一種微生物細胞轉化法生產2-酮基-d-葡萄糖酸的方法
【專利摘要】本發明提供一種微生物細胞轉化法生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，包括：A：以氧化葡萄糖酸桿菌DSM?2003的基因工程菌株為菌種制備靜息細胞，其中，所述基因工程菌株是指過表達葡萄糖酸脫氫酶的氧化葡萄糖酸桿菌，葡萄糖酸脫氫酶的基因來源于所述氧化葡萄糖酸桿菌，具有如SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列；B：制備含有葡萄糖或葡萄糖酸的轉化液，葡萄糖的濃度為200～250g/L，葡萄糖酸的濃度為200～300g/L；C：向所述轉化液中加入30～60g/L靜息細胞進行轉化，即得所述2-酮基-D-葡萄糖酸。本發明提供的方法具有轉化率高、產物單一、分離純化簡單、節約生產成本、細胞易回收、可重復利用等優點。
【專利說明】一種微生物細胞轉化法生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物細胞轉化領域，更具體地涉及一種微生物細胞轉化法生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法。
【背景技術】
[0002]2_酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid, 2-KGA)是目前國際上大規模生產的有機酸之一，主要用作D-異抗壞血酸(EA)及其鹽類(如D-異抗壞血酸鈉，EN)的合成前體，而EA和EN作為維生素C的同分異構體，具有很強的抗氧化性，作為一種可代謝抗氧化劑，其防腐效果大大超過維生素C，而價格不到維生素C的二分之一，應用前景十分廣泛。目前，EN已作為一種新型的食品抗氧、防腐和保鮮劑廣泛應用于肉類、水果、飲料等食品中。2-KGA還具有多種工業用途，如飼料添加劑，洗滌劑的促進劑，水泥增塑劑和攝影顯影劑等。
[0003]目前，2-KGA的生產方法主要有化學合成法、酶法和發酵法(如US3255093)三種。
[0004]美國專利US2153311報道了一種利用鉻酸和硫酸鐵為催化劑的2-KGA的化學合成方法，但此過程反應時間長(12h~3d)、產量低(40%)。美國專利US4620034和US6018034還報道了一種化學合成方法，即利用金屬Pt/Pb作為催化劑，在通入O2的條件下將葡萄糖氧化形成2-KGA。此方法雖然大大縮短了反應的時間，但是底物投料量很低(只有5%左右)，而且反應條件控制嚴苛，生成的產物易降解。
[0005]美國專利US4351902公開了一種以葡萄糖為原料，使用吡喃糖_2_氧化酶、葡萄糖-2-氧化酶和葡萄糖-1-氧化酶催化的兩步氧化反應生產2-KGA的方法。酶法合成中，雖然在較低的底物濃度(50g/ L)下即可得到90%以上的轉化率，但此方法因為酶的制作成本高，限制了實現規模化生產，而且反應過程中會生成過氧化氫，這對酶活產生不利影響，底物濃度無法提高。
[0006]發酵法是指利用微生物發酵過程直接將底物(如葡萄糖)轉化成2-KGA。目前2-KGA的工業生產中最廣泛采用的方法是發酵法。發酵法生產中，一般通過流加底物，最高的2-KGA生產水平達到7.66g/L/h，底物濃度達到300_400g/L。發酵法具有生產條件溫和、易放大、生產成本相對較低等優點。但是，發酵法生產過程仍然存在以下幾個方面的問題:(I)發酵周期長，一般需要幾十到上百小時；(2)發酵過程放熱量大，冷卻循環水用量大，能耗高；(3)發酵液組成比較復雜，提取成本較高；(4)廢渣產量相對較大，菌絲體過濾困難，活性炭、珍珠巖等物質用量大，副產物給企業帶來處理壓力。
[0007]因此，有必要提供一種更環保、經濟、高效的2-酮基-D-葡萄糖酸的生產方法。

【發明內容】

[0008]本發明的目的是提供一種微生物細胞轉化法生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，從而解決現有技術中2-酮基-D-葡萄糖酸的化學合成法反應時間長、產量低、反應條件嚴苛，酶法生產成本高、生成過氧化氫影響酶活，以及發酵法發酵周期長，放熱量大，提取成本較高，廢渣處理量大的缺陷。[0009]為了解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案:
