一種改良的新生豬胰島細胞培養基及其使用方法
【專利摘要】本發明是一種改良的新生豬胰島細胞培養基及其使用方法。在HAM’S?F10培養基中添加細胞凋亡抑制劑Z-VAD-FMK、人堿性成纖維細胞生長因子hFGF-β、血管內皮生長因子VEGF、胰島素樣生長因子R3-IGF-1、人表皮生長因子hEGF、肝細胞生長因子hHGF、豬血清、亞硒酸鈉、胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺、1-甲基3-異丁基黃嘌呤、煙堿、皮質醇、青霉素、鏈霉素。該培養基能使細胞凋亡下降，回收率增加；培養細胞有敏感葡萄糖刺激應答，功能比一般培養的胰島細胞要成熟；相同量的胰島細胞胰島素分泌量增加；胰島β細胞活力增加；胰島細胞團破碎減少，細胞團包膜完整，更適于移植。
【專利說明】一種改良的新生豬胰島細胞培養基及其使用方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于動物細胞培養【技術領域】，具體涉及一種改良的新生豬胰島細胞培養基及其使用方法。
【背景技術】
[0002]人胰島細胞移植是治療糖尿病的有效方法，但人源供體的短缺使人們越來越多的將目光投向尋找人胰島替代品上，豬胰島素同人胰島素十分類似，并且有相近的血糖調定點，十分適合作為人體胰島替代品，成體豬胰島十分脆弱容易離散，新生豬胰島具有免疫源性低，β細胞分裂潛能等特性，成熟后具有良好血糖刺激反應(Korbutt，G.S.;Elliott, J.F.; Aoj Z.; Smith, D.Κ.; War-nock, G.L.; Rajottej R.V.Large scale isolation, growth, andfunction of porcine neonatal islet cells.J.Clin.1nvest.97 (9):2119 - 2129;1996),經過一段時間的體外培養過程有助于純化胰島細胞并使β細胞發育成熟，從生理生化特性上來說相對于成體豬胰島更適合作為人胰島的替代品。
[0003]而胰島細胞體外培養技術早在二十世紀60年代就由Lacy(Lacy PE, Kost ianovsky M.Meth od for the isolat ion of int act islet s of langerhans from the ratpancreas.Diabet es, 1967, 16:35~39)等人提出，經過不斷改進,培養方法已逐步趨向完善，胰島細胞的培養是為了在體外獲取純化有活力的性能成熟胰島細胞，而胰島細胞不能形成單層細胞，而是作為細胞團(cluster)而存在，從而為培養增加了難度。
[0004]現今新生豬胰島細胞培養操作方法，一般采用1-5天的新生豬，解剖取胰腺，破碎后用膠原酶消化成細胞團 ，置于CMRL1066，RPMI等細胞培養基內培養3_5天，維持其生長或誘導其定向分化。但這些方法以及使用的培養基總是存在著很多缺陷，如:培養結果不穩定，純化獲得的有活性功能胰島細胞的量各不相同(2000IEQ/g-4000IEQ/g)，培養胰島細胞的純度也各有差別(70-90%);在低溫培養過程中胰島細胞會因細胞凋亡而產生丟失，尤其是β細胞，而且培養過程長短難于選擇，培養時間短則β細胞不能發育成熟，培養時間過長則會有大量胰島細胞因凋亡產生丟失，一般回收率只有60%左右，且由于β細胞凋亡使得同等量胰島細胞胰島素分泌量減少(insulin/DNA值為〈49.00mIU/g)。此外，隨著培養時間延長，胰島細胞團易破碎，進而形成的小胰島細胞團(直徑<50um)更易于死亡，難于培養，而且使培養過程難于清除污染，易于給后續的移植過程帶來炎癥反應，對后期移植的治療效果十分不利。至今沒有能大量提供高純度有活性并且穩定產量的胰島細胞培養方法以及培養基，所以如何通過建立優化最佳細胞分離方案、培養基成分以及培養方式成為胰島細胞培養最迫切的問題。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種改良的能經過培養提供有高活性，高存活度，包膜更完整，細胞團大小合適并且有穩定產量的針對新生豬胰島細胞培養基及其使用方法。
[0006]本發明的改良的新生豬胰島細胞培養基，是在HAM’ S FlO培養基中添加細胞凋亡抑制劑Z-VAD-FMK20y Μ、人堿性成纖維細胞生長因子hFGF-β 10-20 μ g/L，血管內皮生長因子VEGF10-20 μ g/L,胰島素樣生長因子R3-1GF-110-20 μ g/L,人表皮生長因子hEGF10-20l.! g/L，肝細胞生長因子hHGF10-20l.! g/L以及占培養基體積百分比10%的豬血清，還有亞硒酸鈉6.7ng/L,胰島素10 μ g/L,轉鐵蛋白5.5 μ g/L,乙醇胺2 μ g/L, 1-甲基3-異丁基黃嘌呤0.011g/L，煙堿1.22g/L,皮質醇5 μ M,80U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素。
