專利名稱：鴨i型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的二重?zé)晒舛縭t-pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的二重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
鴨I型肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus type I,DHV I)是雛鴨的一種高度致死性的病毒性傳染病的病原。該病主要侵害4周齡以內(nèi)的雛鴨，死亡率高達(dá)90%以上，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。番鴨細(xì)小病毒(Muscovy duckling parvovirus,MDPV), 是危害番鴨養(yǎng)殖的重要病原，可引起I周齡-3周齡雛番鴨發(fā)病，致死率可達(dá)到50% -80%。 這兩種病毒是雛鴨最易感并且致死率也非常高的病毒。鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒是危害雛鴨的最重要病原，并且感染發(fā)病后致死率非常高，因此迫切需要建立一種快速敏感的鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒檢測(cè)方法，在感染早期就能檢測(cè)出這些病毒，從而為這些病的控制爭取寶貴的時(shí)間。目前，這兩種病毒的傳統(tǒng)檢測(cè)方法有血清中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和ELISA等，但這些檢測(cè)存在耗時(shí)長、敏感性較低、不易標(biāo)準(zhǔn)化等缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的局限性。熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)模板的定量，而且具有敏感、特異、準(zhǔn)確可靠、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)和實(shí)時(shí)性好等特點(diǎn)。在實(shí)際應(yīng)用中，當(dāng)樣品量非常大時(shí)，單重?zé)晒釶CR在成本和時(shí)間方面就存在一定的劣勢(shì)，迫切需要一種高通量、低成本、高效率的方法來進(jìn)行批量的快速檢測(cè)。多重?zé)晒釶CR采用多對(duì)引物擴(kuò)增檢測(cè)多個(gè)模板，克服了單重?zé)晒釶CR的不足。但是建立一個(gè)多重?zé)晒釶CR方法比單重的要復(fù)雜得多，其對(duì)試劑和引物的要求更高，同時(shí)需要保證不同探針?biāo)鶚?biāo)記的熒光基團(tuán)間無相互干擾，使用的熒光定量PCR儀具有相應(yīng)的多個(gè)檢測(cè)通道。目前，還未見有應(yīng)用多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)對(duì)鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒進(jìn)行檢測(cè)和診斷的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的二重?zé)晒?PCR的引物組。本發(fā)明提供的引物組，由引物I、引物2、引物3和引物4組成；所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列I、序列2、序列4和序列5。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供檢測(cè)鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的二重?zé)晒釶CR 的試劑。本發(fā)明提供的試劑由上述的引物組、探針A和探針B組成；所述探針A的核苷酸序列為序列表中的序列3，且所述探針A的5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料A，3’端標(biāo)記有淬滅熒光染料C ；所述探針B的核苷酸序列為序列表中的序列6，且所述探針B的5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料B，3’端標(biāo)記有淬滅熒光染料D。上述試劑中，所述報(bào)告熒光染料A為FAM，所述報(bào)告熒光染料B為ROX ;所述淬滅熒光染料C為BHQl，所述淬滅熒光染料D為BHQ2 ；所述試劑中所述引物I、所述引物2、所述探針A、所述引物3、所述引物4和所述探針B的摩爾比為3 : 3 : 3 : I : I : I。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種檢測(cè)鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的二重?zé)晒釶CR試劑B。本發(fā)明提供的試劑B，由上述的試劑A、PCR擴(kuò)增緩沖液和水組成。本發(fā)明提供的試劑B，所述引物I、所述引物2和所述探針A在所述試劑B中的濃度均為O. 6 μ M ；所述引物3、所述引物4和所述探針B在所述試劑B中的濃度均為O. 2 μ Μ。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種檢測(cè)鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的二重?zé)晒釶CR的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的引物組或上述的試劑A或上述的試劑B。上述的引物組或上述的試劑A或上述的試劑B或上述試劑盒在制備檢測(cè)和/或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有鴨I型肝炎病毒和/或番鴨細(xì)小病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述檢測(cè)和/或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有鴨I型肝炎病毒和/或番鴨細(xì)小病毒為用上述的試劑A或上述的試劑B或上述試劑盒對(duì)所述待測(cè)樣品進(jìn)行二重?zé)晒釶CR反應(yīng)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的引物和方法具有如下優(yōu)點(diǎn)I)檢測(cè)時(shí)間短本研究通過Primer Express 3. O軟件,設(shè)計(jì)了多套探針和引物,通過分析其引物之間的二聚體，篩選出了 2套探針和引物。對(duì)篩選出的2套探針和引物進(jìn)行不同濃度的配比，選出了其最佳引物和探針的濃度組合，建立了鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的二重?zé)晒舛縍T-PCR方法。