[0010]提供一種微生物細胞轉化法生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，包括以下步驟:A:以氧化葡萄糖酸桿菌DSM 2003的基因工程菌株為菌種制備靜息細胞，其中，所述氧化葡萄糖酸桿菌DSM 2003的基因工程菌株是指過表達葡萄糖酸脫氫酶的氧化葡萄糖酸桿菌，所述葡萄糖酸脫氫酶的基因來源于所述氧化葡萄糖酸桿菌DSM 2003，具有如SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列:制備含有葡萄糖或葡萄糖酸的轉化液，所述轉化液中葡萄糖的濃度為200~250g/L，葡萄糖酸的濃度為200~300g/L ;C:向所述含有葡萄糖或葡萄糖酸的轉化液中加入步驟A中制備的所述靜息細胞進行轉化，所述靜息細胞的加入量為30~60g/L，即得所述2-酮基-D-葡萄糖酸。 [0011]所述氧化葡萄糖酸桿菌DSM 2003的基因工程菌株的構建所采用的是PBBR1MCS5質粒。
[0012]所述氧化葡萄糖酸桿菌DSM 2003的基因工程菌株的構建所采用的是tufB啟動子。
[0013]所述氧化葡萄糖酸桿菌DSM 2003的基因工程菌株的構建包括以下步驟:以氧化葡萄糖酸桿菌DSM 2003的基因組DNA為模板，PCR擴增獲得葡萄糖酸脫氫酶的gadh基因片段；將質粒PBBR1MCS5以Sac1、XbaI酶切，然后與同樣經過SacI，XbaI酶切的tufB啟動子連接，得到重組表達質粒PBBRlMCS5-PtufB ;將所述擴增獲得的gadh基因片段以Xbal、BamHI酶切，然后與同樣經Xbal、BamHI酶切的PBBRlMCS5_PtufB載體連接，得到重組表達質粒pBBRlMCS5-PtufB_gadh ;將所述重組表達質粒pBBRlMCS5_PtufB-gadh電轉化至氧化葡萄糖酸桿菌DSM 2003中，獲得所述氧化葡萄糖酸桿菌DSM 2003的基因工程菌株。
[0014]步驟A中，所述靜息細胞的制備是將所述菌種通過發酵培養至對數末期，冷凍離心，PBS緩沖液洗滌兩次，收集菌體，從而獲得去除營養成分的靜息細胞。
[0015]步驟C中，所述轉化的溫度為28~32°C，時間為20~24h。
[0016]優選地，所述轉化的溫度為30°C。
[0017]步驟C還包括在反應過程中用2M NaOH溶液調節反應溶液的pH使其維持在6.0。
[0018]所述轉化液中葡萄糖的濃度為200g/L，所述氧化葡萄糖酸桿菌DSM 2003的基因工程菌株的靜息細胞的加入量為60g/L。
[0019]所述轉化液中葡萄糖酸的濃度為300g/L，所述氧化葡萄糖酸桿菌DSM 2003的基因工程菌株的靜息細胞的加入量為30g/L。
[0020]本發明中，靜息細胞是指將在生長培養基上培養至一定時間后、用適當的方法收集并用緩沖液進行洗滌的微生物細胞，是去除營養成分、終止生長的微生物細胞。
[0021]本發明公開了一種微生物細胞轉化法生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，提供的氧化葡萄糖酸桿菌工程菌能快速且幾乎等量地轉化葡萄糖或葡萄糖酸生成2-KGA，本發明中2-KGA的最大濃度達到297.2g/L以上，時空產率達到llg/L/h，是所有專利和文獻報道的最高值。相比現有技術中的發酵法生產，使用靜息細胞催化法生產具有轉化率高、產物單一、分離純化簡單、節約生產成本、細胞易回收、可重復利用等優點。
【具體實施方式】
[0022]以下結合具體實施例，對本發明做進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發明而非用于限制本發明的范圍。
[0023]本發明中所采用的微生物菌株為一株氧化葡萄糖酸桿菌(保藏號DSM 2003)的基因工程菌，該基因工程菌是指過表達了葡萄糖酸脫氫酶的氧化葡萄糖酸桿菌。
[0024]本發明中所采用的過表達了葡萄糖酸脫氫酶的氧化葡萄糖酸桿菌的具體構建方法如下:
[0025](I)引物設計:根據葡萄糖酸脫氫酶，即SEQ ID NO:1所述的基因序列，設計擴增葡萄糖酸脫氫酶基因(gadh)的PCR引物gadh_f和gadh_r。根據文獻報道的氧化葡萄糖酸桿菌(G.0xydans621H)的PtufB啟動子的核苷酸序列，分別設計引物PtufB_f和PtufB_r (弓丨物由上海捷瑞生物工程有限公司合成)。引物序列如下:
[0026]gadh_f:5’-CTATCTAGAGGAGAAACCTGTGCCCCCCATG-3’ ；
[0027]gadh_r: 5，-GAGGGATCCTTCAGTTCAGTGAGACCGCATCATC-3，；
[0028]PtufB_f:5，-ACTGAGCTCCGATGGTAAGAAATCCACTGC-3，；
[0029]PtufB_r: 5，-ATATCTAGACCAAAACCCCGCTCCACC-3，。
[0030]為了便于與表達載體的酶切連接，引物gadh_f上引入XbaI酶切位點，引物gadh_r上引入BamHI酶切位點，引物PtufB_f上引入SacI酶切位點，引物PtufB_r上引入XbaI酶切位點。
