本發(fā)明涉及一種木霉菌種衣劑及其制備方法和應用，特別是關于生防型木霉菌生物種衣劑制備方法及在玉米莖腐病、紋枯病、根腐病防治中的應用技術。
背景技術：
：木霉菌是土壤和植物根際生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在的一種習居真菌。木霉是國際上公認的有益微生物，主要通過營養(yǎng)和空間競爭、抗生作用、重寄生作用和誘導抗性等機制防治各類作物的土傳病害，包括作物苗病、根腐病和枯萎病等。木霉菌不僅具有防治病害的功能，同時還具有促進植物根系生長、提高營養(yǎng)利用效率、提高作物產(chǎn)量和抗逆性、修復土壤等功能，是一種防病增產(chǎn)作用顯著的多功能微生物。近年來，玉米土傳病害，如玉米莖腐病和紋枯病發(fā)生逐年加重，一些地區(qū)通常年份的發(fā)病率為15-20％，嚴重年份發(fā)生率達40％以上，造成了嚴重的產(chǎn)量損失，并且已成為全國玉米產(chǎn)區(qū)優(yōu)質高產(chǎn)的主要威脅。不僅如此，由于玉米莖腐病的高發(fā)生率引發(fā)了嚴重的玉米倒伏現(xiàn)象，限制了玉米機械化生產(chǎn)技術的推廣。多年來國內外關于木霉菌生防菌劑主要以堆肥、顆粒劑等形式予以應用，以木霉菌制備種衣劑成功的報導較少，美國Biowork木霉菌生物種衣劑也僅應用于對玉米苗病的防治和提高玉米產(chǎn)量，而很少有研究用于防治玉米生育后期發(fā)生的莖腐病(Fusariumspp.,Pythiumspp.)和紋枯病(Rhizoctoniasolani)。由于玉米莖腐病菌和紋枯病菌侵染時期較長，從苗期到成株期均可侵染，而顯癥一般是在灌漿期以后，因此，這就要求生物防治過程中，微生物對土壤和作物根系具較長時間的定殖能力和系統(tǒng)誘導植物抗性的功能，從而實現(xiàn)微生物處理種子后能夠防治玉米生育后期病害的發(fā)生。技術實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種木霉菌種衣劑及其制備方法和應用，有效用于防治玉米莖腐病、紋枯病和根腐病等。本發(fā)明是從大量的木霉菌資源中篩選獲得的拮抗木霉菌株，在土壤中具有很強的競爭能力，有效抑制土壤中和根表病菌的繁殖和定殖，更為重要的是所篩選的菌株具有系統(tǒng)誘導抗性，即木霉菌隨著種子的萌發(fā)定殖于玉米根系，在根系內產(chǎn)生一系列的激發(fā)子來誘導根系內防御反應基因的系統(tǒng)表達，并且持效期可達到整個玉米生育期(吳曉等2015)，從而實現(xiàn)對莖腐病、紋枯病等后期病害的防治。因此，開發(fā)出能夠防治玉米土傳病害病的生防木霉菌種衣劑并在全國進行推廣使用對玉米的綠色防控具有十分重要的意義，應用前景廣闊。本發(fā)明的目的是通過如下技術方案實現(xiàn)的：第一方面，本發(fā)明提供一種木霉菌種衣劑，所述種衣劑包括木霉菌厚垣孢子發(fā)酵液、成膜劑、殼寡糖、申嗪霉素、腐殖酸；其中，每升木霉菌厚垣孢子發(fā)酵液中含13-17％(W/V)成膜劑、0.35-0.45％(W/V)殼寡糖，0.5-1.5ug/ml申嗪霉素、0.05-0.1％(W/V)腐殖酸。優(yōu)選地，每升木霉菌厚垣孢子發(fā)酵液中含1.0ug/ml申嗪霉素、0.06％(W/V)腐殖酸。優(yōu)選地，所述成膜劑包括853成膜劑。優(yōu)選地，所述木霉菌為哈茨木霉SH2303，保藏號：CTCCSJ-A-QT11266。優(yōu)選地，所述木霉菌厚垣孢子發(fā)酵液的制備包括如下：以0.5％(V/V)的接種量將一級菌種接種于木霉菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃發(fā)酵培養(yǎng)7天，即得；其中，所述一級菌種是將木霉菌菌餅以3-5片/三角瓶的接種量于PD培養(yǎng)基中、180r/min、28℃條件下培養(yǎng)5天獲得的。