該方法實(shí)現(xiàn)了一管二檢的目的，并且反轉(zhuǎn)錄和PCR是一步完成，僅需要約30分鐘的時(shí)間，并且反應(yīng)結(jié)果可以直接通過電腦觀察，而常規(guī)的RT-PCR方法起碼需要3. 5小時(shí)來完成擴(kuò)增反應(yīng)，然后需要花2小時(shí)進(jìn)行凝膠電泳來觀察結(jié)果；2)檢測(cè)敏感性高且特異性強(qiáng)當(dāng)鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒同時(shí)存在時(shí)，所建立的方法對(duì)其檢測(cè)的CT值與單個(gè)病毒檢測(cè)的CT值比較，結(jié)果基本一樣，并未影響對(duì)鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的檢出及檢出的敏感性。另外，建立的方法可以對(duì)樣品中相應(yīng)的病原含量進(jìn)行定量，并且檢測(cè)的敏感性非常高，均能檢測(cè)到200個(gè)拷貝的鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒，比常規(guī)PCR方法敏感性高10倍，可用于鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒疫苗和藥物療效的評(píng)估，以及其致病機(jī)理等方面的研究，因此該方法的建立對(duì)鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的防治有重要意義。


圖I為檢測(cè)鴨肝炎病毒的敏感性及標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2為檢測(cè)鴨肝炎病毒的敏感性及標(biāo)準(zhǔn)曲線圖3為檢測(cè)鴨I型肝炎病毒的特異性圖4為檢測(cè)番鴨細(xì)小病毒的特異性圖5為批內(nèi)重復(fù)性
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中所用一些材料和試劑如下Lightcycler2. O熒光定量PCR儀(Roche)。DNA片斷回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購自BioDev公司；pGEM_T Easy試劑盒購自Promega公司；T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 Fermengtas 公司；0ne Step PrimeScript RT-PCR Kit 購自大連寶生物公司；TIANamp 病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。鴨I型肝炎病毒AV2111株(以下簡稱為DHV I)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；番鴨細(xì)小病毒(MDPV)記載在“廣西番鴨細(xì)小病毒的分離和鑒定”，廣西畜牧獸醫(yī)， 2002，18 (6) :5-7，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；鴨圓環(huán)病毒記載在“廣西部分地區(qū)鴨圓環(huán)病毒感染情況調(diào)查”，中國畜牧獸醫(yī)， 2010,37(11) : 156-158，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；小鵝瘟病毒記載在“小鵝瘟病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立”，上海畜牧獸醫(yī)通訊，2008，160 (06) :30-31，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；新城疫病毒記載在“新城疫植物油乳劑苗的研究”，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，
(04):23-27，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；鴨瘟病毒AV1221株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；H9亞型禽流感病毒記載在“多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測(cè)鑒別H9亞型禽流感病毒方法的建立”，中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2006，(09) :858-860，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；實(shí)施例I、引物與Taqman探針的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的保守序列，采用Primer Express3. O軟件,設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物和兩條Taqmam探針(表I)。表I為引物和TaqMan探針序列(5 ’ _3 ’)
引物序列MDPVl590Tgagctctttgcttcagttgct (序列 I)MDPVI642cccacgggttttctttctctt (序列 2)MDPV1613TFAM-ctctgccttccagtccggacacatct-BHQl (序列 3)DHV82ggatacccaggagtacacgtaaaac (序列 4)DHVl34ctgtcaagctgggaggtgtc (序列 5)DHVl08TR0X-cccactggctttggagctgtgcc-BHQ2 (序列 6)實(shí)施例2、熒光定量RT-PCR檢測(cè)一、熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的確定I、樣本的制備I)、核酸的提取參照TIANamp病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書，提取鴨I型肝炎病毒 AV2111 (DHV I)、新城疫病毒和H9亞型禽流感的RNA，提取番鴨細(xì)小病毒、鴨圓環(huán)病毒、小鵝瘟病毒和鴨瘟病毒AV1221株的DNA。