特性改善的內切葡聚糖酶的制作方法
【專利摘要】本發明涉及熱穩定性內切葡聚糖酶，具體地，涉及包括與SEQ.ID NO.:2具有至少96％的同一性的氨基酸序列的具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質，以及屬于GH7類并表現出活性熱穩定化的具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質。
【專利說明】特性改善的內切葡聚糖酶

【背景技術】
[0001] 纖維素是植物材料的主要成分。它是植物結構完整性的基礎，并且常常發現于由 纖維素、半纖維素和木質素組成的木質纖維素基質中。采用纖維素的應用利用其結構上的 特性（纖維、紡織品、紙等）或者其碳水化合物性質，產生D-葡萄糖、纖維二糖和/或纖維 素低聚物。
[0002] 木質纖維素很容易獲自農業和林業，包括來自谷類、玉米、甘蔗、甜菜、木材等的副 產品流。在不久的將來，對于其木質纖維素含量和產率經過優化的植物（"能源作物"）將 可能作為重要的資源作出貢獻。
[0003] 纖維素酶包括在結構上和功能上不同種類的作用于纖維素的糖原水解酶。纖維素 酶發現于細菌、古細菌（archea)、真菌和植物中。其對于在纖維素聚合物或低聚物中存在的 糖苷鍵具有共同的水解切割活性，在底物特異性、作用方式和包括持續性（processivity)、 pH和溫度最適條件的酶參數方面有所不同。大多數纖維素酶作用于兩個葡萄糖部分之間 的3-1，4-鍵。但是，木質纖維素中發現的其他鍵也可以被水解。纖維素酶可以通過其作 用方式細分成內切酶（endo-enzyme)和外切酶（exo-enzyme)。內切葡聚糖酶向纖維素聚合 物中引入隨機切割，從而降低聚合度。外切酶例如纖維二糖水解酶以連續作用方式工作，從 聚合物的還原或非還原端釋放出纖維二糖（D-葡萄糖-0 -1，4-D-吡喃葡糖苷）。
[0004] 其中 CAZY 數據庫[Cantarel BL, Coutinho PM, Rancurel C, Bernard T, Lombard V, Henrissat B (2009)The Carbohydrate-Active EnZymes database(CAZy) :an expert resource for Glycogenomics.(碳水化合物活性酶數據庫（CAZy):糖基因組學專業資源） Nucleic Acids Res 37:D233-238PMID: 18838391]保存有大量已知的葡糖水解酶包括纖維 素降解酶（即纖維素酶）。在該數據庫中，根據結構元素將酶分類成不同的GH-種類。若 干GH種類包括內切葡聚糖酶，具體地，類別GH5、GH7、GH9、GH12、GH16、GH45、GH48、GH61和 GH74。盡管一些GH種類中具有高度的多樣性，一個GH種類的成員常常具有類似的物理和 酶參數。這使得對于某個GH種類的成員來說可能進行概述，例如底物特異性、pH范圍、穩 定性或催化效率。
[0005] 降解纖維素的微生物常常產生和分泌纖維素酶的復雜混合物。例如，在里氏木 霉（Trichoderma reesei)的分泌蛋白質組（secretome)中，7種內切葡聚糖酶已經鑒別 為屬于 6 個不同的 GH 種類（Cel5A、Cel7B、Cell2A、Cel45A、Cel61A、Cel61B、Cel74A)。不 同的內切葡聚糖酶表現出一特性范圍（Karlsson J, Siika-aho M, Tenkanen M, Tjerneld F. Enzymatic properties of thelow molecular mass endoglucanases Cell2A(EG III) and Cel45A(EG V)ofTrichoderma reesei.