優(yōu)選地，所述木霉菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成包括：每1000升木霉菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中含玉米粉40kg、硫酸鎂400g、硫酸亞鐵6.0g、硫酸錳2.0g、硫酸鋅1.6g、硫酸二氫鉀3.06kg、硝酸鈉1.13kg、硝酸銨880g、氯化鈣800g，余量為水，初始pH調節(jié)為4-5。本發(fā)明所述的PD培養(yǎng)基及木霉菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基在使用前均經(jīng)121℃高壓滅菌25min。優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)的裝罐量控制在：200L液體發(fā)酵培養(yǎng)基裝入300L發(fā)酵罐中。第二方面，本發(fā)明提供一種所述種衣劑的制備方法，包括如下步驟：按所述比例將殼聚糖、申嗪霉素、腐殖酸、木霉菌厚垣孢子發(fā)酵液混合，然后加入成膜劑混合，即得種衣劑。第三方面，本發(fā)明提供一種所述木霉菌種衣劑作為生防制劑在控制玉米土傳病害中的應用。優(yōu)選地，所述土傳病害包括防治玉米莖腐病、紋枯病、根腐病等。第四方面，本發(fā)明提供一種所述木霉菌種衣劑在控制玉米土傳病害中的使用方法，具體為將所述木霉菌種衣劑與玉米種子按質量比為1:(10-15)均勻混合，即可。本發(fā)明經(jīng)過木霉菌初篩，復篩純化后保存于玻璃試管斜面中。在玉米粉培養(yǎng)液中進行液體發(fā)酵使其產(chǎn)生木霉菌厚垣孢子發(fā)酵液，將含有大量厚垣孢子的發(fā)酵液(1億CFU/mL)與成膜劑、殼寡糖、申嗪霉素、腐殖酸按照回應面設計獲得的最佳配比混合制成木霉菌種衣劑，包衣玉米種子(1:10-1:15W/W)，在溫室與田間進行播種。與對照相比，防治玉米土傳病害效果顯著，平均達60％以上。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：1.該木霉菌復合生物種衣劑中不僅有木霉菌厚孢子發(fā)酵液，同時還有殼寡糖和申嗪霉素(吩嗪-1-羧酸)兩種生物源農(nóng)藥成分。研究表明，木霉菌發(fā)酵液具有抑制鐮孢菌(Fusariumspp)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、腐霉菌(Pythiumspp)的作用同時誘導玉米抗性，殼寡糖(Chitosanoligosaccharide)具有誘玉米抗性的功能，而申嗪霉素具有抑制紋枯病菌的功能。2.木霉菌生物種衣劑是由三種生物源成分優(yōu)化組配而成，功能上優(yōu)勢互補，是一種防治玉米土傳病害的新型種衣劑；不僅對玉米莖腐病，紋枯病等有較明顯的防效，同時還對植物的生長指標有顯著的促進作用、提高植物抗逆性，增加作物產(chǎn)量。3.按照本發(fā)明提供的木霉菌生物種衣劑，按照一定比例要求包衣玉米種子并播種，對土壤無污染。在四川南充、寧夏銀川、河北石家莊、貴州遵義、遼寧丹東、江蘇南京等地田間試驗，木霉菌生物種衣劑對玉米莖腐病、紋枯病防效均能達到60％以上，玉米增產(chǎn)10％以上。4.本發(fā)明適用于大多數(shù)具有良好生防效果的木霉菌菌株，制作方法簡單，成本低，適合于不同規(guī)模生產(chǎn)，市場前景廣闊。附圖說明通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯：圖1是成膜劑種類篩選結果示意圖；圖2是本發(fā)明種衣劑貨架期測定結果示意圖。具體實施方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例11、平板菌種活化：將哈茨木霉SH2303接種于PDA培養(yǎng)皿中，28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4-5天。PDA培養(yǎng)基：200g馬鈴薯蒸煮后過濾的上層汁液，20g葡萄糖，20g瓊脂粉，純凈水定容至1L，每250mL分裝至500mL三角瓶，121℃高壓滅菌25min。