[0031](2)基因gadh的克隆:將氧化葡萄糖酸桿菌培養18_22h，離心收集對數中后期的菌體，使用Tiangen公司的細菌基因組提取試劑盒，按照說明書上針對革蘭氏陰性菌的步驟進行操作，提取氧化葡萄糖酸桿菌基因組DNA。并以其為模板，gadh_f作為引物，PCR擴增gadh基因。并以PtufB_f^PPtufB_r作為引物，PCR擴增tufB啟動子。反應體系:5XBuffer5 μ 1，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μ l,dNTP 2 μ 1，DNA 模板 I μ 1，引物(10 μ mol/L)各 0.75 μ 1，加 ddH20 至總體積 25 μ I。
[0032](3)表達載體的構建:將質粒PBBR1MCS5以Sac1、XbaI酶切，然后與同樣經過SacI7XbaI酶切的tufB啟動子連接，得到重組表達質粒，命名為PBBRlMCS5_PtufB。將回收的gadh基因片段以Xba1、BamHI酶切，然后與同樣經Xba1、BamHI酶切的pBBRlMCS5_PtufB載體連接，得到重組表達質粒，命名為pBBRlMCS5-PtufB-gadh。得到的重組表達質粒PBBRlMCS5-PtufB-gadh經酶切鑒定，符合預期結果。最后對鑒定為正確的重組表達質粒PBBRlMCS5-PtufB-gadh進行測序，測序結果顯示，克隆入表達載體的葡萄糖酸脫氫酶基因gadh的序列與SEQ ID NO:1所示序列一致。
[0033](4)基因工程菌的構建:將獲得的重組質粒pBBRlMCS5-PtufB_gadh電轉化方法轉化至氧化葡萄糖酸桿菌G.0xydans DSM 2003,獲得基因工程菌G.0xydan (tuf-gadh),通過測序驗證該重組質粒構建正確。
[0034]在細菌中，使用質粒對膜蛋白進行表達，使其轉運并具有活性，是不易實現的。在表達載體的構建過程中，我們嘗試了多種質粒和啟動子，如PET系列質粒，pBBR系列質粒；如tufB啟動子，ndh2啟動子，gadh基因自身啟動子等等。將使用如上所述的質粒與啟動子構建的質粒進行比較，最后發現使用PBBR1MCS5質粒和tufB啟動子構建的基因工程菌株能夠過量表達有活性的膜蛋白且催化活性最好，故本專利使用PBBR1MCS5質粒和tufB啟動子。
[0035]基因工程菌G.0xydan (tuf-gadh)的發酵培養和靜息細胞制備，具體方法如下:[0036]培養基配方(g/L):山梨醇80，酵母粉 20，(NH4) 2S045，KH2PO4L 5，MgSO4.7Η200.5，蒸餾水1000mL。培養基于121°C滅菌20min后備用。
[0037](I)從固體培養基平板上挑取氧化葡萄糖酸桿菌基因工程菌的單菌落接種于含有25μ g/mL的硫酸慶大霉素的液體培養基試管中，在30°C，250rpm的搖床上培養至對數生長期(20-24h)作為種子液，然后按10%的比例轉接于含有同樣培養基的發酵罐中培養，pH5.0-6.0，30°C，400 ~600rpm，培養至對數末期。
[0038](2)將發酵罐培養的氧化葡萄糖酸桿菌，通過冷凍離心機，4°C，7000rpm離心20min收集起來。用20mM的pH5.8的PBS緩沖液洗滌兩次，再次收集菌體，獲得后續催化反應用的靜息細胞。 [0039]使用基因工程菌G.0xydan (tuf-gadh)的微生物細胞轉化法生產2-KGA的方法，具體如下:
[0040]實施例1:
[0041]7L發酵罐中轉入含有200g/L葡萄糖的水溶液，加入60g/L的靜息細胞，在30°C、空氣通氣量8L/min、攪拌轉速600rpm的條件下反應，反應過程中用2M NaOH溶液調節pH維持在6.0，21h左右上清液中葡萄糖轉化完全，2-KGA (鈉鹽)產率97.75%，濃度可達234.6g/L，時空產率為11.17g/L/h。
[0042]實施例2:
[0043]7L發酵罐中轉入含有250g/L葡萄糖的水溶液，加入60g/L的靜息細胞，在30°C、空氣通氣量8L/min、攪拌轉速600rpm的條件下反應，反應過程中用2M NaOH溶液調節pH維持在6.0，34h左右上清液中葡萄糖轉化完全，2-KGA(鈉鹽)產率94.74%，濃度可達284.22g/L，時空產率為8.36g/L/h。
[0044]實施例3:
[0045]7L發酵罐中轉入含有200g/L葡萄糖酸鈉的水溶液，加入30g/L的靜息細胞，在30°C、空氣通氣量8L/min、攪拌轉速600rpm的條件下反應，15h左右上清液中葡萄糖酸轉化完全，2-KGA (鈉鹽)濃度可達198.2g/L，時空產率為13.2g/L/h。
[0046]實施例4:
[0047]7L發酵罐中轉入含有300g/L葡萄糖酸鈉的水溶液，加入30g/L的靜息細胞，在30°C、空氣通氣量8L/min、攪拌轉速600rpm的條件下反應，27h左右上清液中葡萄糖酸轉化完全，2-KGA (鈉鹽)濃度可達297.2g/L，時空產率為llg/L/h。
