一種高產恩拉霉素菌株及其篩選方法
【專利摘要】本發明屬于工業生物技術、微生物菌種篩選【技術領域】，具體涉及一種高產恩拉霉素菌株及其篩選方法。本發明篩選出一株恩拉霉素高產菌株，其分類名為殺真菌鏈霉菌（Streptomyces?fungicidicus）DCS069，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會（CGMCC），保藏編號為CGMCC?No.6216，保藏日期是2012年6月14日。本發明公開的篩選方法包括如下步驟：(a)試管斜面培養；(b)菌絲培養；(c)原生質體制備；(d)原生質體微波處理；(e)原生質體再生培養；(f)菌株初篩；(g)菌株復試。本發明的有益效果是：本發明提供的篩選方法簡單高效，適合于工業生產。
【專利說明】一種高產恩拉霉素菌株及其篩選方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及工業生物技術、微生物菌種篩選【技術領域】，尤其是一種高產恩拉霉素菌株及其篩選方法。
【背景技術】
[0002]恩拉霉素(Enramycin)，又名安來霉素、恩來霉素、恩霉素、持久霉素，是由放線菌Streptomyces fungicidious發酵產生的一種由不飽和脂肪酸和十幾種氨基酸組成的環狀多肽類抗生素。最早由日本武田藥品工業株式會社研發，1974年在日本正式注冊。1993年，我國農業部批準該藥在我國注冊。2009年，其在中國的銷售額達到2億元人民幣。
[0003]恩拉霉素作為一種新型肽類抗生素，其抗菌作用機理是抑制細菌細胞壁的合成。由于只需要添加微量恩拉霉素就可以呈現出優良的促生長和改善飼料利用率的作用，并且具有穩定性、低毒性、長期使用后不易產生耐藥性等特點，因此被世界上很多國家推薦作為動物促生長劑，是一種較好的飼料添加劑。因此，對恩拉霉素高產菌株的選育和研究具有很好的經濟效益和社會效益。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種高產恩拉霉素菌株及其篩選方法。
[0005]為了完成上述目的，本發明采用的技術方案是:
[0006]—種高產恩拉霉素的菌株，分類名稱為殺真菌鏈霉菌(Streptomycesfungicidicus) DCS069,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC N0.6216，保藏日期是2012年6月14日。
[0007]該菌株單菌落為白色，邊緣整齊，孢子豐滿。
[0008]一種篩選高產恩拉霉素菌株的方法，包括以下步驟:
[0009]A、試管斜面培養:砂土管保藏的出發株轉接試管斜面，溫度28.0±0.5°C，濕度40%-60%恒溫室培養5-8天；
[0010]B、菌絲培養:將成熟的斜面接種于DC-S菌絲培養基中，28.0 ±0.5 °C，220rpm,培養40-50h，然后轉接于含有0.2-1.0%甘氨酸的DC-S菌絲培養基中，28.0±0.5°C，220rpm，培養 35-45h ；
[0011]C、原生質體制備:將制備得到的菌絲體在3000rpm離心IOmin,棄上清，收集菌絲體；用高滲緩沖液洗滌2次，加入終濃度為l_2mg/mL的溶菌酶，混合均勻，30°C保溫30-120min，過程中不斷振蕩混勻；然后用含有棉花的槍頭過濾酶解液，除去殘留菌絲體，收集濾液；在1000rpm轉速下離心5min,溫和的沉淀原生質體；再用高滲緩沖液洗漆原生質體一次，以洗凈酶液；棄去上清液，然后用適量高滲緩沖液重新懸浮原生質體；
