一種鑒定家鴨、番鴨和半番鴨的dna標記方法
【專利摘要】本發明提供一種鑒定家鴨、番鴨和半番鴨的DNA標記方法，主要涉及分析生物化學【技術領域】，本發明主要設計了一對引物P1，引物序列為：上游引物F：5'—CGTGCCCAACGAACTCTT—3'；下游引物R：5'—CAGGGCGAACATGTGGA—3'，經過PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳，可在鴨DNA特異性地擴增出約523bp的PCR條帶，再通過PCR—RFLP技術，最終觀察酶切結果。本發明所提供的標記方法具有快速、靈敏、特異等優點，可在家鴨、番鴨和半番鴨群體上提供一種可靠的鑒定方法。
【專利說明】一種鑒定家鴨、番鴨和半番鴨的DNA標記方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種有效鑒定家鴨、番鴨和半番鴨的DNA標記方法，屬于分析生物化學【技術領域】。
【背景技術】
[0002]DNA分子標記是以個體間核苷酸變異為基礎的遺傳標記，直接在DNA水平上檢測生物個體間的差異，是生物個體在DNA水平上遺傳變異的直接反映，與應用表型性狀、生產性能、生化標記等方法相比，更能真實的反映禽種的遺傳背景和親緣關系。利用家禽品種DNA遺傳標記技術，其結果可作為鑒定家禽品種真偽的科學依據。
[0003]DNA溯源技術使用的分子標記有AFLP (擴增片段長度多態性)標記、SSR (微衛星)標記和SNP (單核苷酸多態性)標記。SNP標記是1996年美國學者提出的第三代DNA分子標記。SNP是指基因組同一位點上單個核苷酸的變異，包括轉換、顛換、缺失和插入。SNP是可遺傳的變異中最常見的一種，具有分布廣密度高的特點，平均每1000個堿基便有I個SNP存在。SNP標記因分布廣泛，遺傳穩定，并且適宜高通量自動化分析，所以日益成為動物身份識別最受關注的分子標記，并逐步取代AFLP標記和SSR標記。
[0004]SNP標記是基因序列單個核苷酸發生變異而產生多態性的DNA分子標記，其是二等位基因多態，因此一個SNP理論上可以區分三個動物個體，包括兩個純合子和一個雜合子。本發明即利用SNP標記中的PCR-RFLP技術來區分家鴨、番鴨、半番鴨三類動物群體。該方法簡便快捷、安全可靠、費用低廉，從本質上有效鑒定和區分家鴨、番鴨和半番鴨三類鴨群體。
[0005]目前，在雛苗市場上，·品種來源不純、以次充好的現象時有發生，該方法的發明，對于有效解決市場上家鴨、番鴨和半番鴨品種混亂，有效保護家鴨、番鴨和半番鴨品種純正性和優良基因的流失均具有重要意義；同時，在一定程度上可以取代番鴨活體保種，為番鴨品種資源保存提供一種最安全、最可靠、維持費用最低的保存方法。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在于提供一種有效鑒定家鴨、番鴨和半番鴨的DNA標記方法，本發明主要利用SNP標記中的PCR-RFLP技術來有效區分家鴨、番鴨、半番鴨三類動物群體。
[0007]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
在含SNP酶切位點的鴨MClR基因編碼區設計一對Pl引物，引物序列為:
上游引物 F: 5’ 一 CGTGCCCAACGA ACTCTT — 3’ ；
下游引物 R: 5’ 一CAGGGCGAACATGTGGA— 3’。
[0008]一種鑒定家鴨、番鴨和半番鴨的DNA標記方法，其具體步驟包括:
Cl)靜脈采血，EDTA抗凝，-20°C保存；基因組DNA試劑盒提取總DNA，端粒酶(TE)溶解，_20°C保存備用；
(2)已設計好的引物上游引物:5’一GCCAGTGAGGGCAACCAGAG — 3’下游引物:5’一CTACCAGGAGCACAGCACCA — 3’分別對家鴨、番鴨和半番鴨的DNA進行擴增；產物回收、克隆并正反向測序；應用DNAStar中的SeqMan軟件對測序結果進行比對，搜索 SNP ；
(3)引物的設計
利用軟件Oligo 6.0和Primer Primer5.0，在含SNP酶切位點的鴨MClR基因編碼區設計一對引物P1，上游引物F與下游引物R ;預期擴增出約523bp的PCR條帶；
(4)PCR擴增
利用引物Pl對番鴨、半番鴨和家鴨基因組DNA進行PCR擴增，PCR反應體系為:2 XTaq MasterMix 12.5 μ L，上游引物 F I μ L，下游引物 R lyL，模板 DNA 2μ L，補充 ddH20至終體積25yL;PCR 反應條件:94 °C 5 min，94 °C 50 s，55.5°C 35 s，72°C 40 s，共 35個循環；72 V 10 min，4 °C保存；PCR產物經質量分數為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果；
(5)PCR-RFLP 檢測
取擴增產物5-6μ L，加入限制性內切酶Hin6 I I μ L, IOXBuffer I μ L，加ddH20至終體積10 μ L，37°C酶切反應過夜，酶切產物用質量分數為3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用DL1000 DNA Marker作為分子量的標準對照，觀察酶切結果，Bio-Rad凝膠成像系統觀察拍照保存，由帶型判斷基因型； (6)結果
利用引物Pl對3類鴨群體進行擴增、克隆測序比對，發現A399G位于限制性酶切Hin6 I的識別位點(G*CGC)，I個可用PCR-PFLP方法檢測SNP的鴨MClR基因標記，即為鑒定家鴨、番鴨和半番鴨的DNA標記方法。