[0007]所述的改良的新生豬胰島細胞培養基的使用方法，新生豬胰島細胞在培養基中的接種濃度為5000-10000IEQ/25-30ml，在37°C、5%C02、95%空氣培養箱內培養，制備的細胞在第一天更換培養皿及培養基，此后每隔一天更換一次，培養6-10天。
[0008]本發明選用的各種原料作用如下:
[0009]1、細胞凋亡抑制劑 Z-VAD-FMK，分子式為 Z-Val-Ala-Asp-CH2F,即 C21H28FN3O7,分子
量
[0010]為453.5，純度>95%，具有抑制細胞凋亡的作用。
[0011]2、人堿性成纖維細胞生長因子:是一個傳遞發育信號的多肽，具有強烈的血管生成作用，在體外，能刺激細胞增殖、遷移，誘導纖溶酶原激活物及膠原酶活性，是與肝素有高親和力的細胞促分裂原。
[0012]3、血管內皮生長因子:能促血管生成，刺激血管內皮細胞的有絲分裂和血管的發生。
[0013]4、人表皮生長因子:能促進DNA合成，并由此趨向刺激多種細胞分裂、增殖和分化。
[0014]5、胰島素樣生長因子:是一類多功能`細胞增殖調控因子，在細胞的分化、增殖、個體的生長發育中具有重要的促進作用。
[0015]6、肝細胞生長因子:是一類保護性因子，對細胞生長，分化有重要調控作用。
[0016]7、亞硒酸鈉:能增強谷胱甘肽過氧化物酶活性，清除自由基，加快脂質過氧化物分解，保護細胞完整性。
[0017]8、轉鐵蛋白:是一種結合鐵離子的糖蛋白，它對細胞生長的作用與其結合鐵離子減少其毒性的特性相關，可促進淋巴細胞增殖、促進抗體合成與分泌。
[0018]9、皮質醇:能加速糖代謝，促進細胞生長。
[0019]10、胰島素，乙醇胺，1-甲基3-異丁基黃嘌呤和煙堿都是一般市售無血清培養基常用成分，有促進細胞生長作用。
[0020]本發明的有益效果(以下數據來源于大量試驗結果，并具有統計學意義):
[0021]同樣胰島當量(I X IO4IEQ)培養6天，本發明培養基培養的活性胰島細胞存活率達到97.68±1.75%，遠高于一般培養的胰島細胞存活率68.57±0.67%，且本發明培養基培養6天的胰島細胞團顆粒直徑大多大于100 μ m,細胞團包膜完整，破碎胰島細胞團(直徑<50um)少于一般培養基培養6天的胰島細胞，更適合用于移植。培養6天獲得的胰島細胞對葡萄糖刺激具有敏感應答能力，其SI指數為一般培養基的2倍左右，并且培養6天的胰島細胞中β細胞比例為85.25±1.69%，本發明培養10天的β細胞比例是96.8±0.45%，較一般培養的比例高，證明本發明培養的胰島細胞功能好，胰島素分泌量明顯增多(Ρ〈0.05 ),彌補了一般培養的胰島細胞因凋亡導致胰島素分泌下降的不足。
[0022]本發明的優化培養基降低了細胞凋亡率，增加了培養細胞回收率，減少了細胞凋亡數量，使得培養后胰島細胞團破碎減少，包膜更完整，胰島較短時間培養的更為成熟，相同量胰島細胞的胰島素分泌量顯著提升，建立了穩定高效，細胞獲得量大的能經過長期培養提供有高活性，高存活度，細胞團大小合適并且有穩定產量的新生豬胰島細胞培養體系。[0023]本發明優勢總結如下:
[0024]1、細胞凋亡下降，回收率增加；
[0025]2、培養細胞有敏感葡萄糖刺激應答，功能比一般培養的胰島細胞要成熟；
[0026]3、相同量的胰島細胞胰島素分泌量增加；
[0027]4、胰島β細胞活力增加；
[0028]5、胰島細胞團破碎減少，細胞團包膜完整，更適于移植。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為:普通培養基和本發明改良培養基分別培養一天和六天的顯微鏡圖像，放大倍數100 X，圖中標尺長度1000 μ m ；
[0030]圖2為本發明與現有技術培養新生豬胰島細胞效果對比圖。
【具體實施方式】
[0031]以下結合實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。
[0032]實施例1，本發明培養基及培養方法試驗
[0033]本發明于新生豬取胰腺術前腹腔注射10IU/kg肝素鈉，本發明針對已分離純化的新生豬胰島細胞在培養基中的接種濃度為5000-10000IEQ/25-30ml，培養基(HAM’ S FlO培養基并添加有細胞凋亡抑制劑Z-VAD-FMK20y Μ、人堿性成纖維細胞生長因子hFGF- β 10-20 μ g/L,血管內皮生長因子VEGF10-20 μ g/L,胰島素樣生長因子R3-1GF-110-20 μ g/L,人表皮生長因子 hEGF10-20 μ g/L,肝細胞生長因子 hHGF10-20 μ g/L以及占培養基體積百分比10%的豬血清，還有亞硒酸鈉6.7ng/L，胰島素10 μ g/L，轉鐵蛋白5.5 μ g/L，乙醇胺21^/1，1-甲基3-異丁基黃嘌呤0.011g/L，煙堿1.22g/L，皮質醇(hydrocortisone) 5 μ M、80U/ml 青霉素、100U/ml 鏈霉素)的培養皿，置于 37°C、5%C02、95%空氣培養箱內培養，制備的細胞在第一天更換培養皿及培養基，此后每隔一天更換一次，于培養第6天和第10天時收集細胞計數并做相關檢測。