[0012]D、原生質體微波處理:將制備好的原生質體懸液，轉移至滅菌的培養皿中，置于微波爐內進行微波處理；[0013]E、原生質體再生培養:經微波處理的原生質體進行稀釋、分離，稀釋度為10_4_10_7個/mL，稀釋液平鋪在R2YE再生培養基上，于28.0±0.5°C，40%_60%濕度條件下培養5_8天，培養時第一天正置，第二天起倒置培養；
[0014]F、菌株初篩:在再生培養基上挑取單菌落接種到斜面培養基上，于28.0±0.5°C,40%-60%濕度條件下培養5-8天；斜面成熟后接種到種子培養基中，于28.0±0.5°C,220rpm震蕩培養26-30h ;種液成熟后接種到發酵培養基中，相同條件下震蕩培養9-12天，生長到周期后檢測效價，選效價高的菌株進行砂土保藏；
[0015]G、菌株復試:取初篩保藏的菌株轉接試管斜面，于28.0±0.5°C，40%_60%濕度條件下培養5-8天，斜面成熟轉接至種子培養基中，于28.0 ±0.5°C，220rpm震蕩培養26_30h，種液成熟后轉接至發酵培養基中，于相同條件下震蕩培養9-12天，取樣檢測效價，篩選保留效價高的菌株為殺真菌鏈霉菌(Streptomyces fungicidicus) DCS069。
[0016]所述的步驟B中所用的DC-S菌絲培養基中成分及其含量為:0.5%葡萄糖，0.8%麥芽糖粉，0.4%蛋白胨，0.4%酵母粉，0.05%MgS04.7Η20，0.2%ΚΗ2Ρ04,0.4%Κ2ΗΡ04,0.3%氯化鈉。
[0017]所述的步驟D中微波處理條件為:調整微波爐功率為700W，脈沖頻率為2450Hz，對原生質體懸液進行輻照處理10s，取出冰上放置20s，反復進行以上步驟，至累計微波處理時間 60-120s。
[0018]本發明的有益效果是:該菌株搖瓶發酵9天時，檢測效價為8997U/mL，較出發株(相同條件下效價為6721U/mL)提高了 33.86%，篩選方法簡單高效，適合于工業生產。
【專利附圖】

【附圖說明】`
[0019]圖1是本發明的篩選方法流程圖。
[0020]圖2是本發明中原生質體鏡檢圖。
[0021]圖3是本發明中菌株DCS069試管斜面形態圖。
【具體實施方式】
[0022]本發明為一種高產恩拉霉素菌株及其篩選方法，該菌株搖瓶發酵9天時，檢測效價為8997U/mL，較出發株(相同條件下效價為6721U/mL)提高了 33.86%，篩選方法簡單高效，適合于工業生產。
[0023]下面結合附圖對本發明做進一步說明。
[0024]具體實施例，一種高產恩拉霉素的菌株，該菌株單菌落為白色，邊緣整齊，孢子豐滿，分類名稱為殺真菌鏈霉菌(Streptomyces fungicidicus)DCS069,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC N0.6216，保藏日期是2012年6月14日。
[0025]如圖1所示，一種篩選高產恩拉霉素菌株的方法，包括以下步驟:
[0026]A、試管斜面培養:培養基成分及其含量為:0.8%麥芽糖粉，0.08%干酵母粉，0.08%金槍魚膏，0.1%胰蛋白胨，0.3%氯化鈉，2%瓊脂。配制的溶液用30%氫氧化鈉溶液調節pH至6.7±0.I,按15mL/管分裝至30mmX200mm的試管中，同時加入2%瓊脂,然后依次加棉塞、兩層紗布，兩層牛皮紙將其包好，在0.11±0.05MPa、121 土 1°C條件下維持20min ;滅菌完畢后立即將培養基搖勻，降溫至手感不燙時，鋪成斜面，備用；[0027]以公司保藏菌株殺真菌鏈霉菌(Streptomyces fungicidicus) DCS056為出發株接斜面:取出DCS056砂土管，無菌條件下用接種針蘸取少量砂土孢子接種于試管斜面，于28.0±0.5°C，40%-60%濕度條件下培養7天。
