一種植物胚乳特異性表達啟動子pENP3及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種植物胚乳特異性表達啟動子pENP3及其應用。本發明還提供了含有該啟動子pENP3的表達盒、植物表達載體、宿主菌和轉化子。本發明的上述啟動子可以應用在植物轉基因工程中。本發明提供的啟動子可以啟動外源基因在植物胚乳中特異性表達，適用于任何種子具有胚乳的植物，特別是單子葉植物或胚乳型雙子葉植物，尤其能夠驅動外源基因在稻米胚乳中特異性表達，因此可以用于提高和改善稻米的品質，從而培育出理想的、品質更加優良的稻米。
【專利說明】一種植物胚乳特異性表達啟動子PENP3及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術和植物基因工程【技術領域】。具體而言，本發明涉及一種植物胚乳特異性基因表達啟動子及其應用，該啟動子能夠在水稻轉基因調控體系中驅動目標基因在胚乳中表達。
【背景技術】
[0002]水稻是最主要的糧食作物之一，世界上三分之一以上的人口都以稻米為主食。隨著經濟的發展，全球范圍內對稻米產量和品質提出了越來越高的要求。因而利用各種方法來提高水稻單產、改良稻米品質，有著積極重要的意義。通過分子生物學以及基因工程的手段去研究和改良作物在農業生產中具有很好的應用前景。自1983年獲得第一株轉基因煙草以來，在近30年的時間里，植物基因工程的研究取得了突飛猛進的進展，已經成為現代生物學和育種學中一項重要的方法和技術。
[0003]高等生物的生長發育是不同基因在時間和空間上有序表達和協同作用的過程。在此過程中基因表達的開啟、關閉、表達部位和表達量的聞低都將會受:到精細的調控，基因的表達調控是一個多層次的復雜過程，受不同的調節因素控制，也是在多階段水平來實現的，即轉錄前、轉錄、轉錄后、翻譯、翻譯后五個水平。盡管基因表達在高等生物中是多級調控系統，但是轉錄水平上調控是最關鍵的環節。因為轉錄的起始及其發生頻率是基因表達環節中最基本的一步。啟動子作為轉錄水平上一個重要的調控元件，是眾多轉錄因子及RNA聚合酶的最終作用靶標，因此深入研究啟動子的結構、功能、作用模式等對于回答分子生物學中的一些基本理論問題具有重大意義。因此，人們在開發一些新的轉化技術如細胞器轉化、定向轉化等的同時，越來越注重通過控制目的基因的時空表達來達到相應的轉化目的。研究者們通過尋找更為有效的組織、器官特異性表達啟動子或者是誘導表達啟動子來代替組成型啟動子，以期更好地調控植物基因表達。正因為如此，組織特異性啟動子在植物基因工程中的研究地位也越來越突出。
[0004]所謂組織特異性啟動子是指除具有一般啟動子的結構外，通常還有增強子和沉默子的一般特性。在組織特異性啟動子的調控下，基因的表達常常只發生在某些特定的器官或組織部位，并常常表現出發育調節的特性。這些啟動子的調控往往受到組織細胞生理狀態和化學物理信號等物質的誘導，還受到發育階段的調控，其表達是多種因子相互作用的結果。
[0005]果實和種子是植物的生殖器官，也是營養物質主要的儲藏場所。利用果實或種子等器官特異性啟動子調控基因表達，不僅可以提聞基因在這些部位的表達量，將生物能耗降到最低，有利于表達產物的分離，而且可以有目的地提高轉基因植物果實或種子的營養或改善其品質。Vasconcelos等用水稻胚乳特異性谷蛋白基因啟動子驅動大豆鐵蛋白基因，使轉基因水稻谷粒中鐵和鋅的含量都有所增加，而且鐵蛋白主要積累在胚乳中，不會在食品加工過程中丟失。研究人員在一些單子葉植物的種子儲藏蛋白中也分離了一些胚乳特異表達的順式作用元件，最著名的GCN4元件被認為對維持胚乳特異表達活性是必須的，但也有文獻報道，GCN4元件僅僅是起到增強啟動子在胚乳中的表達強度的作用，其并不能決定啟動子胚乳特異表達的特性。另外，一些種子中特異表達的啟動子如PsGNS2啟動子(Buchner et al., 2002)、FAEl (Rossak et al., 2001)啟動子等也有相關的報導。
[0006]水稻是世界上最重要的糧食作物之一，也是禾本科作物功能基因組學研究的模式植物。人們日常食用的大米即為水稻的胚乳，胚乳的形成和發育直接影響著水稻的產量和品質，因此，對水稻胚乳特異性表達基因的深入研究，具有十分重要的意義。

【發明內容】

[0007]本發明的目的是提供一種驅動外源基因在植物胚乳中特異性表達的啟動子、獲得含有該啟動子序列的轉化子以及該啟動子的應用。其中，本文中所涉及的“植物”是指單子葉植物，例如水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥，優選為水稻。
[0008]為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案:
[0009]一方面，本發明提供一種植物胚乳特異性表達啟動子，所述啟動子包含序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列為來源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的水稻胚乳特異表達啟動子,本文中稱為pENP3或啟動子PENP3。
[0010]優選地，所述植物胚乳特異性表達啟動子的DNA序列為SEQ ID No:1所示的序列。
[0011]另一方面，本發明提供一種植物胚乳特異性表達啟動子PENP3，所述植物胚乳特異性表達啟動子PENP3的DNA序列與SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性；或者優選地，所述啟動子為在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一個或一個以上核苷酸生成的突變體或等位基因或衍生物。這些啟動子序列與SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同功能，即驅動目標基因在植物胚乳中特異性表達。