[0009]鴨個體基因組DNA經引物Pl擴增電泳后，得到一條亮度強、前后無非特異性帶且大小與預期值吻合的523bp的目的條帶(圖1)，因此可繼續RFLP酶切分析。擴增產物有一個Hin6 I酶切位點，將產物切為334bp和189bp兩個片段，其中AA基因型顯示I條帶(523bp), GG基因型顯示2條帶(334bp+189bp),雜合子AG基因型顯示3條帶(523bp+334bp+189bp)。各種基因型如圖2所示。
[0010]測定的家鴨品種包括北京鴨、閩農白鴨、莆田黑鴨、山麻鴨、臺灣白改鴨、卡其康貝爾鴨。
[0011]本發明的優點在于:本發明方法可直接通過該DNA分子標記有效地區分家鴨、番鴨、半番鴨三類動物群體，可在家鴨、番鴨和半番鴨群體上提供一種可靠的鑒定方法，為鴨DNA基因庫的長期保存和利用提供一定的技術支撐。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1引物Pl擴增產物電泳結果。
[0013]圖2 PCR-RFLP 酶切圖譜。
【具體實施方式】
[0014]不同鴨群體基因型分布及等位基因頻率見表1。由表1可知，MClR基因A399G突變位點在家鴨、番鴨群體中分布非常單一，其中閩農白鴨、莆田黑鴨、北京鴨、山麻鴨、臺灣白改鴨、卡基康貝爾鴨等家鴨個體基因型全部為GG，只存在一種等位基因G ;白番鴨的基因型全部為AA，只存在一種等位基因A ;該位點在半番鴨群體中呈低度多態，基因型以AG為主(0.981)，少數為GG (0.019)，A、G等位基因相當。
[0015]本研究利用PCR-RFLP技術檢測了 8個品種/群體MClR基因A399G位點的多態性，結果表明，北京鴨、閩農白鴨、莆田黑鴨、臺灣白改鴨、卡其康貝爾鴨、番鴨等6個品種均表現為極端的單態分布，其中5個家鴨品種的基因型均為GG型；番鴨的基因型則全部為AA型。這表明A399G位點在家鴨、番鴨內相當保守的；但在兩者間卻完全不同，該位點G等位基因只出現在家鴨中，A/G突變事件并不發生在番鴨中，這為家鴨和番鴨起源于不同屬提供了新的佐證，說明家鴨與番鴨進化過程的某一階段在該位點上產生了分化，進而出現了不同的純合基因型。在本研究中，半番鴨雖具多態性，但屬極低度多態，基因型幾乎全為雜合子AG型，其頻率高達0.981 ；GG型只占0.019 (可忽略不計)；G等位基因頻率幾乎等于A等位基因，這可能與半番鴨為家鴨與番鴨屬間雜交產物有關，該位點的基因型介于兩親本之間。
[0016]表1不同鴨群體基因型及等位基因頻率
【權利要求】
1.一種鑒定家鴨、番鴨和半番鴨的DNA標記方法，其特征在于: 在含SNP酶切位點的鴨MClR基因編碼區設計一對Pl引物，引物序列為:
上游引物 F: 5’ 一CGTGCCCAACGA ACTCTT — 3’ ； 下游引物 R: 5’ 一CAGGGCGAA CATGTGGA — 3’。
2.一種鑒定家鴨、番鴨和半番鴨的DNA標記方法，其特征在于:其具體步驟包括: (1)對鴨子采用頸靜脈采血，EDTA抗凝，-20°C保存；基因組DNA試劑盒提取總DNA，端粒酶TE溶解，_20°C保存備用； (2)利用已設計好的引物 上游引物:5’一GCCAGTGAGGGCAACCAG AG—3'； 下游引物:5’ 一CTACCAGGAGCACAGCACCA— 3’，分別對家鴨、番鴨和半番鴨的DNA進行擴增；產物回收、克隆并正反向測序；應用DNAStar中的SeqMan軟件對測序結果進行比對，搜索 SNP ； (3)引物的設計 在含SNP酶切位點的鴨MClR基因編碼區設計一對引物P1，上游引物F與下游引物R ； (4)PCR擴增 利用引物Pl對番鴨、半番鴨`和家鴨基因組DNA進行PCR擴增，PCR反應體系為:2 XTaq MasterMix 12.5 μ L，上游引物 F I μ L，下游引物 R lyL，模板 DNA 2μ L，補充 ddH20至終體積25yL;PCR 反應條件:94 °C 5 min，94 °C 50 s,55.5°C 35 s，72°C 40 s，共 35個循環；72 V 10 min，4 °C保存；PCR產物經質量分數為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果；
(5)PCR-RFLP 檢測 取擴增產物5-6μ L，加入限制性內切酶Hin6 I I μ L, IOXBuffer I μ L，加ddH20至終體積10 μ L，37°C酶切反應過夜，酶切產物用質量分數為3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用DL1000 DNA Marker作為分子量的標準對照，觀察酶切結果，Bio-Rad凝膠成像系統觀察拍照保存，由帶型判斷基因型； (6)結果 利用引物Pl對3類鴨群體進行擴增、克隆測序比對，發現A399G位于限制性酶切Hin6 I的識別位點，I個可用PCR-PFLP方法檢測SNP的鴨MClR基因標記，即為鑒定家鴨、番鴨和半番鴨的DNA標記方法。
3.根據權利要求2所述的一種鑒定家鴨、番鴨和半番鴨的DNA標記方法，其特征在于:家鴨包括北京鴨、閩農白鴨、莆田黑鴨、山麻鴨、臺灣白改鴨、卡其康貝爾鴨。
【文檔編號】C12Q1/68GK103667489SQ201310676168
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月13日 優先權日:2013年12月13日
【發明者】鄭嫩珠, 辛清武, 繆中緯, 朱志明 申請人:福建省農業科學院畜牧獸醫研究所