一株花生根際生防菌及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一株花生根際生防菌及其制備方法和應用。本發明公開的花生根際生防菌為活性菌株LX12，通過16SrDNA鑒定菌株LX12為側孢短芽孢桿菌，該菌株是從花生根際土壤中篩選出對真菌有拮抗性的細菌，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?7420。該菌株對病原菌有明顯的拮抗作用，對峙試驗顯示，本發明菌劑對花生根腐病、白絹病、瘡痂病和葉斑病菌等花生病害有顯著的抑制作用，盆栽和田間試驗顯示對花生根腐病、白絹病、瘡痂病和葉斑病菌均有明顯的防治效果。
【專利說明】一株花生根際生防菌及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一株花生根際生防菌及其制備方法和應用。【背景技術】
[0002]在對生防細菌的研究應用中，芽孢桿菌和假單胞菌是研究最為深入的兩種生防細菌。芽孢桿菌(Bacillaceae)是細菌的一科，能形成芽孢(內生孢子)的桿菌或球菌。包括芽孢桿菌屬、芽孢乳桿菌屬、梭菌屬、脫硫腸狀菌屬和芽孢八疊球菌屬等。它們對外界有害因子抵抗力強，分布廣，存在于土壤、水、空氣以及動物腸道等處。芽孢是休眠體，絕大多數是一個菌體僅形成一個芽孢芽孢位于菌體內，由核心、皮層、芽孢殼和外壁組成，為革蘭氏陽性菌。核心是芽孢的原生質體，內含DNA、RNA、可能與DNA相聯系的特異芽孢蛋白質以及合成蛋白質和產生能量的系統。此外，還有大量的吡啶二羧酸鈣布滿整個芽孢。由于芽孢具有厚而含水量低的多層結構，所以折光性強、對染料不易著色，芽孢對熱、干燥、輻射、化學消毒劑和其他理化因素有較強的抵抗力，這可能與芽孢獨具的高含量吡啶二羧酸有關。
[0003]芽孢桿菌作為微生物種群在自然界土壤中占有相對優勢，許多性狀優良的天然分離菌株已成功地應用于植物病害的生物防治。對于芽孢桿菌抑菌產物的探究，發現其拮抗物質主要包括主要為酶類的抗菌蛋白及次生代謝產生的抗菌素，另外還包含一部分揮發性的抗菌物質。
[0004]芽孢具有耐熱抗逆性是芽孢桿菌這一種群與其他種群進行區別的最明顯的特征。這有利于芽孢桿菌作為生防菌劑的生產、劑型加工及在環境中存活、定殖與繁殖。
[0005]作為芽孢桿菌屬的 側孢短芽孢桿菌，其主要有以下特點:
[0006]第一，能改善土壤微生態環境，促進團粒結構形成，改良土壤質地，增大革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌比率。革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的比率增加是土壤質量提高的標志。有效菌的大量繁殖產生粘性分泌物，增加土壤有機質，促進土壤團粒結構的形成，改善土壤的通透性、保溫性、保肥性。
[0007]第二，能刺激作物根系發育、促進作物生長，改善作物品質。在土壤中施入側孢短芽孢桿菌，通過其生命活動分泌各種胞外酶如幾丁質酶、蛋白酶、淀粉酶、碳解酶、半纖維素酶、脂肪酶等以及天然植物激素(如玉米素、生長素、赤霉素和異戊烯基腺嘌呤等)，促進作物對養分的吸收，把土壤中豐富的有機質分解為植物可以利用的營養物質，多種植物激素，刺激作物生長和根系發育，從而增產增收。促進葉片生長，增大光合作用的面積和強度，從而增加光合產物合成(即碳合成)促進根系生長，擴大根系吸收面積，增強根系活力，保證合成產物所需原料(N、P、K、Mg)。
[0008]第三，減輕病蟲害、降低農藥殘留。當大量的有益微生物被投放到土壤中，它們迅速增殖形成優勢群體，并在植物根際占據一定的空間，消耗可被病原菌利用的營養物質，大大削弱了病原菌的生長、繁殖，使病原菌失去競爭力，這是有益菌對病原菌的“競爭抑制作用”。側孢短芽孢桿菌在生命活動過程中，分泌蝕幾丁質酶、真菌，線蟲卵壁中含有相當數量的幾丁質，蝕幾丁質酶分解了壁中的幾丁質，使其原生質體流出失活，從而起到殺死病蟲的作用。增強供應的Ca、S1、K，使植物有關組織細胞壁增厚，纖維化、木質化程度提高，并在表皮層外形成角質雙硅層，形成一道阻止病菌侵襲的屏障。分泌的蝕幾丁質酶能裂解線蟲卵殼和真菌細胞壁，長期使用對線蟲、真菌病害防治效果與化學農藥基本相當，防病、抗病、抗重茬效果顯著。
