專利名稱：一種重組耐熱的β-1,4內(nèi)切纖維素酶的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物酶的純化方法，特別涉及一種重組耐熱纖維素酶的純化方法。
背景技術(shù)：
纖維素是地球上含量最豐富的多糖，也是最豐富的有機(jī)可再生資源。纖維素酶是分解纖維素的一類酶，根據(jù)功能的不同，分為外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β -葡萄糖苷酶，它能將纖維素分解成為葡萄糖，一種機(jī)理是:內(nèi)切葡聚糖酶首先將纖維素的非結(jié)晶區(qū)切開(kāi)，產(chǎn)生大量的非還原端，作為纖維二糖水解酶底物，依次從非還原端切下纖維二糖，被葡萄糖苷酶水解成葡萄糖。目前工業(yè)上使用的纖維素酶大多來(lái)源于真菌發(fā)酵產(chǎn)物，只能在中溫條件下發(fā)揮作用，限制了酶的應(yīng)用，而耐熱纖維素酶因具有極好的高溫反應(yīng)活性和穩(wěn)定性，在能源、化工、食品和醫(yī)藥等行業(yè)展現(xiàn)出越來(lái)越廣闊的應(yīng)用潛力。來(lái)源于Euryarchaeota門(mén)熱球菌目的熱球菌高度嗜熱，產(chǎn)生的耐熱纖維素酶，由于具有較高的酶活力和熱穩(wěn)定性，日益被人們所關(guān)注，成為纖維素酶基礎(chǔ)研究和開(kāi)發(fā)新型纖維素酶制劑的熱點(diǎn)。許多研究者構(gòu)建表達(dá)了來(lái)自熱球菌的耐熱纖維素酶，例如國(guó)際專利PCT/DK98/00039,論文Kengen 1993和Bauer 1999，表達(dá)的耐熱纖維酶的反應(yīng)最適溫度都在90°C以上，但是存在工藝步驟多、表達(dá)量低、純度差、比活低、難以放大用于生產(chǎn)的情況。2004 年學(xué)者 Yasuhiro Kashima(Extremophiles.9:37-43)從 Pyrococcushorikoshii古細(xì)菌中克隆了 β_1，4內(nèi)切纖維素酶基因，去除其C端的411 459位氨基酸，獲得了改構(gòu)的耐熱β_1，4內(nèi)切纖維素酶(ΡΗ1171)，分子量約為45000，使蛋白表達(dá)量提高了 60倍，且活性不損失。 但其純化步驟包括破菌、85°C熱處理30分鐘、Q陰離子交換層析、Phenyl疏水層析、S-200凝膠過(guò)濾層析等，步驟繁瑣，比活較低，而且其使用的S-200凝膠過(guò)濾層析限制了放大應(yīng)用。在PCT/DK98/00039專利報(bào)道中，利用芽孢桿菌表達(dá)了耐熱β _1，4內(nèi)切纖維素酶，純化步驟包括:調(diào)pH、陰離子、陽(yáng)離子兩種絮凝劑沉淀菌體、濾紙過(guò)濾、DEAE陰離子交換層析、Butyl疏水層析等，步驟繁瑣，收率較低，僅為50 60%，并且局限于實(shí)驗(yàn)室水平，難以放大。因此，建立一種簡(jiǎn)便、快捷、低成本、可放大的耐熱β_1，4內(nèi)切纖維素酶的純化方
法，具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于此，我們構(gòu)建表達(dá)了耐熱β_1，4內(nèi)切纖維素酶(ΡΗ1171)蛋白，本發(fā)明的目的是提供了一種ΡΗ1171的純化方法，具有純度高、比活高、收率高、生產(chǎn)成本低、有利于工業(yè)化生產(chǎn)的特點(diǎn)。本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案:
一種重組耐熱的β -1,4內(nèi)切纖維素酶的純化方法，由以下步驟組成:I)破菌發(fā)酵獲得表達(dá)重組耐熱β_1，4內(nèi)切纖維素酶的菌體，離心后向菌體沉淀加入破菌緩沖液，使菌體和破菌緩沖液的比例為1: 5 20，攪拌10 20分鐘使之混合均勻，通過(guò)超聲或高壓均質(zhì)的方法裂解菌體；其中破菌緩沖液為20 50mM Tris-HCl, pH7.5
8.5,0.1 5mMEDTA、0.5 IM NaCl,5 10%甘油、溶菌酶 0.5 2mg/ml、5 IOmM 咪唑、
0.02 ImM PMSF ;破菌緩沖液中的EDTA和甘油經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)對(duì)活性穩(wěn)定十分重要，確保菌體在破菌、熱處理過(guò)程中活性損失減少，咪唑的添加是避免金屬螯合層析過(guò)度吸附含色氨酸、半胱氨酸和少量組氨酸的非組氨酸標(biāo)簽的雜蛋白。菌體和破菌液的比例選擇是為了方便超聲或高壓均質(zhì)機(jī)高效破碎菌體，破菌過(guò)程中需要適度降溫，避免超過(guò)30°C，防止酶活的損失。破菌時(shí)間以菌液不再粘稠、流動(dòng)性良好為準(zhǔn)；2)熱處理將破菌處理后的溶液放入水浴中保溫?cái)嚢瑁瑴囟葹?0 85°C，攪拌速度控制在100 200rpm，處理時(shí)間為15 40分鐘；3)離心將熱處理后的溶液放入離心機(jī)中離心，離心力10000 20000 X g，時(shí)間10 20分鐘，取上清液，加入I 2M MgCl2至濃度IOmM 20mM,經(jīng)0.45 μ m的濾膜過(guò)濾；在上述步驟中發(fā)酵菌體破碎后直接進(jìn)行熱處理，使細(xì)胞碎片和雜蛋白大量沉淀，較低離心力IOOOOg左右即可充分分離沉淀，獲得澄清的蛋白粗純液。熱處理后蛋白純度明顯提高，由于目標(biāo)蛋白的耐熱性和破菌緩沖液的甘油、EDTA等保護(hù)劑，活性此步損失小于10%。離心上清補(bǔ)加MgCl2的作用是占據(jù)EDTA的金屬螯合位點(diǎn)，確保樣品上樣時(shí)不會(huì)因EDTA剝離Ni離子，導(dǎo)致載量、收率下降；4)金屬螯合親和層析金屬螯合層析用緩沖液I平衡色譜柱，用量為3 5CV，上樣后沖洗沖洗用量為5 10CV，使UV280吸收降至基線。然后用緩沖液II洗脫雜蛋白，用量為5 10CV，使UV280吸收降至基線。最后用緩沖液III洗脫目的蛋白，收集UV280吸收大于IOOmAu組分，加入固體硫酸銨至飽和度60 70%進(jìn)行沉淀，呈混懸狀態(tài)的蛋白產(chǎn)品置于4°C長(zhǎng)期保存，活性I年內(nèi)未見(jiàn)明顯衰減。其中緩沖液I為20 50mMTris-HCl，PH7.5 8.5、0.5 IM NaCl、5 10%甘油、5 IOmM 咪唑；緩沖液 II 為 20 50mM Tris-HCl, PH7.5 8.5,0.5 IMNaCl,5 10%甘油、50 70mM 咪唑；緩沖液 III 為 20 50mM Tris-HCl, PH7.5 8.5、
0.5 IM NaCl,5 10%甘油、200 300mM 咪唑。所述破菌步驟中破菌法選擇高壓均質(zhì)法，是指將菌體和破菌緩沖液的混合液放入高壓均質(zhì)機(jī)，在10 30°c、工作壓力為500 800bar時(shí)均質(zhì)2 3遍。所述破菌步驟也可以采用超聲法，方法為放入超聲設(shè)備中，超聲5 10秒，停10 20秒，共超聲10 20分鐘，此超聲方法建議體積小于0.5L時(shí)使用。所述熱處理步驟中，溫度為75 80°C，處理時(shí)間為20 30分鐘。所述金屬螯合親和層析步驟中 介質(zhì)配基為亞氨基二乙酸(IDA)或次氮基三乙酸(NTA)，優(yōu)選為亞氨基二乙酸(IDA)。