[0028]B、菌絲培養:培養基成分及其含量為:0.5%葡萄糖，0.8%麥芽糖粉，0.4%蛋白胨，0.4% 酵母粉，0.05%MgS04.7Η20，0.2%ΚΗ2Ρ04,0.4%Κ2ΗΡ04,0.3% 氯化鈉；配好后按 40mL/250mL的三角瓶裝量分裝至三角瓶中，然后依次加棉塞、兩層紗布，兩層牛皮紙將其包好，在0.11 ±0.05MPa、121±l°C條件下維持 20min。
[0029]將步驟A中培養成熟的試管斜面接種于DC-S菌絲培養基中，28.0±0.5°C，220rpm,培養48h，然后以6%接種量轉接于含有0.4%甘氨酸的DC-S菌絲培養基中，28.0 ± 0.5 °C，220rpm,培養 45h。
[0030]C、原生質體制備:將制備得到的菌絲體在3000rpm離心IOmin,棄上清，收集菌絲體；用高滲緩沖液洗滌2次，加入終濃度為l_2mg/mL的溶菌酶，混合均勻，30°C保溫30-120min，過程中不斷振蕩混勻；然后用含有棉花的槍頭過濾酶解液，除去殘留菌絲體，收集濾液；在1000rpm轉速下離心5min,溫和的沉淀原生質體；再用高滲緩沖液洗漆原生質體一次，以洗凈酶液；棄去上清液，然后用適量高滲緩沖液重新懸浮原生質體。
[0031]D、原生質體微波處理:將制備好的原生質體懸液,轉移至滅菌的培養皿中，至于功率700W，脈沖頻率2450Hz的微波爐內輻照處理10s，然后取出冰上放置20s，反復進行以上步驟，至累計微波處理時間70s ;因為微波輻照可抑制或刺激蛋白質、DNA和RNA的合成以及細胞生長，也可擾亂DNA-蛋白質相互作用，造成DNA分子的氫鍵和堿基堆積化學力受損或者減弱，使DNA立體結構發生變化，并干擾修復機制甚而誘發染色體畸變和基因突變；而脫壁后的原生質體能敏感地接受外界環境因子(光、熱、機械損傷、其他射線等)刺激，對染色體和質粒DNA都有一定 的誘導效應，從而引起細胞內一系列化學反應，造成菌株遺傳性的改變，例如一些酶基因的表達、擴增或抑制，使產抗生素能力提高；原生質體形成和再生也是一個篩選過程，只有代謝旺盛的細胞才能生存和再生并形成菌落，通過篩選獲得了生物特性好，產量高的突變菌株；另外，原生質體的形成與再生使孢子形成受到影響，而孢子的形成往往與抗生素產生有關。
[0032]E、原生質體再生培養:經微波處理的原生質體用P buffer進行稀釋分離，使稀釋度為10-4-10-7個/mL，取0.2mL均勻平鋪在R2YE再生培養基上，于28.0±0.5°C，40%_60%濕度條件下培養5-8天，培養時第一天正置，第二天起倒置培養；所用的R2YE培養基、高滲緩沖液(P buffer)參照文獻“應用原生質體技術改良秦嶺鏈霉菌的研究(卞小瑩。西北農林科技大學，2007)”。
[0033]F、菌株初篩:Fp F2試管斜面配制同步驟A，種子培養基配制:種子培養基成分及其含量為，3.5%玉米粉，0.5%玉米蛋白粉，0.5%棉籽餅粉，2%輕質碳酸鈣，0.25%硫酸銨，0.036%硫酸亞鐵，0.125%磷酸二氫鉀，2.8%玉米漿；按比例稱好各種原材料(除玉米漿外)，于總體積30%的飲用水中攪拌均勻，倒入總體積50%的沸水中進行糊化；降溫至室溫時加入玉米漿，定容；用30%氫氧化鈉溶液調節pH至6.7 ±0.1，邊充分攪拌邊量取50mL分裝至500mL三角瓶中，用6 g棉塞、兩層紗布和一層牛皮紙封口 ；在0.ll±0.05MPal21±l°C條件下維持30min。