[0009]第四，增強光合作用，提高化肥利用率，降低硝酸鹽含量。施用側孢短芽孢桿菌的作物葉綠素含量普遍高于對照，提高光合作用能力，可以充足供給作物蛋白質合成的碳架，促使吸收到植物體的氮素很快合成蛋白質，促進氮的轉化，少施化肥，提高花費利用率。氮素的迅速轉化導致植物體內硝酸鹽含量減少。
[0010]第五，固化若干重金屬，降低植物體內重金屬含量。有效菌的生命活動改變環境條件，其他元素狀態、有機質等，活化、固化了若干元素。
[0011]作為生防菌的主要生防機制，生防菌所分泌的抗生素起到了最為重要的作用，同時競爭作用和溶菌作用等也在發揮著各自的效果。然而生防菌在植物病害防治中也存在諸多問題，主要問題是在田間條件下生防菌達不到實驗室實驗效果，在田間具體施用時生防菌常常受到溫度、濕度、PH及農藥化肥的影響，具體表現在定殖力差、抗藥性差、穩定性差。
[0012]側孢短芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬，革蘭氏染色陽性，可變為陰性。彭清忠等在實驗中測定此類細菌革蘭氏染色結果隨著生長發育周期的變化而變化:在延遲期和靜止期時呈革蘭氏陰性，對數生長期時呈陽性。實驗中只取了對數生長期的菌種進行了測定，所以對革蘭氏染色的實驗結果不完全。芽孢桿菌具有繁殖快速、生命力強、安全無毒等特點；側孢短芽孢桿菌能分泌合成多種有機酸、酶、生理活性物質等。 [0013]關于側孢短芽孢桿菌對植物真菌的抑制機制研究在我國報道較少。趙秋敏等在2006年研究了側孢芽孢桿菌對小麥赤霉菌(Fusarium graminearum)、棉花立枯菌(Rhizoctonia solani)、蘋果輪紋菌(Physalospora piricola)、黑曲霉(Aspergilliumniger)、黑根霉(Rhizopus stolonifer)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)等病原真菌的抑制作用進行了研究，初步確定了抑菌物質為幾丁質酶。
[0014]近年來，生防細菌的應用日益受到研究人員的重視，其抑菌效果也隨著研究的進展得到了提高，在自然界中篩選獲得拮抗生防菌，進而通過生物技術的方法對其進行修飾或通過條件的改變使其抑菌效果增強，探究其使用方法，一般都是通過發酵的方法制成生物菌劑，發酵既可以生產生防菌，也可以通過發酵條件的改變生產抑菌物質，使科研成果運用到實際生產中。

【發明內容】

[0015]本發明解決的問題是利用實驗田花生根際土壤資源開發一種可用于植物病害防治的廣譜、高效、可產業化生產的活性菌株LX12，提供活性菌株LX12以及該菌株的培養、分離、鑒定、抑制真菌能力的測定以及在防治花生根腐病、白絹病、瘡痂病和褐斑病中的應用。
[0016]本發明參據的生物材料為LX12菌株，分類命名為側孢短芽孢桿菌(Brevibacillus Iaterosporus),已于2013年04月07日經檢測存活,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0017]具體地本發明的技術方案如下:[0018]一株花生根際生防菌，其特征在于，該菌株為活性菌株LX12，通過16SrDNA鑒定菌株LX12為側孢短芽孢桿菌，該菌株是從花生根際土壤中篩選出對真菌有拮抗性的細菌，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC7420。
[0019]本發明的活性菌株LX12經菌落和形態的顯微觀察、染色反應、常規生理生化特性實驗以及16SrDNA序列分析，鑒定為側孢短芽孢桿菌，具有以下特征:
[0020](I)形態觀察顯示:菌株LX12呈白色，邊緣整齊，有凸起，表面光滑濕潤，不透明。