(里氏木霉的低分子量內切葡聚糖酶Cell2A(EG III)和 Cel45A(EG V)的酶特性）J Biotechnol.20020ct 9;99(l):63-78.PubMed PMID: 12 ；Karlsson J, Momcilovic D, ffittgren B, Schiilein M, Tjerneld F, Brinkmalm G. Enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose hydrolyzed by the endoglucanasesCel5A, Cel7B, and Cel45A from Humicola insolens and Cel7B, Cell2A and Cel45Acore from Trichoderma reesei.(通過來自特異腐質霉的內切葡聚糖酶 Cel5A、Cel7B和Cel45A和來自里氏木霉的Cel7B、Cell2A進而Cel45Acore水解的羧甲基 纖維素的酶降解）Biopolymers. 2002Jan ;63(1) : 32-40. PubMed PMID: 11754346.)。人們認 為兩種主要的內切葡聚糖酶EGI(Cel7B，GH7)和EGII(Cel5A)是其活性最強的酶。
[0006] 纖維素分解酶的協同活性使得可以有效地破壞復雜底物（B. Henrissat, H. Driguez, C. Viet&M. Schiilein:Synergism of Cellulases from Trichoderma reesei in the Degradation of Cellulose (在纖維素降解中來自里氏木霉的纖維素酶的協同作用）； Nature Biotechnology 3, 722-726 (1985) doi: 10. 1038/nbt0885-722)，并且阻止了在水解 效率需要同時保持在最高水平時一結構種類的組分被來自二重的酶所置換（不同EG的不 等價性）。被另一 GH種類的酶簡單置換不總是可能的。通常來說，與GH7家族的內切葡聚 糖酶相比較，來自GH5家族的內切葡聚糖酶成員（包括來自嗜熱菌的EG)表現出更高的熱 穩定性；然而，熱穩定性GH7家族蛋白質的應用常常因其高水解速率而具有優勢。
[0007] 報道了許多內切葡聚糖酶的應用，一部分復雜酶混合物報道為單一的酶活性。纖 維素酶對于制造纖維素衍生的生物燃料來說非常重要。在切割之后，任選地，進行化學和/ 或物理處理，將木質纖維素與纖維素酶一起孵育，以釋放出糖單體，對其進行進一步處理。 需要對處理條件進行調適，以使水解速率、產率和/或穩定性最優化。在這些處理中，較高 的溫度常常是優選的，但這需要熱穩定性更高的酶。同時糖化和水解（SSF)處理要求在發 酵條件下有活性的纖維素分解酶。聯合生物處理（CBP)進一步要求酶特性的組合，以便在 單一步驟中完成酶產生、糖化和發酵。
[0008] 內切葡聚糖酶的其他應用僅致力于纖維素纖維的部分水解或修飾（纖維修飾、生 物拋光、生物石磨（Stoning)等）。因此，所用的內切葡聚糖酶需要在升高的溫度、極端（例 如堿性、酸性）pH和化學條件（例如，洗衣、清潔劑、蛋白酶、溶劑等）下工作和/或穩定。對 于這些應用，纖維損傷必須得以最小化。內切葡聚糖酶還可以在制漿過程中（紙漿和紙的 制造）有助于從纖維材料中分離出非纖維素部分，或者改善工藝物料流的流變學。洗滌劑 穩定性和蛋白酶耐性可以視作是酶結構穩定性增加的結果，這也是與熱穩定增加有關的特 性。內切葡聚糖酶還可以在食品和飼料加工（啤酒廠、葡糖酒制造、自濾餅回收油、烘焙、面 團制備）中加以應用。滅菌或巴氏殺菌常常要求更高的溫度。對于縮短處理時間來說，內 切葡聚糖酶的操作穩定性是有利的。
[0009] 來自木霉（Trichoderma)屬的真菌（無性型肉座菌（anamorph Hypocrea))的內 切葡聚糖酶I蛋白質（Cel7B)表現出高度的同一性，被視作是嗜中溫的。來自GH家族7的 內切葡聚糖酶中最穩定的成員據報道是來自特異腐質霉（Cel7B)和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum)(egl)的天然酶（US5912157)。根據該報道，EGI在60°C以上不表現活性。因 此，在該領域對于提供熱穩定性更高的來自GH家族7的內切葡聚糖酶存在需求。
