一種鑒定大麗輪枝菌弱致病型的核酸和引物對及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種核酸，該核酸具有SEQ?ID?NO：1所示的序列。本發明還提供了擴增如上所述的核酸的引物對。本發明還提供了一種鑒定真菌菌株致病型的方法，所述真菌菌株為大麗輪枝菌，該方法包括以下步驟：（1）制備含有大麗輪枝菌的全基因組DNA的待測樣本；（2）以步驟（1）中得到的全基因組DNA待測樣本為模板，使用如上所述的引物對進行PCR擴增；檢測擴增產物中是否存在SEQ?ID?NO：4所示的核酸；（3）根據步驟（2）的檢測結果判斷大麗輪枝菌菌株的致病型，在所述擴增產物中不存在SEQ?ID?No：4所示的核酸的情況下，則指示所述大麗輪枝菌的菌株屬于高致病型；在所述擴增產物中存在SEQ?ID?NO：4所示的核酸的情況下，則指示該大麗輪枝菌的菌株不屬于高致病型。
【專利說明】—種鑒定大麗輪枝菌弱致病型的核酸和引物對及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及農作物病害防治領域，具體地，涉及一種核酸、一種引物對、一種鑒定真菌菌株致病型的方法和一種試劑盒。
【背景技術】
[0002]大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)是一種植物致病真菌,它可以導致植物(特別是棉花)發生黃萎病等病害。但是，不同的大麗輪枝菌菌株的致病型差別很大，例如某些致病型高的菌株感染棉花后會導致棉花的嚴重病害而引起農田產量的下降，而某些致病型低的菌株感染棉花后僅導致棉花的輕微病害且對農田產量影響較小。此外，大麗輪枝菌的致病型還表現出一定的潛伏性，即當年感染的高致病型菌株可能不致病，而在次年大范圍地嚴重致病。
[0003]如果能夠檢測出農田中大麗輪枝菌的主要菌株類型，并對其致病型作出準確的判
斷，就可以結合藥物防治和輪作等農業手段抑制病害的發生，從而增加經濟效益和社會效益。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是解決如何準確判斷大麗輪枝菌菌株的致病型的技術問題，提供一種核酸、一種引物對、一種鑒定真菌菌株致病型的方法和一種試劑盒。
[0005]SEQ ID NO:1所示的序列為本發明人發現的在高致病型的大麗輪枝菌菌株的基因組序列中不出現而在低致病型的大麗輪枝菌的基因組序列中出現的序列。因而，對于某一致病型待測的大麗輪枝菌菌株，只要鑒定該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中是否存在SEQ ID NO:1所示的序列，即可獲知該大麗輪枝菌菌株是否為高致病型大麗輪枝菌。具體地，如果鑒定出該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中不存在SEQ ID NO:1所示的序列，則判斷該大麗輪枝菌菌株屬于高致病型；如果鑒定出該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中存在SEQ ID NO:1所示的序列，則判斷該大麗輪枝菌菌株不屬于高致病型。
[0006]為了實現上述目的，一方面，本發明提供一種核酸，該核酸具有SEQ ID NO:1所示的序列。
[0007]另一方面，本發明還提供了擴增如上所述的核酸的引物對，該引物對包括SEQ IDNO:2所示的正向引物和SEQ ID NO:3所示的反向引物。
[0008]另一方面，本發明還提供了一種鑒定真菌菌株致病型的方法，所述真菌菌株為大麗輪枝菌(Verticillium dahliae),該方法包括以下步驟:(I)制備含有大麗輪枝菌的全基因組DNA的待測樣本；(2)以步驟(1)中得到的全基因組DNA待測樣本為模板，使用如上所述的引物對進行PCR擴增；檢測擴增產物中是否存在SEQ ID NO:4所示的核酸；(3)根據步驟(2)的檢測結果判斷大麗輪枝菌菌株的致病型，在所述擴增產物中不存在SEQ ID No:4所示的核酸的情況下，則指示所述大麗輪枝菌的菌株屬于高致病型；在所述擴增產物中存在SEQ ID NO:4所示的核酸的情況下，則指示該大麗輪枝菌的菌株不屬于高致病型。[0009]另一方面，本發明還提供了一種試劑盒，所述試劑盒含有如上所述的引物對，以及PCR試劑和/或分子雜交試劑。
[0010]通過上述技術方案，本發明鑒定的高致病型的大麗輪枝菌的導致棉花發生黃萎病的平均病情指數為72.1 ;本發明鑒定的低致病型的大麗輪枝菌的導致棉花發生黃萎病的平均病情指數為10.5。
[0011]本發明的其他特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【具體實施方式】
[0012]以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0013]—方面，本發明提供一種核酸，該核酸具有SEQ ID NO:1所不的序列。
[0014]另一方面，本發明還提供了擴增如上所述的核酸的引物對，該引物對包括SEQ IDNO: 2所示的正向引物(5 ’ -GTTGATGGCTTGAAGATTGC-3 ’)和SEQ ID NO: 3所示的反向引物(5’ -GGCTTGACTCGGAAGGATAA-3’)。