[0021](2)生理生化特征測定:菌株LX12對數生長期時革蘭氏染色為陽性，能以檸檬酸鹽作為碳素的營養來源，具有過氧化氫酶活力，甲基紅試驗呈陽性，不能分解明膠、淀粉等大分子物質，葡萄糖發酵實驗呈陽性，蔗糖、乳糖發酵呈陰性。
[0022](3)通過16SrDNA鑒定菌株LX12為側孢短芽孢桿菌，為下一步對側孢短芽孢桿菌的探究奠定了基礎。
[0023]一株花生根際生防菌的分離方法，其特征在于，所述的分離方法為:稱取5g山東省花生研究所實驗田花生根際土壤放入45ml蒸餾水的三角瓶中，搖動片刻，吸取上層液0.1ml加入到含有4.5ml無菌水試管中，制成1:100濃度的懸液，然后分別西區10_2和10_3土壤懸濁液各0.2ml滴加到含利福平的LB固體培養基平板上，用涂布棒均勻涂布，并將培養基倒置于28°C恒溫培養箱培養1-2天。挑取平板上的一批單菌落于LB固體培養基平板上畫線倒置于28°C恒溫培養箱培養1-2天。
[0024]一株花生根際生防菌抑制真菌能力的測定方法，其特征在于，所述的測定方法包括如下步驟:
[0025](I)真菌的培養:在無菌操作臺中將花生根腐病菌、白絹病、瘡痂病和花生褐斑病菌用鑷子取約0.5cm*0.5cm的正方形小塊接種至PDA培養基中，于28°C溫室中倒置培養2-3 天。
[0026](2)接種細菌:挑取對真菌抑制效果最好的單菌落LX12進行真菌對峙實驗。待真菌長至約占培養皿1/3大小時在距離真菌l-2cm處接種細菌，繼續放置28攝氏度溫室培養2-3天，觀察真菌生長狀況。
[0027]上述的一株花生根際生防菌在防治花生花生根腐病、白絹病、瘡痂病和花生褐斑病菌中的應用。
[0028](I)菌株發酵液制備:將菌株活化后接入LB液體培養基，置于28度搖床中180r/min震蕩培養3d。
[0029](2)花生病原菌的接種:將保存的花生根腐病、白絹病、瘡痂病和花生褐斑病組織清洗干凈后用粉碎機磨碎，紗布過濾后與無菌土混合使孢子數量為106個/g土。缽體下層為無菌土，上層為菌土，厚度5cm左右。花生直接播種。
[0030](3)發病情況調查:播種前用LX12生防菌發酵液拌種，播種后15d、30d、45d利用LX12發酵液灌根，每個處理10盆，每盆3株，每盆每次澆稀釋100倍發酵液100mL。設置50%多菌靈800倍液和清水兩個對照。種植75天后調查花生根腐病、白絹病、瘡痂病和花生褐斑病的發病情況。
[0031]本發明的有益效果:
[0032]1.本發明側孢短芽孢桿菌對花生真菌病害和其它幾種植物常見病害有良好的抑制作用。[0033]2.本發明側孢短芽孢桿菌穩定性好培養方法簡單；
[0034]3.對峙試驗顯示，本發明側孢短芽孢桿菌對花生根腐病、白絹病、瘡痂病和褐斑病菌等花生病害有顯著的抑制作用，盆栽和田間試驗顯示對花生根腐病、白絹病、瘡痂病和褐斑病有明顯的防治效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1:LX12菌落形態特征圖
[0036]圖2:菌株 LX12 的 16srDNA 的 PCR 產物
[0037]圖3:活性菌株LX12的16srDNA序列與GenBank基因庫中短芽孢桿菌屬的側孢短芽孢桿菌的16srDNA序列同源性比對結果
[0038]圖4:菌株LX12與其在GenBank數據庫中相關屬種構建的以16SrDNA序列為基礎的系統發育樹
【具體實施方式】
[0039]1、活性菌株LX12的分離
[0040]稱取5g山東省花生研究所實驗田花生根際土壤放入45ml蒸餾水的三角瓶中，搖動片刻，吸取上層液0.1ml加入到含有4.5ml無菌水試管中，制成1:100濃度的懸液，然后分別西區10-2和10-3 土壤懸濁液各0.2ml滴加到含利福平的LB固體培養基平板上，用涂布棒均勻涂布，并將培養基倒置于28°C恒溫培養箱培養2天。挑取平板上的一批單菌落于LB固體培養基平板上畫線倒置于28°C恒溫培養箱培養2天。
[0041]其中，在LB培養基畫線培養一天后，菌落約0.3mm，呈白色，邊緣整齊，有凸起，表面光滑濕潤，不透明。如圖1所示。`