[0010] 據報道，一些內切葡聚糖酶可以在較高的溫度下被熱滅活Oorninguez JM, Acebal C, Jimenez J, de la Mata I, Macarron R, Castillon MP. Mechanisms of thermoinactivation of endoglucanase I from Trichoderma reesei QM 9414.(來 自里氏木霉QM 9414的內切葡聚糖酶I的熱滅活機制）Biochem J. 19920ct 15;287(Pt 2) :583-8.)。所述研究的作者還嘗試了對熱滅活的內切葡聚糖酶的再活化，但這要求 涉及8M尿素和其他試劑的苛刻條件。描述為生產性再折疊（productive refolding) 的效應在內切葡聚糖酶以外的其他蛋白質中得以表現[Zhang N, Suen WC, Windsor W,Xiao L，Madison V，Zaks A. Improving tolerance of Candida antarctica lipase B towards irreversible thermal inactivation through directed evolution.(通過 定向進化提高南極假絲酵母脂肪酶對于不可逆熱滅活的耐受性）Protein Eng. 2003Aug ; 16 (8) : 599-605.]，但是據
【發明者】所知，其在內切葡聚糖酶特別是GH7內切葡聚糖酶中并未 表現出。在本領域中據信熱滅活的內切葡聚糖酶在纖維素的工業分解中幾乎沒有用處。另 一方面，對于內切葡聚糖酶特別是真菌來源的酶，提高的熱穩定性常常是所需的。目前，僅 僅報道有GH12和GH45內切葡聚糖酶的一些改進。已經報道有來自GH5和GH48結構折疊 的熱穩定性內切葡聚糖酶。所述內切葡聚糖酶在其動力學性質和底物優先方面大大不同于 GH7類的內切葡聚糖酶。
[0011] 總之，對于具有優異溫度特性的持續內切葡聚糖酶特別是GH7家族的酶存在需 求。而且，由其表達宿主實現良好的生產力將是合乎需求的。許多工業關聯過程在苛刻的 條件和升高的溫度下進行這一事實進一步支持了該需求。本發明要解決的問題是提供改良 的內切葡聚糖酶，特別是熱性能提高的內切葡聚糖酶。本發明致力并解決的其他問題從以 下部分來看將是顯而易見的。


【發明內容】

[0012] 本發明涉及熱穩定性內切葡聚糖酶蛋白質（多肽）。解決方案提供如下：
[0013] 1. 一種具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質，其屬于GH7類，并表現出活性熱穩定化。
[0014] 2. -種具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質，其包括與SEQ. ID N0. : 2具有至少96%、 優選至少97%、更優選至少98%、再更優選至少99%、例如至少99. 5%的同一性的氨基酸 序列。
[0015] 優選地，本發明的內切葡聚糖酶蛋白質在60°C下表現出大于95%的殘余活性。
[0016] 本發明的其他方面是編碼所述多肽的核酸，以及包含在生物體中的載體骨架中的 包括這些多核苷酸的表達構建體。本發明的另一方面是本發明的蛋白質用于處理木質纖維 素和纖維素材料的應用。具體地，木質纖維素進料在聯合的、部分聯合的或非聯合的處理中 的糖化，或者在食品、飼料、纖維素纖維或清潔應用中的處理。
[0017] 本發明還涉及用于產生本發明的蛋白質的生產/表達生物體，并涉及出于蛋白質 生產目的的這些生物體的培養方法。生物體選自包括微生物（真菌、細菌或古細菌）或植 物的生物體。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1 :SDS_凝膠顯示了分泌到上清液中的Seq. ID N0 8-Seq. ID N0 2變體蛋白質 的表達。所表達蛋白質的條帶在75至lOOkDa之間是可見的。
[0019] 圖2 :里氏木霉表達質粒。在TrCBHI啟動子的控制下將成熟內切葡聚糖酶基因的 DNA編碼序列融合克隆至TrCBHI信號肽序列。Swal/Sbfl可切除表達盒含有用于轉化體選 擇的潮霉素抗性盒。
