后多浪羊淋巴細胞中IL-18基因的表達量的變化；反應體系如下=QuantiTect SYBR GEENMasterlOy L、H206 μ L、上下游引物各 I μ L, cDNA2 μ L ；
[0014](7)根據2_ΛΛετ法分析棉酚作用后的IL-18基因的表達:根據2_ΛΛετ來確定棉酚作用后的IL-18基因與未經棉酚作用的IL-18基因擴增曲線的差異及CT值的差異，確定棉酚對多浪羊淋巴細胞的影響；
[0015](8)分析研究不同濃度、不同時間棉酚作用后多浪羊淋巴細胞IL-18基因的表達量變化:用EXCEL表格進行分析，確定在不同棉酚濃度和作用時間下，最高的表達量，通過表達量來對比分析棉酚對多浪羊淋巴細胞IL-18基因表達的作用臨界點。
[0016]該發明的有益效果在于:該發明通過分析研究棉酚對新疆多浪羊淋巴細胞IL-18基因表達的影響，以此作為解除棉酚對新疆多浪羊危害方面研究的重要依據。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為本發明實施例中IL-18基因的標準曲線。
[0018]圖2為本發明實施例中IL-18基因的擴增曲線(用做標準曲線的樣品的擴增曲線)。
[0019]圖3為本發明實施例中IL-18基因的擴增曲線(所有樣品結果)。
[0020]圖4為本發明實施例中IL-18的溶解曲線(做標準曲線的稀釋后結果)。
[0021]圖5為本發明實施例中IL-18的溶解曲線(所有做標準曲線的稀釋后結果)。[0022]圖6為本發明實施例中IL-18的溶解曲線(做標準曲線后的溶解曲線)。
[0023]圖7為本發明實施例中IL-18的溶解曲線(所有做標準曲線后的溶解曲線的結果)。
[0024]圖8為本發明實施例中β -Actin的標準曲線。
[0025]圖9為本發明實施例中β-Actin的擴增曲線(用做標準曲線的樣品的擴增曲線)。
[0026]圖10為本發明實施例中β -Actin的擴增曲線(所有樣品結果)。
[0027]圖11為本發明 實施例中β -Actin的溶解曲線(做標準曲線的稀釋后結果)。
[0028]圖12為本發明實施例中β -Actin的溶解曲線(做標準曲線后的溶解曲線)。
[0029]圖13為本發明實施例中β-Actin的溶解曲線(所有做標準曲線的稀釋后結果)。
[0030]圖14為本發明實施例中5 μ mol / L棉酚作用后表達量變化圖。
[0031]圖15為本發明實施例中IOymol / L棉酚作用后表達量變化圖。
[0032]圖16為本發明實施例中Ιδμπιο? / L棉酚作用后表達量變化圖。
[0033]圖17為本發明實施例中20μπιΟ1 / L棉酚作用后表達量變化圖。
[0034]圖18為本發明實施例中25 ymol / L棉酚作用后表達量變化圖。
[0035]圖19為本發明實施例中30 ymol / L棉酚作用后表達量變化圖。
[0036]圖20為本發明實施例中35 ymol / L棉酚作用后表達量變化圖。
[0037]圖21為本發明實施例中Ih棉酚作用后表達量變化圖。
[0038]圖22為本發明實施例中2h棉酚作用后表達量變化圖。
[0039]圖23為本發明實施例中3h棉酚作用后表達量變化圖。
[0040]圖24為本發明實施例中4h棉酚作用后表達量變化圖。
[0041]圖25為本發明實施例中5h棉酚作用后表達量變化圖。
【具體實施方式】
[0042]下面結合附圖進一步闡述該發明的【具體實施方式】。
[0043]實施例
[0044]本實施例中，實驗動物為新疆多浪羊，來源于塔里木大學動物科學學院試驗站。實驗所需試劑有，RPM1-1640(Gibco31800-022)、青霉素(山西泰盛制藥有限公司)、鏈霉素(新泰生物有限公司)、3-5%的枸櫞酸鈉(實驗室配置)、噻唑喃(四甲基偶氮唑藍，Volsen公司)、人淋巴細胞分離液(中國醫學科學院生物工程研究所)、MTT(上海源葉生物科技有限公司)、DMS0 (Sigma公司)，PBS緩沖液(實驗室配置)，質粒提取試劑盒(promega公司)，SYBR Green Realtime PCR 試劑盒(購自 QIAGEN 公司)。