[0042]2、LX12細菌的生理生化鑒定
[0043]革蘭氏染色、檸檬酸鹽利用試驗、過氧化氫酶試驗、糖醇發酵試驗、淀粉水解試驗、明膠液化試驗、甲基紅試驗等參照《常見細菌系統鑒定手冊》進行生理生化鑒定。
[0044]LX12菌株的生理生化鑒定結果見表1，結果顯示LX12菌體表現為革蘭氏陽性，能以檸檬酸鹽作為碳素的營養來源，具有過氧化氫酶活力，甲基紅試驗呈陽性，不能分解明膠、淀粉等大分子物質。經比照文獻(方中達，1998 ;布坎南等，1984)，菌株LX12與側孢短芽孢桿菌的生理生化特性基本一致，初步確定該菌株為側孢短芽孢桿菌。
[0045]表1活性菌株LX12的生理生化特征
[0046]
1......鑒定項 π............1......結果.......................................1......鑒 >? 項 π...........].....結果.......................................]......鑒走項 π...........]......結果.......................................1
革μ氏染I+I過氧化鋱I+I葡萄糖發I +
__mm
淀粉水解-_it橡酸鹽+__庶糖發酵-_
[0047]注:“ + ”表示反應結果為陽性；“一”表示反應結果為陰性。
[0048]Reference: “ +，，present positive result; “-，，present negative result.[0049]3、細菌的16SrRNA分子學鑒定
[0050]3、I菌株DNA提取
[0051]選取對真菌具有拮抗活性的細菌菌株，挑取10個相同的菌落做重復，進行基因組DNA的提取，其提取方法主要參照TIANGEN TIANamp BACTERia DNA Kit試劑盒說明書進行，并略加修改，步驟如下:
[0052](I)取細菌培養液lmL，1000Orpm離心lmin，盡量吸凈上清；
[0053](2)向菌體沉淀中加入200 μ L緩沖液GA，震蕩至菌體徹底懸浮；
[0054](3)加入 4 μ LRNAase (100mg/mL)溶液，震蕩 15s,室溫放置 5min ；
[0055](4)向管中加入20 μ L蛋白酶K溶液，混勻； [0056](5)加入220 μ L緩沖液GB，震蕩15s，70°C放置lOmin，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠；
[0057](6)加入220 μ L無水乙醇，充分震蕩混勻15s，此時可能出現絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠；
[0058](7)將上一步所得的溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱GB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm離心30s，倒掉廢液將吸附柱CB3中放入收集管中；
[0059](8)向吸附柱CB3中放入500 μ L緩沖液⑶(使用前檢查是否加收入無水乙醇)，12000rpm離心30s，倒掉廢液將吸附柱CB3中放入收集管中；
[0060](9)向吸附柱CB3中放入700 μ L漂洗液PW (使用前檢查是否加收入無水乙醇)，12000rpm離心30s，倒掉廢液將吸附柱CB3中放入收集管中；
[0061](10)向吸附柱CB3中放入500 μ L漂洗液PW，12000rpm離心30s，倒掉廢液將吸附柱CB3中放入收集管中；
[0062](11)將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2min，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；