[0020] 圖3 :與天然GH7蛋白質[2]相比較表現出溫度穩定性增強的內切葡聚糖酶變體 ([6]和[3])以及溫度穩定性及活性熱穩定化增強的變體[1]、[4]、[5]、[7]、[8]、[9]和 [10]。
[0021] 圖4:在Tecan Infinite M200酶標儀上將200 ill份的堿性4-甲基傘形酮溶液校 正至熒光讀數。通過將440mg 4-甲基傘形酮（Sigma Aldrich Cat. Nr. 69580)溶解在250ml 的0. 5M碳酸鈉溶液中，制備lOmM溶液。在0. 5M碳酸鈉中制備連續溶液。在360nm/454nm 下以增益50測量熒光強度。
[0022] 圖 5 :與 Seq. ID NO:4 相比較，Seq. ID NO: 13 的熱穩定化。
[0023] 圖6:在70°C下測定Seq. ID NO: 14相比較于Seq. ID NO:4的半衰期（實施例7)。

【具體實施方式】
[0024] 定義
[0025] "熱穩定性"是用于描述根據本發明的具有內切葡聚糖酶活性的特定蛋白質的固 有特性的術語。
[0026] "活性熱穩定化"是用于描述根據本發明的具有內切葡聚糖酶活性的特定蛋白質 的固有特性的術語。
[0027]熱穩定性和/或活性熱穩定化的測定：熱穩定性和活性熱穩定化測定如下。
[0028] 1)如實施例2中所述，在畢赤酵母（Pichia pastoris)中表達酶。任選地對酶進 行提純。
[0029] 2)調節酶的濃度。
[0030] 通過將提純的酶或畢赤酵母培養物上清液在醋酸鈉緩沖液（50mM，pH 5)中稀釋 至可適用的工作濃度，制成濃度適當的酶溶液。對于可適用工作濃度的確定，在醋酸鈉緩 沖液中制備上述步驟1中）得到的酶的連續稀釋液，如實施例4中所述，在溫度梯度下對 10 Pi等份進行測試。可適用的工作濃度定義為以下濃度：其導致在Tecan Infinite M200 酶標儀上在增益50下熒光信號在5, 000至15, 000之間，或者是在如實施例4中所述孵育 之后5.4 yM至19 yM 4-甲基傘形酮的等同濃度。
[0031] 3)如實施例4中所述，測定底物轉化能力，其不同之處在于，將10 yl等份的培養 物上清液用10 u 1等份如步驟2)中定義的可適用工作濃度的酶溶液代替。
[0032] 4)通過將所有的相對熒光單位（rfu)讀數除以溫度梯度內的最大rfu讀數對測量 結果進行歸一化，得到在各個測試溫度下測定的各蛋白質的相對底物轉化率。
[0033] 5)將相對底物轉化率對測定的反應溫度進行作圖。
[0034] 6)如（a)中所述測定溫度穩定性，或者如下文（b)中所述測定活性熱穩定化。
[0035] a.測定溫度穩定性：如果相對底物轉化率在60°C下為0. 5或更高，優選0. 7或更 高，更優選〇. 9或更高，例如0. 95或更高，蛋白質則被表征為溫度穩定的。
[0036] 測定活性熱穩定化：對步驟5)中得到的圖進行分析，在相對底物轉化率上存在有 平穩期，其低于最大水平（1)但至少高達〇. 15。
[0037] 平穩期定義為相對底物轉化率的水平在至少5°C的溫度范圍內，優選70至 75°C (即，在所述溫度范圍內圍繞平均值+/_0. 1內），基本上不變化。
[0038] b.不表現出活性熱穩定化的變體相對底物轉化率為0至低于0. 15,通常為大約 〇. 1。無意拘泥于任何特定理論，據信測得的相對底物轉化率通常為大約〇. 1 (而不是〇. 〇， 如在給定溫度下對于無活性的酶所預計）是因為熱循環儀中和/或樣品混合物的處理過程 中有限的溫度斜坡所致。
[0039] 熱特性是通常用來指酶在更高溫度（例如，60°C或更高）下的特性的術語。該術 語可以包括上述的"溫度穩定性"和上述"活性熱穩定化"中的一個或二者。