[0015]另一方面，本發明還提供了一種鑒定真菌菌株致病型的方法，所述真菌菌株為大麗輪枝菌(Verticillium dahliae),該方法包括以下步驟:(I)制備含有大麗輪枝菌的全基因組DNA的待測樣本；(2)以步驟(1)中得到的全基因組DNA待測樣本為模板，使用如上所述的引物對進行PCR擴增；檢測擴增產物中是否存在SEQ ID NO:4所示的核酸；(3)根據步驟(2)的檢測結果判斷大麗輪枝菌菌株的致病型，在所述擴增產物中不存在SEQ ID No:4所示的核酸的情況下，則指示所述大麗輪枝菌的菌株屬于高致病型；在所述擴增產物中存在SEQ ID NO:4所示的核酸的`情況下，則指示該大麗輪枝菌的菌株不屬于高致病型。
[0016]其中，SEQ ID NO:4所示的核酸是SEQ ID NO:1所示的核酸的一個片段，它能夠通過上述引物對以SEQ ID NO:1所示的核酸為模板而PCR擴增得到。
[0017]其中，制備待測樣本的步驟可以按照本領域常規的制備用于檢測核酸的樣本的方法進行，本發明沒有特別的要求，例如可以從棉花植株上采集組織，并且將采集的組織在含有抗性的培養基上培養，并且篩選、辨別和分離大麗輪枝菌的菌落，然后按照(《植物基因工程》(何光源著，科學出版社，2007年出版))中所述的方法提取大麗輪枝菌的基因組DNA，即可制備得到待測樣本。
[0018]其中，檢測擴增產物中是否存在SEQ ID NO:4所示的核酸，可以按照本領域常規的方法和標準進行，例如可以通過核酸電泳方法或者實時定量PCR方法。
[0019]另一方面，本發明還提供了一種試劑盒，所述試劑盒含有如上所述的引物對，以及PCR試劑和/或分子雜交試劑。
[0020]以下將通過實施例對本發明進行詳細描述。以下實施例中，各種大麗輪枝菌的菌株屬于經過合法渠道獲得的遺傳資源。
[0021]實施例1
[0022]本實施例用于說明待測樣本的制備。具體地，是從80個不同的大麗輪枝菌菌株(編號為VDGl至VDG80)的基因組DNA的制備。
[0023]切取棉花植株離地表約10_35cm處的莖，切成Imm3左右大小的小塊，接種在在含有抗生素(氨芐青霉素、利福平和鏈霉素，濃度均為lOOyg/ml)的PDA培養基(含有馬鈴薯200g/L,葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L)上，25°C下培養7天，根據大麗輪枝菌的標準菌落形態鑒別大麗輪枝菌的菌落。得到鑒別的大麗輪枝菌的菌落即作為大麗輪枝菌菌株樣品。
[0024] 按照上述方法，從80個不同的棉花植株中取得80個不同的大麗輪枝菌菌株，將上述80個不同的大麗輪枝菌菌株按照《植物基因工程》(何光源著，科學出版社，2007年出版)中所述的方法，分別提取基因組DNA樣本，得到待測樣本1-80。
[0025]實施例2
[0026]本實施例用于說明上述80個不同的大麗輪枝菌菌株的致病型的檢測結果。
[0027]參照文獻(朱荷琴，馮自力，李志芳，趙麗紅，師勇強.蛭石沙土無底紙缽定量蘸菌液法鑒定棉花品種(系)的抗黃萎病性.中國棉花，2010,37(12):15-17)中的蛭石沙土無底紙缽定量蘸菌液法，對實施例1中所述的80個不同的大麗輪枝菌菌株進行棉花苗期致病型鑒定。以所述的80個不同的大麗輪枝菌菌株在接種健康棉花植株后的病情指數來表征致病型的高低。
[0028]具體地，將大麗輪枝菌在查比克培養基(2g/L的NaNO3, lg/L的K2HPO4,0.5g/L的KCl, 0.5g/L的MgSO4,0.0 lg/L的FeSO4, 30g/L的蔗糖，20g/L的瓊脂)上培養至產生孢子，用無菌水洗下孢子得到孢子懸液，并將孢子懸液中的孢子濃度調整至5X IO6個/ml。然后，播種在紙缽的棉花幼苗至少有一片真葉展開時接種，向紙牒底部注入IOmL孢子懸浮液，將紙缽放入紙牒中，接種棉苗30株以上。接種后4周發病情況，調查采用5級分級法，分級標準:0級，健苗、無病狀；1級，1-2片子葉表現病狀、子葉變黃、真葉不顯病狀；2級，子葉和I片真葉表現病狀；3級、2片真葉表現病狀；4級，全部葉片表現病狀，嚴重時葉片脫落，頂心枯死。
[0029]根據調查結果，計算出病情指數，公式如下所示:
【權利要求】
1.一種核酸，其特征在于，該核酸具有SEQ ID NO:1所示的序列。
2.一種引物對，其特征在于，該引物對包括SEQ ID NO:2所示的正向引物和SEQ ID NO:3所示的反向引物。
3.—種鑒定真菌菌株致病型的方法，所述真菌菌株為大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae),其特征在于,該方法包括以下步驟: (O制備含有大麗輪枝菌的全基因組DNA的待測樣本； (2)以步驟(1)中得到的全基因組DNA待測樣本為模板，使用權利要求2所述的引物對進行PCR擴增；檢測擴增產物中是否存在SEQ ID NO:4所示的核酸； (3)根據步驟(2)的檢測結果判斷大麗輪枝菌菌株的致病型，在所述擴增產物中不存在SEQ ID No:4所示的核酸的情況下，則指示所述大麗輪枝菌的菌株屬于高致病型；在所述擴增產物中存在SEQ ID NO:4所示的核酸的情況下，則指示該大麗輪枝菌的菌株不屬于高致病型。
4.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有根據權利要求2所述的引物對，以及PCR試劑。
【文檔編號】C12Q1/68GK103602677SQ201310587324
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月20日 優先權日:2013年11月20日
【發明者】戴小楓, 李蕾, 陳捷胤, 馬雪峰, 孔志強, 包郁明, 祁偉彥, 桂月晶, 肖紅利 申請人:中國農業科學院農產品加工研究所