2、一級菌種的制備：200g馬鈴薯，20g葡萄糖，純凈水1L，每250mL分裝至500mL三角瓶，121℃高壓滅菌25min。接入平板菌種，置于180r/min、28℃搖床中搖瓶培養(yǎng)5天，得到哈茨木霉SH2303液體發(fā)酵菌種。3、木霉菌液體發(fā)酵：玉米粉8kg、硫酸鎂80g、硫酸亞鐵1.2g、硫酸錳0.4g、硫酸鋅0.32g、硫酸二氫鉀0.61kg、硝酸鈉0.23kg、硝酸銨176g、氯化鈣160g，水補足200L，裝入300L發(fā)酵罐。培養(yǎng)基初始pH調節(jié)為4-5。121℃下高溫滅菌40-60min。接入重量比為0.5％的木霉菌液體發(fā)酵菌種，發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵時間7天，即為最終木霉菌厚垣孢子發(fā)酵液。4、木霉菌生物種衣劑制備：木霉菌發(fā)酵液1L，殼聚糖4g，申嗪霉素1mg，腐殖酸0.6g，充分混合。上述混合液與13％(W/V)成膜劑混合，即為木霉菌生物種衣劑。5、木霉菌生物種衣劑促進玉米幼苗生長作用溫室盆栽實驗結果顯示，與對照相比，種衣劑包衣處理后種子出苗率、植株株高和主根長都有一定程度的增加，增加率分別為6.32％、9.84％和3.34％，但均與對照差異不顯著(p>0.05)；其他各生長指標與對照差異顯著(表3)。表3種衣劑包衣處理對玉米生長的影響實施例21、平板菌種活化：將哈茨木霉菌SH2303接種于PDA培養(yǎng)皿中，28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4-5天。PDA培養(yǎng)基：200g馬鈴薯蒸煮后過濾的上層汁液，20g葡萄糖，20g瓊脂粉，純凈水定容至1L，每250mL分裝至500mL三角瓶，121℃高壓滅菌25min。2、一級菌種的制備：200g馬鈴薯，20g葡萄糖，純凈水1L，每250mL分裝至500mL三角瓶，121℃高壓滅菌25min。接入平板菌種，置于180r/min、28℃搖床中搖瓶培養(yǎng)5天，得到木霉菌液體發(fā)酵菌種。3、木霉菌液體發(fā)酵：玉米粉8kg、硫酸鎂80g、硫酸亞鐵1.2g、硫酸錳0.4g、硫酸鋅0.32g、硫酸二氫鉀0.61kg、硝酸鈉0.23kg、硝酸銨176g、氯化鈣160g，水補足200L，裝入300L發(fā)酵罐。培養(yǎng)基初始pH調節(jié)為4-5。121℃下高溫滅菌40-60min。接入重量比為0.5％的木霉菌液體發(fā)酵菌種，發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵時間7天，即為最終木霉菌厚垣孢子發(fā)酵液。4、木霉菌生物種衣劑的制備：木霉菌發(fā)酵液1L，殼聚糖4g，申嗪霉素1mg，腐殖酸0.6g，充分混合。上述混合液與17％(W/V)853成膜劑混合，即為木霉菌生物種衣劑。按藥種比1:10(W/W)拌種。以空白種衣劑(僅含成膜劑)為對照。5、生物種衣劑社區(qū)試驗：將培養(yǎng)于莖腐病鐮孢菌或紋枯病菌用麥粒培養(yǎng)基培養(yǎng)10天，在玉米播種時，接種在種子周圍，每穴2g麥粒接種物，每個處理接種50穴，重復三次，對照包衣空白種衣劑，待玉米進入灌漿期，考察對玉米莖腐病的發(fā)生率、計算防效。發(fā)病率％＝病株數(shù)/調查總株數(shù)×100％防效＝[(對照田的發(fā)病率-處理田的發(fā)病率)/對照田發(fā)病率]×100％社區(qū)試驗表明：生物種衣劑包衣處理后，病情指數(shù)由對照的70下降到45.83；枯葉數(shù)、早衰率均比對照低，差異均達極顯著水平(p<0.01)；倒伏率低于對照，差異均達到顯著水平(p<0.05)；穗垂率也低于對照，但差異不顯著(p>0.05)。表明種衣劑包衣后能減輕玉米莖基腐病的發(fā)生情況(表4)。進一步調查表明：木霉菌生物種衣劑對莖腐病和紋枯病防效明顯，對紋枯病防效達57.35％，對莖腐病的防效達到了75％。