[0040] 內切葡聚糖酶活性在本發明的上下文中定義如下：通過蛋白質經由極性分子 如水或具有其羥基或巰基或氨基官能性的有機分子的親核進攻催化加速3-1，4-糖 苷鍵的斷裂。該定義還包括具有經由0-1，4-糖苷鍵與葡萄糖、纖維二糖或乳糖連接 的非碳水化合物分子的合成分子的斷裂。由內切葡聚糖酶催化的示例反應由Brenda Database(http://www. brenda-enzymes. info)列出(Release 2012. 1 (January 2012)； Enzyme data and metabolic information:BRENDA，a resource for research in biology, biochemistry, and medicine Schomburg, I. , Hofmann, 0. , Baensch, C. , Chang, A. ，Schomburg，D. Gene Funct. Dis. 3-4, 109-18 (2000))。
[0041] 殘余活性定義為與不經孵育步驟的活性相比較，將酶在指定（升高的）溫度下孵 育指定時間之后恢復的酶活性。確定殘余活性的方案在實施例4中給出。
[0042] 與SEQ ID N0:2的序列比對：任何第二GH7內切葡聚糖酶序列與親代序列（SEQ ID N0 2)的成對比對均使用 ClustalW 算法進行（Larkin M. A.，Blackshields G.，Brown N. P. , Chenna R. , McGettigan P. A. , McWilliam H. , Valentin F. , Wallace I. M. , Wilm A.，Lopez R.，Thompson J.D.，Gibson T.J?和Higgins D.G. (2007) ClustalW and ClustalX version 2. Bioinformatics 200723(21):2947-2948)。成對比對將顯示出 SEQ ID NO:2 的 位置數。所述的位置數可以用于參照，例如，當提到，例如，在第二GH7內切葡聚糖酶中與 SEQ ID N0:2的第2位對應的殘基發生突變。對于蛋白質變體的描述來說，作為氨基酸編號 和蛋白質變體命名的慣例，親代蛋白質序列SEQ ID N0:2內的氨基酸被稱作位置數1或S1 或絲氨酸1。所有氨基酸的編號將根據其在SEQ ID N0:2中給出的親代序列中相對于該位 置數1的位置。
[0043] 序列同一性：對于序列同一性的確定，使用來自Life Technology Corporation售 出的VectorNTI軟件包中的軟件AlignX，使用標準設置（空位開放罰分10,空位擴展罰分 0?1)。
[0044] 蛋白質變體是其氨基酸序列與該親代蛋白質在一個或多個位置處不同的多肽，其 中差別可能在于一個氨基酸殘基被另一個取代、單個或若干個氨基酸殘基的缺失或者額外 的氨基酸殘基或一段氨基酸殘基插入到親代序列中。通過將點突變引入到編碼核酸中，可 以在指定的位置處對蛋白質加以修飾。在本文中術語修飾的蛋白質序列總是指由相應地修 飾的核酸在體外或通過適當的表達宿主經由轉錄和翻譯以及任選地翻譯后修飾和易位過 程而得到的蛋白質。用于產生這些蛋白質變體的方法是本領域公知的，因而不受限定，其例 子包括隨機或定點誘變、定點飽和誘變、基于PCR的片段組裝、DNA改組、體外或體內同源重 組以及基于化學DNA合成的基因合成方法。
[0045] 氨基酸、肽、核苷酸和核酸的命名根據IUPAC進行。通常，在本申請文件中氨基酸 根據單字母符號命名。
[0046] 單個氨基酸的交換描述如下：命名原始氨基酸的單字母符號，之后是其位置編號 以及取代的氨基酸的單字母符號，即，1位上的谷氨酰胺變成在該位置上的亮氨酸被稱作 "Q1L"。對于單個位置從序列中的缺失，取代的氨基酸的符號被三字母縮寫"del"代替，從 而3位上丙氨酸的缺失將被稱作"A3del"。插入的額外的氨基酸接受在前位置的編號，其延 伸有相對于其與其插入點的距離依字母順序的小寫字母。因此，在3位之后插入兩個色氨 酸被稱作"3aW，3bW"。將未翻譯密碼子TAA、TGA和TAG引入到核酸序列中在氨基酸序列中 指示為"*"，因此在氨基酸序列的4位上引入終止密碼子稱作"G4*"。多個突變由加號或斜 杠或逗號分開。例如，分別在20和21位上將丙氨酸和谷氨酸替換成甘氨酸和絲氨酸的兩 個突變記作"A20G+E21S"或"A20G/E21S" "A20G，E21S"。當指定位置處的氨基酸殘基被兩 個或更多個可選的氨基酸殘基替換時，這些殘基以逗號或斜線分開。例如，30位的丙氨酸被 甘氨酸或谷氨酸替換記作"A20G，E "或"A20G/E "，或者"A20G，A20E "。當在本文中識別出適 合修飾的位置而沒有指出任何具體的修飾時，應當理解成任何氨基酸殘基均可以替換在該 位置處存在的氨基酸殘基。因此，例如，當提到20位上的丙氨酸修飾而沒有指明時，應當理 解成該氨基酸可以缺失或替換成任何其他的氨基酸殘基（即，R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、 M、F、P、S、T、W、Y 和 V 中的任一個）。