[0034]發酵培養基配制:發酵培養基成分及其含量為，12%玉米粉，4%玉米蛋白粉，0.5%輕質碳酸鈣，0.5%氯化鈉，0.3%硫酸銨，0.007%硫酸亞鐵，0.017%磷酸二氫鉀，0.3%尿素，
0.01%氯化鋅，0.15%氫氧化鉀，0.1%玉米漿，0.3%L-乳酸和0.07%耐高溫α -淀粉酶；按比例稱好各種原材料(玉米漿、乳酸、淀粉酶除外)，于總體積40%的飲用水中攪拌均勻，倒入總體積50%的沸水中進行糊化，然后加入淀粉酶進行液化，降溫至室溫時加入玉米漿和乳酸，定容；用氫氧化鈉溶液調節PH至5.9±0.1 (一般自然pH即可);邊充分攪拌邊量取50mL分裝至500mL三角瓶中，用八層紗布、一層牛皮紙包裝；在0.11±0.05MPal21 ± 1°C條件下維持 30min。
[0035]取步驟E中成熟的單菌落(形態飽滿、邊緣整齊)接種至Fl斜面培養基中，于28.0±0.5°C，40%-60%濕度條件下培養7天，成熟后用接種鏟挖取約0.5cm2 X 0.5cm2的F1斜面菌層，接種到種瓶培養基中，于28.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養26_30h，同時F1斜面保存于4°C冰箱中；種子成熟后按4%接種量接種到發酵培養基中，于28.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養9天；一般在發酵第3天時將F1斜面傳代F2斜面，培養條件同F1斜面；發酵到周期檢測效價，得到本發明菌株DCS069 (見圖2)，效價為9507U/mL。
[0036]上述菌株進行砂土保藏:向F2試管斜面加入2mL無菌水，用接種針將孢子刮下，搖勻df0.2mL孢子液轉移至空白砂土管中，注明菌號、制備日期和有效期，在-750~-760mmHg柱下抽干4-6h ;干燥的砂土管置于裝有變色硅膠的干燥器中，5±3°C保存。
[0037]在再生培養基上挑取單菌落接種到F1斜面培養基上，于28.0±0.5°C，40%_60%濕度條件下培養5-8天；斜面成熟后用接種鏟挖取約0.5cm2 X 0.5cm2的F1斜面菌層接種到種子培養基中，于28.0±0.5°C,220rpm震蕩培養26_30h，種瓶使用500mL三角瓶，培養基裝量為50mL，使用6g棉塞包兩層紗布；種液成熟后接種到發酵培養基中，相同條件下震蕩培養9-12天，發酵過程使用500mL三角瓶，培養基裝量為50mL，接種量為4%，用6g棉塞包兩層紗布封口 ；生長到周期后檢測效價，選效價高的菌株進行砂土保藏。
[0038]G、菌株復試:取保藏菌株的砂土管孢子轉接至試管斜面，于28.0±0.5°C，40%-60%濕度條件下培養7天，斜`面成熟后用接種鏟挖取約0.5cm2 X 0.5cm2菌層接種至種子培養基中，于28.0±0.5°C，220rpm條件下震蕩培養26-30h，種瓶采用500mL三角瓶，培養基裝量為50mL，用6g棉塞、兩層紗布封口 ；種子成熟后轉接至發酵培養基中，28.0±0.5°C,220rpm震蕩培養9天，發酵瓶采用500mL三角瓶，培養基裝量為50mL，接種量為4%，用6g棉塞、兩層紗布封口，發酵到周期后檢測效價，結果為8925、9028、9039U/mL，平均8997U/mL，較出發株DCS056(相同條件下效價為6774、6714、6676U/mL,平均6721U/mL)提高了 33.86%。
[0039]由此可見，本發明篩選菌株DCS069遠遠高于現有生產菌株。
【權利要求】