[0034]實驗檢測手段:
[0035]細胞團計數:收集培養細胞，1000rpm離心I分鐘，棄上清，定容至50ml吹打為細胞團懸液，懸液取50ul，雙硫腙(DTZ)染色，顯微鏡下計數，乘以1000，即總數。
[0036]活死細胞比例:取1500-2000IEQ胰島細胞團acutase酶消化為單個細胞，PI/HO染色后通過流式細胞儀對活細胞和死細胞計數。
[0037]胰島素測量:市售化學發光試劑盒。
[0038]DNA提取:市售DNA提取試劑盒。
[0039]β細胞活力檢測:取1500-2000IEQ胰島細胞acutase酶消化為單個細胞，NEWPORTGREEN特異染β細胞，過流式細胞儀檢測活性β細胞。
[0040]實施例2，本發明與專利申請201210330427.9，以及一般培養方法的效果對比，結果見表1-3。[0041]本發明培養6天活性胰島細胞存活率達到97.68 ± 1.75%，比一般培養的胰島細胞(〈70%)以及原專利201210330427.9(≤ 82%)高；本發明培養10天活性胰島細胞存活率達到88.9±1.63%，遠遠高于一般培養基(〈10%)以及原專利201210330427.9 (69.20%)；本發明培養6天β細胞所占百分比85.25±1.69%，也比一般培養基(〈50%)和原專利201210330427.9 (≤72.0%);本發明培養10天β細胞所占百分比達到96.8±0.45%，比一般培養基(〈60%)和原專利201210330427.9≤ 94.65%)高；此外，本發明的SI葡萄糖刺激指數(3.45±1.04)也遠高于一般培養基(1.8±0.08)和原專利201210330427.9的培養基(2.09±0.08)和方法。
[0042]且本發明培養基培養6天的胰島細胞團顆粒直徑大多大于100 μ m，細胞團包膜完整，破碎胰島細胞團(直徑〈50 μ m)少于一般培養基培養6天的胰島細胞,更適合用于移植。如圖2，將細胞同時用吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)染色，活細胞在熒光顯微鏡488nm激發光下呈綠色熒光，死細胞在546nm激發光下呈紅色熒光，圖片為胰島細胞分別在本發明改良培養基，專利申請201210330427.9培養基，普通培養基(HAM’ S F10)中培養10天，放大40 X的圖片，由圖2中可以看出，本發明新改良培養基細胞團周邊包膜完整，細胞團大小均勻，大部分直徑在100-200nm，死細胞極少，疊加圖片幾乎看不到死細胞；專利申請201210330427.9培養基雖然活細胞團多但細胞團大小分布不均，包膜不完整，細胞團邊緣不平滑，容易破碎為單個細胞而死亡；普通市售培養基的細胞團大部分已破碎死亡。
[0043]表1
[0044]胰島細胞存活率
[0045]
【權利要求】
1.一種改良的新生豬胰島細胞培養基，其特征在于，是在HAM’ S FlO培養基中添加細胞凋亡抑制劑Z-VAD-FMK20y M、人堿性成纖維細胞生長因子hFGF-β 10_20μ g/L，血管內皮生長因子VEGFlOIOyg/L，胰島素樣生長因子RS-1GF-llOIOyg/L，人表皮生長因子hEGF10-20l.! g/L，肝細胞生長因子hHGF10-20l.! g/L以及占培養基體積百分比10%的豬血清，還有亞硒酸鈉6.7ng/L,胰島素10 μ g/L,轉鐵蛋白5.5 μ g/L,乙醇胺2 μ g/L, 1-甲基3-異丁基黃嘌呤0.011g/L,煙堿1.22g/L,皮質醇5 μ M，80U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素。
2.權利要求1所述的改良的新生豬胰島細胞培養基的使用方法，其特征在于，新生豬胰島細胞在培養基中的接種濃度為5000-10000IEQ/25-30ml，在37°C、5%C02、95%空氣培養箱內培養，制備的細胞在第一天更換培養皿及培養基，此后每隔一天更換一次，培養6-10天 。
【文檔編號】C12N5/071GK103695367SQ201310719927
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月24日 優先權日:2013年12月24日
【發明者】王維, 易授南 申請人:湖南賽諾生物科技有限責任公司