[0063](12)將吸附柱CB3轉入干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200 μ L洗脫緩沖液TE，室溫放置5min, 12000rpm離心2min,將溶液收集到離心管中，-20°C保存。
[0064]3、2PCR與序列測定
[0065](I)提取的 DNA 參照 TaKaRa 公司的 16srDNABacterial Identification PCR Kit試劑盒說明書進行PCR擴增，其中正向引物為:5 ’ -AGAGTTTGATCATGG CTCAG-3 ’，反向引物為:3’ -CGCTTACCTTGTTACGACTT-5’。PCR 擴增條件如下:94°C預變性 5min ;94°C變性 Imin ；53°C退火lmin ;72°C延伸90s ;72°C后延伸5min，共30個循環。PCR產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后置于3UVTMTransilluminator (UVP, USA)下進行觀察。
[0066](2)根據預先設計的引物與預期擴增片段大小，結合Marker，目的片段在紫外燈下切割下來，用回收試劑盒SilicaBeadDNAGelExtractionKit進行DNA的回收。16srDNA序列測定由寶生物工程(大連)有限公司進行序列測定。通過BLAST程序將測定的序列與GenBank (NCBI,網站 http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中的序列比較，然后從GenBank中獲得和試驗菌株序列相近種、屬的16srDNA序列進行確定。
[0067]菌株LXl2 的 I6SrDNA 序列:
[0068](16 sF)GACGAACGGCGGGCGGGCGTGCTATACATGCAGTCGAGCGAGGGTCTTCGGACCCTAGCGGCG
【權利要求】
1.一株花生根際生防菌，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其特征在于，該菌株為活性菌株LX12，保藏編號為CGMCC 7420。
2.一種由權利要求1所述保藏編號為CGMCC 7420的花生根際生防菌制備的微生物菌劑。
3.—種如權利要求1所述的花生根際生防菌的制備方法，其特征在于，包含如下步驟: 步驟1)稱取5g花生根際土壤放入45ml蒸餾水的三角瓶中，搖動片刻，吸取上層液0.1ml加入到含有4.5ml無菌水試管中，制成1:100濃度的懸液； 步驟2)然分別吸取10_2和10_3 土壤懸濁液各0.2ml滴加到含利福平的LB固體培養基平板上，用涂布棒均勻涂布，并將培養基倒置于28°C恒溫培養箱培養1-2天； 步驟3)挑取平板上的一批單菌落于LB固體培養基平板上畫線倒置于28°C恒溫培養箱培養1-2天。
4.一種如權利要求1所述的花生根際生防菌抑制真菌能力的測定方法，其特征在于，包含如下步驟: 步驟1)真菌的培養:在無菌操作臺中，分別取0.5cm*0.5cm小塊的花生根腐病菌、白絹病、瘡痂病和花生褐斑病菌接種至PDA培養基中，于28°C溫室中倒置培養2-3天； 步驟2)接種細菌:挑取對真菌抑制效果最好的單菌落LX12進行真菌對峙實驗；待真菌長至約占培養皿1/3時，在距離真菌l_2cm處接種細菌，繼續放置28°C溫室中培養2_3天。
5.一種如權利要求1所述的花生根際生防菌在防治花生根腐病、白絹病、瘡痂病和花生褐斑病菌中的應用。
【文檔編號】C12R1/01GK103756930SQ201310643869
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月3日 優先權日:2013年12月3日
【發明者】遲玉成, 趙顯民, 許曼琳, 許婷婷, 吳菊香, 王磊, 謝宏峰, 焦坤 申請人:青島潤地豐科技有限公司, 山東省花生研究所