表4種衣劑對玉米莖腐病的防效表5種衣劑對紋枯病和莖腐病的防效處理紋枯病病株率(％)防效(％)莖腐病病株率(％)防效(％)重復113.5055.003.7575.00重復211.2562.503.7575.00重復313.6554.553.7575.00CK30.00----15.00----實施例31、平板菌種活化：將哈茨綠木霉SH2303接種于PDA培養(yǎng)皿中，28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4-5天。PDA培養(yǎng)基：200g馬鈴薯蒸煮后過濾的上層汁液，20g葡萄糖，20g瓊脂粉，純凈水定容至1L，分裝至250mL三角瓶，121℃高壓滅菌25min。2、一級菌種的制備：200g馬鈴薯，20g葡萄糖，純凈水1L，分裝至250mL三角瓶，121℃高壓滅菌25min。接入平板菌種，置于180r/min，28℃搖床中搖瓶培養(yǎng)5天，得到哈茨木霉SH2303液體發(fā)酵菌種。3、木霉菌液體發(fā)酵：玉米粉8kg、硫酸鎂80g、硫酸亞鐵1.2g、硫酸錳0.4g、硫酸鋅0.32g、硫酸二氫鉀0.61kg、硝酸鈉0.23kg、硝酸銨176g、氯化鈣160g，水補足200L，裝入300L發(fā)酵罐。培養(yǎng)基初始pH調節(jié)為4-5。121℃下高溫滅菌40-60min。接入重量比為0.5％的木霉菌液體發(fā)酵菌種，發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵時間7天，即為最終木霉菌厚垣孢子發(fā)酵液。4、木霉菌生物種衣劑制備：木霉菌發(fā)酵液1L，殼聚糖4g，申嗪霉素1mg，腐殖酸0.6g，充分混合。上述混合液與14％(W/V)853成膜劑混合，即為木霉菌生物種衣劑。按藥種比1：15(W/W)拌種。5、田間應用試驗：供試基地安排為貴州遵義、四川南充、河北石家莊等地。當?shù)刂髟缘挠衩灼贩N，種子均勻、發(fā)芽率正常。選擇歷年發(fā)生病蟲害較重，地勢平坦，不易積水，不易發(fā)生旱澇的地塊為供試田地塊；試驗設計采用隨機區(qū)組排列。結果表明：木霉菌生物種衣劑對這三種病害有較好的防效(表6)。表6木霉菌生物種衣劑防治土傳病害效果本發(fā)明種衣劑組分對不同病原菌都有不同程度的抑制和拮抗機理。本試驗通過不同濃度配比對比研究表明，殼聚糖濃度為3.5-4.5mg/mL、嗪霉素濃度為1ug/mL二者共同對玉米鐮刀菌有較為明顯的抑制作用，抑制率為53.3％。此濃度配比與木霉菌厚垣發(fā)酵液共同對鐮刀菌的抑制效果達到了62.9％。而在此基礎上，加入不同比例的腐殖酸，對病原菌的抑制作用有很明顯的不同。腐殖酸含量在0.05-0.1％(W/V)范圍內，組合配比對病原菌的防效與對照相比極顯著，同時比不加入腐殖酸的配比防效同樣差異顯著，防效明顯提高，達到73.5％。而在腐殖酸濃度低于0.05％(W/V)或高于0.1％(W/V)范圍時，防效明顯下降，甚至腐殖酸的加入對前者配比的抑制病菌作用有一定的副作用。因此，嚴格按照0.05-0.1％(W/V)的比例加入配比中制成復合型木霉菌種衣劑對病原菌有極明顯的防效。(表7a、表7b)同時，本發(fā)明種衣劑組分對玉米的生長有一定的促進作用。殼聚糖濃度為3.5-4.5mg/mL、嗪霉素濃度為1ug/mL二者共同對玉米胚根和胚芽生長有促進作用，但促進作用不明顯；而此濃度配比與木霉菌厚垣發(fā)酵液復合后，對玉米胚芽及胚根的生長都有明顯的促進作用；胚芽的生長量達到對照的兩倍，胚根伸長35.2％。在上述復合配比中加入一定比例的腐殖酸后，增效極為顯著，胚根伸長量增加52.6％，胚芽伸長量增加42.3％。而加入腐殖酸的量在0.05-0.1％(W/V)之外，對玉米胚根及胚芽的生長促進效果不明顯，甚至有抑制生長趨勢。這說明，腐殖酸在一定范圍內與木霉菌促生長機理存在協(xié)同作用。(表8a、表8b)通過優(yōu)化三元組合配方，并與成膜劑等載體混合制成生物種衣劑，制作方法簡便，成本低，適于不同規(guī)模生產(chǎn)使用。本發(fā)明通過優(yōu)化組合配方后，與成膜劑按照一定比例混合制成生物種衣劑。