[0012]另一方面，本發明還提供一種表達盒，所述表達盒包含權利要求1-3中任意一項所述的植物胚乳特異性表達啟動子PENP3。
[0013]又一方面，本發明還提供一種重組載體，所述重組載體包含根據本發明提供的上述植物胚乳特異性表達啟動子PENP3 ；
[0014]優選地，所述重組載體為重組表達載體；進一步優選地，在所述重組表達載體中，本發明提供的上述植物胚乳特異性表達啟動子連接于待表達的基因序列的上游。
[0015]根據本發明的一種優選實現方式，所述待表達的基因為Gus基因(β -葡萄糖苷酸酶基因);所述重組表達載體為將SEQ ID No:1所示的序列即ρΕΝΡ3構建于pCAMBIA1391中得到的重組表達載體，本文中稱為pCAMBIA1391-pENP3。其中，pCAMBIA1391來自于CAMBIA，為公開使用載體，并且在安徽省農業科學院農業部轉基因生物產品成分監督檢驗測試中心水稻組保存。 并且，本發明還提供一種宿主菌，所述宿主菌包含本發明提供的上述植物胚乳特異性表達啟動子、上述表達盒、或上述重組載體；優選地，所述宿主菌為根癌農桿菌。
[0016]另一方面，本發明提供一種轉化子，所述轉化子包含本發明提供的上述植物胚乳特異性表達啟動子、上述表達盒、上述重組載體、或上述宿主菌。再一方面，本發明提供上述植物胚乳特異性表達啟動子在培育轉基因植物中的應用。具體而言，所述培育轉基因植物的培育過程是:將本發明提供的上述植物胚乳特異性表達啟動子連接于待表達的基因序列上游(例如，將所述啟動子序列置于目標基因之前)，將所述重組表達載體轉化到植物細胞、組織或器官中進行培育。待表達的基因即目標基因包括用于改良植物品質和積累的基因以及植物營養吸收相關的基因。
[0017]并且優選地，可以利用所述應用來改良植物胚乳性狀，所述植物為單子葉植物，例如水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥，優選為水稻；更優選地，所述待表達的基因為Gus基因，所述重組表達載體為pCAMBIA1391-pENP3，以用于改良水稻胚乳形狀。 [0018]本發明中所提供的啟動子的DNA序列為(與SEQ No:1中相同):
[0019]
【權利要求】
1.一種植物胚乳特異性表達啟動子PENP3，其特征在于，所述植物胚乳特異性表達啟動子pENP3包含序列表中SEQ ID NO:1所示的DNA序列。
2.根據權利要求1所述的植物胚乳特異性表達啟動子PENP3，其特征在于，所述植物胚乳特異性表達啟動子PENP3的DNA序列為序列表中SEQID NO:1所示的序列。
3.一種植物胚乳特異性表達啟動子PENP3，其特征在于，所述植物胚乳特異性表達啟動子PENP3的DNA序列與序列表SEQ ID NO:1所示的DNA序列有至少80%同源性； 或者，所述植物胚乳特異性表達啟動子PENP3為在序列表SEQ ID NO:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一個或一個以上核苷酸生成的突變體或等位基因或衍生物。
4.一種表達盒,其特征在于,所述表達盒包含權利要求1-3中任意一項所述的植物胚乳特異性表達啟動子PENP3。
5.一種重組載體，其特征在于，所述重組載體包含根據權利要求1-3中任一項所述的植物胚乳特異性表達啟動子PENP3。
6.根據權利要求5所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為重組表達載體，在所述重組表達載體中，所述植物胚乳特異性表達啟動子PENP3連接于待表達的基因序列的上游，優選地，所述待表達的基因為Gus基因；所述重組表達載體為pCAMBIA1391-pENP3。
7.—種宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含根據權利要求1-3中任一項所述的植物胚乳特異性表達啟動子PENP3、根據權利要求4所述的表達盒、或根據權利要求5-6中任意一項所述的重組載體。
8.一種轉化子，其特征在于，所述轉化子包含根據權利要求1-3中任意一項所述的植物胚乳特異性表達啟動子PENP3、根據權利要求4所述的表達盒、或根據權利要求5-6中任意一項所述的重組載體。
9.一種權利要求1-3中任意一項所述的植物胚乳特異性表達啟動子pENP3在培育轉基因植物中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，培育轉基因植物包括:將權利要求1-3中任意一項所述的植物胚乳特異性表達啟動子PENP3連接于載體中的待表達的基因序列上游，從而構建重組表達載體；將所述重組表達載體轉化到植物細胞、組織或器官中進行培育，優選地，所述應用用于改良植物胚乳性狀，所述植物為單子葉植物:水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥。
【文檔編號】C12N15/82GK103725680SQ201310738081
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月27日 優先權日:2013年12月27日
【發明者】魏鵬程, 楊劍波, 張銀萍, 李 浩, 楊亞春, 李莉, 倪大虎, 秦瑞英, 宋豐順, 馬卉 申請人:安徽省農業科學院水稻研究所