[0048]以上實施例中，葡萄糖的測定在葡萄糖測定儀(S⑶-1V，山東省科學院生物中心制造)上完成。葡萄糖酸和2-酮基-D-葡萄糖酸的測定采用高效液相色譜(HPLC)分析方法，HPLC的操作條件如下:
[0049]色譜工作站:安捷倫1100
[0050]色譜柱:有機酸色譜柱87H3
[0051]流動相:0.008%硫酸
[0052]流速:0.4ml/min
[0053]檢測溫度:35°C
[0054]檢測波長:2IOnm
[0055]以上所述的，僅為本發明的較佳實施例，并非用以限定本發明的范圍，本發明的上述實施例還可以做出各種變化。即凡是依據本發明申請的權利要求書及說明書內容所作的簡單、 等效變化與修飾，皆落入本發明專利的權利要求保護范圍。本發明未詳盡描述的均為常規技術內容。
【權利要求】
1.一種微生物細胞轉化法生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其特征在于，包括以下步驟: A:以氧化葡萄糖酸桿菌DSM 2003的基因工程菌株為菌種制備靜息細胞，其中，所述氧化葡萄糖酸桿菌DSM 2003的基因工程菌株是指過表達葡萄糖酸脫氫酶的氧化葡萄糖酸桿菌，所述葡萄糖酸脫氫酶的基因來源于所述氧化葡萄糖酸桿菌DSM 2003，具有如SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列； B:制備含有葡萄糖或葡萄糖酸的轉化液，所述轉化液中葡萄糖的濃度為200~250g/L，葡萄糖酸的濃度為200~300g/L ； C:向所述含有葡萄糖或葡萄糖酸的轉化液中加入步驟A中制備的所述靜息細胞進行轉化，所述靜息細胞的加入量為30~60g/L，即得所述2-酮基-D-葡萄糖酸。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸桿菌DSM2003的基因工程菌株的構建所采用的是PBBR1MCS5質粒。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸桿菌DSM2003的基因工程菌株的構建所采用的是tufB啟動子。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸桿菌DSM2003的基因工程菌株的構建包括以下步驟: 以氧化葡萄糖酸桿菌DSM 2003的基因組DNA為模板，PCR擴增獲得葡萄糖酸脫氫酶的gadh基因片段；` 將質粒PBBR1MCS5以Sac1、XbaI酶切，然后與同樣經過SacI，XbaI酶切的tufB啟動子連接，得到重組表達質粒pBBRlMCS5-PtufB ； 將所述擴增獲得的gadh基因片段以Xba1、BamHI酶切，然后與同樣經Xba1、BamHI酶切的pBBRlMCS5-PtufB載體連接，得到重組表達質粒pBBRlMCS5_PtufB-gadh ； 將所述重組表達質粒pBBRlMCS5-PtufB-gadh電轉化至氧化葡萄糖酸桿菌DSM 2003中，獲得所述氧化葡萄糖酸桿菌DSM 2003的基因工程菌株。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟A中，所述靜息細胞的制備是將所述菌種通過發酵培養至對數末期，冷凍離心，PBS緩沖液洗滌兩次，收集菌體，從而獲得去除營養成分的靜息細胞。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟C中，所述轉化的溫度為28~32°C，時間為20~24h。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述轉化的溫度為30°C。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟C還包括在反應過程中用2MNaOH溶液調節反應溶液的PH使其維持在6.0。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉化液中葡萄糖的濃度為200g/L，所述氧化葡萄糖酸桿菌DSM 2003的基因工程菌株的靜息細胞的加入量為60g/L。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉化液中葡萄糖酸的濃度為300g/L，所述氧化葡萄糖酸桿菌DSM 2003的基因工程菌株的靜息細胞的加入量為30g/L。
【文檔編號】C12P7/58GK103627740SQ201310598049
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月22日 優先權日:2013年11月22日
【發明者】林金萍, 魏東芝, 李克非 申請人:華東理工大學