[0047] 術語"類似的突變"或"類似的替換"是指如下氨基酸突變：其中第一突變（關于 親代序列，例如，如SEQ ID N0:2)中的氨基酸殘基再次通過第二突變被取代，并且通過第二 突變引入的氨基酸殘基與通過第一突變已引入的氨基酸殘基具有類似的性質。在本上下文 中類似是指氨基酸具有類似的化學性質。例如，如果特定位置處的第一突變導致非脂肪族 氨基酸殘基（例如Ser)被脂肪族氨基酸殘基（例如Leu)替換，在相同位置處通過第二替 換的方式用不同的脂肪族氨基酸替換（例如lie或Val)則被稱作類似的突變。其他的化 學性質包括殘基大小、疏水性、極性、電荷、PK值等。因此，類似的突變可以包括如下替換， 例如，堿性替換成堿性、酸性替換成酸性、極性替換成極性等。出于結構上的理由，由此衍生 的氨基酸的集合可能是保守的。這些集合可以以維恩圖的形式描述（Livingstone CD.和 Barton GJ. (1993)''Protein sequence alignments:a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation〃（蛋白質序列比對：殘基保護性分類分析策略） Comput. Appl Biosci. 9:745-756 ;Taylor W. R. (1986) "The classification of amino acid conservation〃（氨基酸保守性分類）J. Theor. Biol. 119 ;205-218)。相似的替換可以根據， 例如，以下的氨基酸分組來進行：疏水的：FWYHKMILVAG ;芳香族：F W Y H ;脂肪 族：I L V ;極性：WYHKREDCSTN ;帶電的H K R E D ;帶正電：H K R ;帶負電：E D。 [0048] 表達構建體在本文中定義為包括所有在宿主細胞中建立所包含的開放閱讀框 (0RF)的表達所需的序列元件的DNA序列，其包括用于轉錄起始（啟動子）、終止和調節的 序列、用于翻譯起始的位點、用于穩定地復制并整合到宿主基因組中的區域以及可選擇的 遺傳標記物。開放閱讀框任選地由編碼目標蛋白質的核酸與其他元件的融合物組成，特 別是分泌信號、纖維素結合結構域、用于提高表達水平或促進從發酵肉湯中提純或分離的 TAG。因此功能設定可以是已經建立好的，或者通過在宿主細胞中進行排列（整合等）事件 而達到。在優選的實施方式中，表達構建體包括與開放閱讀框功能性連接的啟動子，然后是 任選的終止序列。優選的啟動子是中至高強度啟動子，在發酵條件下在所選擇的宿主中發 揮功能。為進行說明，給出如下優選啟動子的例子：
[0049] ?細菌（例如，大腸桿菌（Escherichia coli)) :lac、tac、trp、tet、T3、T7、CP7、 CP21、araBAD
[0050]?酵母（例如，畢赤酵母屬（Pichia)、酵母屬（Saccharomyces)) :A0XI、A0XII、 FMDH、GAP、TEF、PFK1、FBA1、PGK1、ADH1、ADH2、TDH3
[0051]真菌（例如，木霉屬（Trichoderma)) :CBHI、CBHII、EGI、PGK、BGL、XYL1、XYL2
[0052] 用于異源表達的適當啟動子的其他例子在文獻中得以報道。表達構建體的其他部 分是引入的核酸和可選擇標記物的穩定繼承所需的遺傳元件，其包括有關抗生素抗性的遺 傳元件或補充宿主株的定義的營養缺陷型的遺傳元件。