[0045]本實施例中，所需儀器:電子天平(BS124S北京市賽凝膠多利斯儀器系統有限公司)；超凈工作臺(SW-CJ-2F型上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；全自動攝影生物顯微(DP70+B10-olysLIA日本奧林巴斯)；電子萬用爐(DL-1型北京永光明醫療儀器廠)；紫外可見分光光度(Golds54型上海棱光技術有限公司);PCR儀；電泳槽(DYCZ-28A北京六一儀器廠)；電腦三恒多用電泳儀(DYY-60C型北京市六一儀器廠)；凝膠成像分析系統(Tanon-4100上海天能科技有限公司)，移液器(德國Eppendorf公司),RealtimePCR儀-Light Cycler480 (Roche 公司)。[0046]本實施例的具體方法和步驟如下:
[0047](I)分離和培養淋巴細胞:采集健康成年多浪羊新鮮抗凝血與Hank' s液等比例混勻，然后加一定體積的人淋巴細胞分離液，以2000g / min的離心速度離心20min后，得到淋巴細胞，然后將淋巴細胞懸浮于RPMI1640中混勻，分別于細胞培養瓶中加入棉酚，使終濃度為(5ymol / L、IOymol / L> 15 μ mo I / L>20 μ mo I / L>25 μ mo I / L>30 μ mo I /L、35ymol / L)于 37°C、C02 培養箱(5% CO2)中培養；
[0048](2)提取總RNA:采用Trizol法提取多浪羊外周血淋巴細胞的總RNA。不同濃度、不同時間棉酹作用的淋巴細胞培養液ImL /管分裝，以2000g / min,離心15min后棄上清，加入ImL Trizol后充分混勻，室溫靜置5_10min裂解，然后加入200 μ L氯仿，渦旋15s，靜置2min,再以12000g離心15min,加500 μ L異丙醇,放在15_30°C的環境中孵育IOmin后，12000g離心10min,棄去上清,加入ImL的75%乙醇,潤旋混勻，4°C, 7500g離心5min,棄去上清液，室溫或真空干燥5~lOmin，然后將RNA溶于20 μ L的DEPC水中，55°C~60°C水浴IOmin,于_70°C保存，通過瓊脂糖凝膠電泳對所提取的總RNA進行檢測，并用核酸測定儀測定其濃度和純度；
[0049](3)合成cDNA:將檢測好的總RNA取出，放于冰盒中，去16 μ L總RNA為模板，加入dNTP2 μ L, Oli god(T) 2 μ L,混合后于65 °C溫浴5min后，置冰上2min，瞬時離心10s，然后再依次加入 5XPrimerscript buffer8 μ L, RNAse Inhibitorl μ L, PrimerscriptRTrase2 μ L，RNAsefree H209 μ L，總計40 μ L的反應體系，放入42°C水浴鍋孵育45min，再放入70°C水浴鍋，15min，保存于_20°C冰箱備用；
[0050](4) cDNA 的純化:米用 QIAquick PCR Purification Kit 進行 cDNA 的純化。
[0051](5)設計引物:用引物設計軟件oligo6.0對多浪羊IL-18基因進行引物設計，可以同時用primierf.0引物設計軟件進行所設計引物的擴增效率的分析，挑選最優引物，擴增@-Actin、IL-18基因片段引物見表1。
[0052]表1
[0053]
GenePrimer sequenceSize (bp)
β-Actin SenseY CTGCC CTGAG GCTCT CTT 3?124 bp

Antisense: 5， CGTGT TGGCG TAGAG GTCTT T 3，
IL-18 Sense:5’- TGTCTTTGAGGATATGCC -35133 bp
Antisense:5、AGACATTTTCTTACACTGC -3，
[0054](6)生成標準曲線:將純化后的cDNA按原倍、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍的濃度梯度稀釋，使用 QuantiTect SYBR GEEN 試劑(Qiagen)進行 Real-time PCR (Real-time PCR儀-Light Cycler480)生成IL-18基因的標準曲線。圖1為IL-18基因的標準曲線；圖2，圖3為IL-18基因的擴增曲線，圖4、圖5、圖6、圖7為IL-18基因的溶解曲線；圖8為β -Actin基因的標準曲線，圖9、圖10為β-Actin的擴增曲線，圖11、圖12、圖13為β-Actin的溶解曲線。