1.一種高產恩拉霉素的菌株,其特征在于:分類名稱為殺真菌鏈霉菌(Streptomycesfungicidicus) DCS069,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會，保藏編號為CGMCCN0.6216，保藏H期是2012年6月14日。
2.根據權利要求1所述的一種高產恩拉霉素的菌株，其特征在于:該菌株單菌落為白色，邊緣整齊，孢子豐滿。
3.一種篩選高產恩拉霉素菌株的方法，包括以下步驟: A、試管斜面培養:砂土管保藏的出發株轉接試管斜面，溫度28.0±0.5 °C，濕度40%-60%恒溫室培養5 -8天； B、菌絲培養:將成熟的斜面接種于DC-S菌絲培養基中，28.0±0.5°C，220rpm，培養40-50h，然后轉接于含有0.2-1.0%甘氨酸的DC-S菌絲培養基中，28.0±0.5°C，220rpm，培養 35-45h ； C、原生質體制備:將制備得到的菌絲體在3000rpm離心IOmin,棄上清,收集菌絲體；用高滲緩沖液洗滌2次，加入終濃度為l_2mg/mL的溶菌酶，混合均勻，30°C保溫30_120min，過程中不斷振蕩混勻；然后用含有棉花的槍頭過濾酶解液，除去殘留菌絲體，收集濾液；在1000rpm轉速下離心5min，溫和的沉淀原生質體；再用高滲緩沖液洗滌原生質體一次，以洗凈酶液；棄去上清液，然后用適量高滲緩沖液重新懸浮原生質體； D、原生質體微波處理:將制備好的原生質體懸液，轉移至滅菌的培養皿中，置于微波爐內進行微波處理； E、原生質體再生培養:經微波處理的原生質體進行稀釋、分離，稀釋度為10_4-10_7個/mL,稀釋液平鋪在R2YE再生培養基上，于28.0±0.5°C，40%-60%濕度條件下培養5_8天，培養時第一天正置，第二天起倒置培養； F、菌株初篩:在再生培養基上挑取單菌落接種到斜面培養基上，于28.0±0.5°C，40%-60%濕度條件下培養5-8天；斜面成熟后接種到種子培養基中，于28.0±0.5°C,220rpm震蕩培養26-30h ;種液成熟后接種到發酵培養基中，相同條件下震蕩培養9-12天，生長到周期后檢測效價，選效價高的菌株進行砂土保藏； G、菌株復試:取初篩保藏的菌株轉接試管斜面，于28.0±0.5°C，40%-60%濕度條件下培養5-8天，斜面成熟轉接至種子培養基中，于28.0±0.5°C，220rpm震蕩培養26_30h，種液成熟后轉接至發酵培養基中，于相同條件下震蕩培養9-12天，取樣檢測效價，篩選保留效價高的菌株為殺真菌鏈霉菌(Streptomyces fungicidicus) DCS069。
4.根據權利要求3所述的一種篩選高產恩拉霉素菌株的方法，其特征在于:所述的步驟B中所用的DC-S菌絲培養基中成分及其含量為:0.5%葡萄糖，0.8%麥芽糖粉，0.4%蛋白胨，0.4% 酵母粉，0.05%MgS04.7H20,0.2%KH2P04,0.4%K2HP04,0.3% 氯化鈉。
5.根據權利要求3所述的一種篩選高產恩拉霉素菌株的方法，其特征在于:所述的步驟D中微波處理條件為:調整微波爐功率為700W，脈沖頻率為2450Hz，對原生質體懸液進行輻照處理10s，取出冰上放置20s，反復進行以上步驟，至累計微波處理時間60-120S。
【文檔編號】C12R1/465GK103740612SQ201310705246
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月19日 優先權日:2013年12月19日
【發明者】王雪峰, 閆彩潔 申請人:河北圣雪大成制藥有限責任公司