[0053] 本發明所有核酸的序列，或編碼本發明的多肽/蛋白質的核酸的序列，均可以朝 向在選擇的表達宿主中最優的密碼子使用加以調節。對于特定表達宿主來說具有優化/ 最優的密碼子選擇的核酸也是本發明的一部分。生產宿主在本文中與表達宿主同義使用， 其是指在培養時產生本發明的蛋白質的生物體。在一實施方式中，本發明的蛋白質并不是 由生產宿主分泌；但是，在優選的實施方式中，其被分泌至周圍的培養基中。這樣的微生物 優選地選自細菌、古細菌、酵母、真菌和/或植物界的范疇。一優選的表達宿主是畢赤酵母 (Pichia pastoris)〇
[0054] "細菌"在本文中是指原核生物。在優選的實施方式中，細菌是真細菌，再更 優選地其選自埃希氏桿菌屬（Escherichia)、芽孢桿菌屬（Bacillus)、克雷伯氏桿菌 屬（Klebsiella)、鏈霉菌屬（Streptomyces)、乳球菌屬（Lactococcus)和乳酸菌屬 (Lactobacillus)，特別是大腸桿菌、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtil is)、地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)、角軍淀粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)、巨大芽抱 桿菌（Bacillus megaterium)、植生克雷伯菌（Klebsiella planticola)、變鉛青鏈霉菌 (Streptomyces lividans)、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis)、短乳桿菌（Lactobacillus brevis)〇
[0055] "酵母"在本文中是指所有在其生命周期中表現出單細胞營養態的低等真核生 物。其具體地包括酵母菌（Saccharomycetes)類生物體，特別是酵母屬（Saccharomyces)、 管囊酵母屬（Pachysolen)、畢赤酵母屬（Pichia)、假絲酵母屬（Candida)、耶氏酵 母屬（Yarrowina)、Debaromyces屬、克魯維酵母屬（Klyveromyces)、接合酵母屬 (Zygosaccharomyces)〇
[0056] "絲狀真菌"或"真菌"在本文中是指所有在其生命周期中在至少一狀態下 表現出菌絲生長的低等真核生物。其具體包括子囊菌門和擔子菌門的生物體，特別是 木霉屬（Trichoderma)、踩節菌屬（Talaromyces)、曲霉屬（Aspergillus)、青霉菌屬 (Penicillium)、金抱子菌屬（Chrysosporium)、革菌屬（Phanerochaete)、熱子囊菌屬 (Thermoascus)、傘菌屬（Agaricus)、Pleutrus 屬、耙齒菌屬（Irpex)的生物體。
[0057] "植物"在本文中是指所有屬于植物界的真核生物。在優選的實施方式中，表 達宿主選自以下屬的植物：玉蜀黍屬（Zea)、小麥屬（Triticum)、大麥屬（Hordeum)、黑 麥屬（Secale)、芒草屬（Miscanthus)、甘鹿屬（Saccharum)、爺屬（Solanum)、甘薯屬 (Ipomea)、木薯（Manihot)、向日葵屬（Helianthus)、山茶屬（Camellia)、Aspalathus、按屬 (Eucalyptus)、甜菜屬（Beta)、山毛棒屬（Fagus)、松科（Pinaceae)、樣木科（Betulaceae)、 錦奏科（Malvaceae)、柏科（Cupressaceae)、舊薇科（Rosaceae)、掠桐科（Arecaceae)的成 員。
[0058]酶制劑是指任何含有酶作為部分的液體或固體組合物。其他組分優選包括水、多 元醇、糖、洗滌劑、緩沖劑、還原劑、無機鹽、固體載體、防腐劑，特別是具有抗菌或抗真菌活 性的防腐劑，染料、芳香劑和/或香料。
[0059] 內切葡聚糖酶的用途，例如，特別是本發明的內切葡聚糖酶的用途（非限定性例 子）：用于產生單糖、二糖或寡糖的木質纖維素進料的水解；制造紙漿和紙；用于纖維、紗線 或粗斜紋棉布的改良或通用處理的紡織品應用；工業清潔應用或家庭護理應用；在食品和 飼料領域中營養素的釋放、制造率提高或改善面團特性。