經(jīng)過試驗，不同成膜劑及其含量的不同對種衣劑的防病效果都有一定的影響。經(jīng)過篩選，選擇一種對生防木霉菌的生長無影響的成膜劑(圖1)。試驗表明，成膜劑853對木霉菌生長無副作用，甚至有一定的促進生長作用。本發(fā)明將通過對優(yōu)化組合后的配方與不同濃度853成膜劑混合，對鐮刀菌及立枯絲核菌進行抑菌率的測定(表9)。結果表明，不同濃度的853成膜劑在與上述優(yōu)化配比配方混合后，對病菌的抑制作用有明顯的影響。當成膜劑濃度范圍在13-17％(W/V)時，抑菌率為68％，差異極顯著。而濃度范圍在低于或高于此范圍時，抑菌半徑與對照相比差異顯著性不明顯甚至不顯著。這說明一定濃度成膜劑(丙烯酰胺改性合成聚合物)與上述優(yōu)化后的配方成分可能具有協(xié)同作用，促進某種物質或促進木霉菌的生防抑菌作用，從而對病原菌的抑制率明顯提高。本發(fā)明種衣劑與玉米種子按照不同比例進行配比，觀察不同配比處理對玉米苗期土傳病害的防治效果的影響，確定藥種比。由下表可知，不同藥種比包衣處理之間存在差異。對玉米苗期莖腐病和紋枯病均為藥種比1:10的包衣處理防效最高，相對防效分別為78％和67.59％。木霉單獨包衣不同劑量處理間防效差異較大，以藥種比1:20時相對防效最高，防效與劑量相關性不強。其中種衣劑藥種比1:10處理后紋枯病及莖腐病的病情指數(shù)遠遠低于對照和化學農(nóng)藥處理，分別為17.50和16.00，相對防效(67.59％)(78.00％)為最高。綜合分析，木霉菌生物型種衣劑包衣處理后，可降低玉米苗期病情指數(shù)，最佳配比為1:10，為后期的生長和抗病能力奠定了良好的基礎。注：處理①-③分別為種衣劑按1:10、1:20、1:40藥種比包衣種子；④-⑥以木霉固體發(fā)酵物按1:10、1:20、1:40藥種比包衣種子；⑦為化學農(nóng)藥惡霉靈；⑧空白對照(CK)。“-”為不存在。實施例41、平板菌種活化：將哈茨綠木霉SH2303接種于PDA培養(yǎng)皿中，28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4-5天。PDA培養(yǎng)基：200g馬鈴薯蒸煮后過濾的上層汁液，20g葡萄糖，20g瓊脂粉，純凈水定容至1L，分裝至250mL三角瓶，121℃高壓滅菌25min。2、一級菌種的制備：200g馬鈴薯，20g葡萄糖，純凈水1L，分裝至250mL三角瓶，121℃高壓滅菌25min。接入平板菌種，置于180r/min，28℃搖床中搖瓶培養(yǎng)5天，得到哈茨木霉SH2303液體發(fā)酵菌種。3、木霉菌液體發(fā)酵：玉米粉8kg、硫酸鎂80g、硫酸亞鐵1.2g、硫酸錳0.4g、硫酸鋅0.32g、硫酸二氫鉀0.61kg、硝酸鈉0.23kg、硝酸銨176、氯化鈣160g，水補足200L，裝入300L發(fā)酵罐。培養(yǎng)基初始pH調節(jié)為4-5。121℃下高溫滅菌40-60min。接入重量比為0.5％的木霉菌液體發(fā)酵菌種，發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵時間7天，即為最終木霉菌厚垣孢子發(fā)酵液。4、木霉菌生物種衣劑制備：木霉菌發(fā)酵液1L，殼聚糖4g，申嗪霉素1mg，腐殖酸0.6g，充分混合。上述混合液與14％(W/V)成膜劑混合，即為木霉菌生物種衣劑。5、對上述生物種衣劑進行貨架期的測定。哈茨木霉菌厚垣孢子發(fā)酵液中最初含孢量為2.5×108CFU/mL，以不加殼聚糖為種衣劑對照。結果表明，殼聚糖在種衣劑中不僅可以對病原菌有抑制作用，作為一種糖類物質，保護劑的一種，為種衣劑中的木霉菌孢子提供持續(xù)營養(yǎng)成分，使其貨架期延長，6個月后，孢子量可達1.56×108CFU/g，見圖2。以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的范圍內做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質內容。當前第1頁1 2 3