[0055]以β -Actin基因作為參照，反應體系如下:QuantiTect SYBR GEEN MasterlO μ L、Η206 μ L、上下游引物各1.0 μ L，擴增β -Actin、IL-18基因反應所需條件見表2。
[0056]表2
[0057]
【權利要求】
1.一種棉酚對新疆多浪羊淋巴細胞IL-18基因表達影響的研究方法，其特征在于:該方法的具體驟如下: (1)分離和培養淋巴細胞:采集健康成年多浪羊新鮮抗凝血與Hank's液等比例混勻，然后加一定體積的人淋巴細胞分離液，以2000g / min的離心速度離心20min后，得到淋巴細胞，然后將淋巴細胞懸浮于RPMI1640中混勻，分別于細胞培養瓶中加入棉酚，使終濃度為(5 μ mo 1 / L、1Oymol / L> 15 μ mo 1 / L>20 μ mo1 / L>25 μ mo 1/ L>30 μ mo .1 / L>.35 μ mo 1 / L)于 37。。、CO2 培養箱(5% CO2)中培養； (2)提取總RNA:采用Trizol法提取多浪羊外周血淋巴細胞的總RNA ;不同濃度、不同時間棉酹作用的淋巴細胞培養液ImL /管分裝，以2000g / min,離心15min中后棄上清，加入1mLTrizol后充分混勻，室溫靜置5-10min裂解，然后加入200 μ L氯仿，渦旋15s，靜置2min,再以12000g離心15min,加500 μ L異丙醇,放在15_30°C的環境中孵育1Omin后，.12000g離心10min, 棄去上清,加入ImL的75%乙醇,潤旋混勻，4°C, 7500g離心5min,棄去上清液，室溫或真空干燥5~lOmin，然后將RNA溶于20 μ L的DEPC水中，55~60°C水浴.1Omin,于_70°C保存，通過瓊脂糖凝膠電泳對所提取的總RNA進行檢測，并用核酸測定儀測定其濃度和純度； (3)合成cDNA:將檢測好的總RNA取出，放于冰盒中，去16 μ L總RNA為模板，加入dNTP2 μ L, Oligod(T) 2 μ L,混合后于65°C溫浴5min后，置冰上2min，瞬時離心10s，然后再依次加入 5XPrimerscript buffer8 μ L, RNAse Inhibitorl μ L, PrimerscriptRTrase2 μ L，RNAsefree H209 μ L，總計40 μ L的反應體系，放入42°C水浴鍋孵育45min，再放入70°C水浴鍋，15min，保存于_20°C冰箱備用；
(4)cDNA 的純化:米用 QIAquick PCR Purification Kit 進行 cDNA 的純化； (5)設計引物:用引物設計軟件oligo6.0對多浪羊IL-18基因進行引物設計，可以同時用primierf.0引物設計軟件對所設計引物的擴增效率進行分析，挑選最優引物； (6)生成標準曲線:將純化后的cDNA按原倍、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍的濃度梯度稀釋，使用 QuantiTect SYBR GEEN 試劑(Qiagen)進行 Real-time PCR(Real-time PCR儀-Light Cycler480)生成IL-18基因的標準曲線；以β-Actin基因作為參照，對棉酚作用后多浪羊淋巴細胞中IL-18基因的表達量的變化；反應體系如下=QuantiTect SYBR GEENMasterlOy L、H206 μ L、上下游引物各 1 μ L, cDNA2 μ L ； (J)根據2_ΛΛεt法分析棉酚作用后的IL-18基因的表達:根據2^夂1來確定棉酚作用后的IL-18基因與未經棉酚作用的IL-18基因擴增曲線的差異及CT值的差異，確定棉酚對多浪羊淋巴細胞的影響； (8)分析研究不同濃度、不同時間棉酚作用后多浪羊淋巴細胞IL-18基因的表達量變化:用EXCEL表格進行分析，確定在不同棉酚濃度和作用時間下，最高的表達量，通過表達量來對比分析棉酚對多浪羊淋巴細胞IL-18基因表達的作用臨界點。
【文檔編號】C12Q1/02GK103952464SQ201310537999
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2013年10月29日 優先權日:2013年10月29日
【發明者】李蓮瑞, 王娟娟, 潘伊微, 賈山嶺, 徐宏偉, 曾國航, 李瑋 申請人:塔里木大學