[0060] 發明詳沭
[0061] 本發明涉及具有優異特性的GH7內切葡聚糖酶。更具體地，本發明涉及熱穩定的 內切葡聚糖酶蛋白質（多肽）。解決方案提供如下：
[0062] 1.一種具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質，其屬于GH7類，并表現出活性熱穩定化。
[0063] 2. -種具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質，其包括與SEQ. ID N0. : 2具有至少96%、 優選至少97%、更優選至少98%、再更優選至少99%、例如至少99. 5%的同一性的氨基酸 序列。
[0064] 以下對這兩個實施方式加以詳述。
[0065] 溫度穩定性如上文定義。測定溫度穩定性的例子在實施例4中給出。GH7類的內 切葡聚糖酶列于表1中（EC 3. 2. 1. 4)。除了在特定權利要求中通過特定序列同一性限制排 除以外，本發明涉及GH7類所有內切葡聚糖酶的變體，其中包括表1所示者的變體。
[0066] 表1:已知的GH7類內切葡聚糖酶。
[0067]

【權利要求】
1. 一種具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質，其包括與SEQ. ID NO. :2具有至少96%、優選 至少97 %、更優選至少98 %、再更優選至少99 %、例如至少99. 5 %的同一性的氨基酸序列。
2. 根據權利要求1所述的蛋白質，其中所述蛋白質在溫度60°C下在孵育進行1小時時 表現出至少90%的殘余底物轉化能力。
3. -種具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質，其屬于GH7類，并表現出活性熱穩定化。
4. 根據權利要求3所述的蛋白質，其與SEQ. ID NO. :2具有至少70%、優選至少90%、 更優選至少95 %、更優選至少96 %、更優選至少97 %、更優選至少98 %、再更優選至少 99%、例如至少99. 5%的同一性。
5. 根據權利要求1、3或4中任一項所述的蛋白質，其與SEQ ID N0:5 ;SEQ ID N0:6 ;SEQ ID N0:7 ；SEQ ID N0:8 ；SEQ ID N0:9 ；SEQ ID NO: 10 ；SEQ ID NO: 11 ；SEQ ID NO: 12 ；SEQ ID NO: 13 ;SEQ ID NO: 14 ;SEQ ID NO: 2中的任一個是等同的；或者其相對于SEQ ID NO: 2具有 至少一處突變。
6. 根據權利要求5所述的多肽，其中所述至少一處突變是選自表2中所示的可選變化 中的優選的、更優選的突變。
7. 根據權利要求5所述的多肽，其中所述至少一處突變是選自表3中所示的可選變化 中的優選的、更優選的突變。
8. 根據權利要求5所述的多肽，其中所述至少一處突變是選自表4中所示的可選變化 中的優選的、更優選的突變。
9. 一種核酸，其編碼前述權利要求中任一項所述的蛋白質。
10. -種表達載體，其包括權利要求9所述的核酸。
11. 一種微生物，其含有權利要求10所述的載體構建體。
12. -種混合物，其含有根據權利要求1-8中任一項所述的蛋白質和一種或更多種其 他的酶，其優選選自纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶中的一種或更多種。
13. 根據權利要求1-8中任一項所述的蛋白質或根據權利要求12所述的混合物的用 途。
14. 根據權利要求13所述的用途，其用于木質纖維素的糖化。
【文檔編號】C12N9/42GK104271738SQ201380023399
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2013年4月30日 優先權日:2012年5月2日
【發明者】C·賴辛格, J·克拉倫, I·翁特施特拉塞爾, A·米特羅維奇, K·弗利克爾, G·格布哈特 申請人:科萊恩產品（德國）有限公司