2)、RNA的反轉(zhuǎn)錄鴨I型肝炎病毒AV2111RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體如下建立如下反轉(zhuǎn)錄體系， 總反應(yīng)體積為20 μ L，上述I)的鴨I型肝炎病毒AV2111RNA為2yL(約20yg)，4yL 8mM MgCl2 (大連寶生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)DRR0019A)，2yL 10XPCR緩沖液(大連寶生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)DRR0019A)，2 μ L IOmM dNTP (四種堿基)，I μ L RNA抑制劑(大連寶生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)DRR0019A)，I μ L隨機(jī)引物(大連寶生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)DRR0019A)，I μ L AMV反轉(zhuǎn)錄酶(大連寶生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)=DRROO19Α)，用無Rnase水加至總體積為20 μ L,離心均勻，于25°C IOmin, 42°C 60min, 95°C 5min，4°C結(jié)束，得到鴨I型肝炎病毒AV2111cDNA。2、標(biāo)準(zhǔn)品的制備分別以上述得到的鴨I型肝炎病毒AV2111的cDNA和番鴨細(xì)小病毒的DNA為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為 50 μ L (含 O. 2mmol/L dNTP、2. 5mmol/L MgCl2、0. 5 μ mol/L 引物 (分別為表2)、1. 25U Taq聚合酶、IXPCR buffer、5 μ LDNA模板)，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性 5min，94°C 60s, 50°C 60s, 70°C 60s，35 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 IOmin0PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片斷后克隆至pGEM-T Easy載體，陽性克隆菌(pGEM-DHV和pGEM-MDPV)送大連寶生生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，pGEM_DHV菌中含有的PCR產(chǎn)物大小為234bp，具有序列表中序列11的第1-234位核苷酸(為DHV HDHVl-GD 株的3’端的UTR序列，genbank號(hào)為FJ157179. 1，第7379-7612位核苷酸)，說明為陽性克隆，含有DHV病毒；pGEM-MDPV菌中含有的PCR產(chǎn)物大小為571bp，具有序列表中序列12的第1-571位核苷酸(為MDPV FM株的r印基因，genbank號(hào)為NC_006147.2，第1157-1727位核苷酸)， 說明為為陽性克隆，含有MDPV病毒；表2試驗(yàn)所使用弓I物序列
權(quán)利要求
1.檢測(cè)鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的二重?zé)晒釶CR的引物組，由引物I、引物2、引物3和引物4組成；所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列I、序列2、序列4和序列5。
2.檢測(cè)鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的二重?zé)晒釶CR的試劑A，由權(quán)利要求I所述的引物組、探針A和探針B組成；所述探針A的核苷酸序列為序列表中的序列3，且所述探針A的5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料A，3’端標(biāo)記有淬滅熒光染料C ；所述探針B的核苷酸序列為序列表中的序列6，且所述探針B的5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料B，3’端標(biāo)記有淬滅熒光染料D。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑A，其特征在于所述報(bào)告熒光染料A為FAM，所述報(bào)告熒光染料B為ROX ;所述淬滅熒光染料C為BHQl ；所述淬滅熒光染料D為BHQ2 ；所述試劑中所述引物I、所述引物2、所述探針A、所述引物3、所述引物4和所述探針B 的摩爾比為3 : 3 : 3 : I : I : I。
4.檢測(cè)鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的二重?zé)晒釶CR試劑B，由權(quán)利要2或3所示的試劑A、PCR擴(kuò)增緩沖液和水組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所示的試劑B，其特征在于所述引物I、所述引物2和所述探針A在所述試劑B中的濃度均為0. 6 y M ;所述引物3、所述引物4和所述探針B在所述試劑B中的濃度均為0. 2 y M。
6.檢測(cè)鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的二重?zé)晒釶CR的試劑盒，包括權(quán)利要求I所述的引物組或權(quán)利要求2或3所述的試劑A或權(quán)利要求4或5所述的試劑B。
7.權(quán)利要求I所述的引物組或權(quán)利要求2或3所述的試劑A或權(quán)利要求4或5所述的試劑B或權(quán)利要求6所述試劑盒在制備檢測(cè)和/或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有鴨I型肝炎病毒和/或番鴨細(xì)小病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于所述檢測(cè)和/或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有鴨I型肝炎病毒和/或番鴨細(xì)小病毒為用權(quán)利要求2或3所述的試劑A或權(quán)利要求4 或5所述的試劑B或權(quán)利要求6所述試劑盒對(duì)所述待測(cè)樣品進(jìn)行二重?zé)晒釶CR反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的二重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明提供了檢測(cè)鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的二重?zé)晒釶CR的引物組，由引物1、引物2、引物3和引物4組成；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列1、序列2、序列4和序列5。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的引物和方法具有檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102586487SQ201210069199
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月15日
發(fā)明者劉加波, 龐耀珊, 范晴, 謝麗基, 謝志勤, 謝芝勛, 鄧顯文 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所