由于NTA的載量相對(duì)較低，所以使用IDA更經(jīng)濟(jì)，GE公司生產(chǎn)的Ni Sepharose HP、Ni Sepharose FF可重復(fù)使用,Ni離子脫落較少,選擇性高,廣泛用于組氨酸標(biāo)簽蛋白的純化，其中Ni Sepharose HP填料顆粒平均34 μ m,分辨率略高于Ni Sepharose FF,且流速反壓與Ni Sepharose FF無(wú)明顯差異,對(duì)純度要求較高時(shí)使用NiSepharose HP較理想,反之使用Ni Sepharose FF即可，同時(shí)可以降低成本。所述金屬螯合親和層析步驟中柱高為5 15cm，柱床過(guò)高，柱壓明顯，影響上樣、洗脫流速，過(guò)低影響分離效果；上樣線性流速為30 120cm/h,優(yōu)選為60 100cm/h,這樣可以確保蛋白與填料的充分吸附；洗脫線性流速為100 300cm/h,優(yōu)選為100 150cm/h,這樣可以確保蛋白與填料充分解吸附，上樣、洗脫時(shí)色譜柱壓力控制在0.4MPa以下，防止色譜柱床壓塌；上樣量為每ml填料上樣菌體蛋白100 300mg (Bradford法檢測(cè)),優(yōu)選為100 200mg，上樣量過(guò)高會(huì)降低分辨率，導(dǎo)致目的蛋白穿透，收率降低。本發(fā)明與文獻(xiàn)中提到的方法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):(I)優(yōu)化了破菌液、Ni柱洗脫緩沖液成分，使純化過(guò)程中蛋白活性基本不變；(2)所用層析方法均可簡(jiǎn)單線性放大，50ml Ni離子親和柱即可以進(jìn)行I批發(fā)酵液(5L)的純化，不使用凝膠層析，工藝放大方便，親和層析的選擇性高，一步純化后目的蛋白純度大于90% ；(3)收獲蛋白濃度大于10mg/ml，體積小，方便下一步鹽析操作，便于大規(guī)模生產(chǎn)；(4)酶以鹽析沉淀方式在4度長(zhǎng)時(shí)間保持活性，簡(jiǎn)化制劑過(guò)程，酶活更穩(wěn)定；(5)工藝簡(jiǎn)單，用時(shí)短(I天)，成本低。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的PH1171 Ni柱親和層析色譜
圖2是本發(fā)明實(shí)施例1的PHl 171純化過(guò)程SDS-PAGE電泳圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述純化菌體來(lái)源于:( 一 )古細(xì)菌 Pyrococcus horikoshii OT3目的基因獲得:1、使用上下游引物從古細(xì)菌Pyrococcus horikoshii 0T3基因組中用PCR技術(shù)獲得目的片段；2、用NdeI及BamHI雙酶切目的基因片段及pETlla質(zhì)粒載體；3、連接載體及目的基因、轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5ci菌株。基因的改構(gòu):去掉N-terminal的28個(gè)氨基酸殘基及C-terminal的42個(gè)氨基酸殘基,并對(duì)SD序列進(jìn)行密碼子偏好性突變，使用以下引物構(gòu)建亞克隆。表格左邊為引物名稱，右邊為引物序列。
權(quán)利要求
1.一種重組耐熱的β-1，4內(nèi)切纖維素酶的純化方法，其特征在于:由以下步驟組成: 1)破菌 發(fā)酵獲得表達(dá)重組耐熱β-1，4內(nèi)切纖維素酶的菌體，離心后向菌體沉淀加入破菌緩沖液，使菌體和破菌緩沖液的比例為1: 5 20，攪拌10 20分鐘使之混合均勻，通過(guò)超聲或高壓均質(zhì)的方法裂解菌體，使之破碎； 2)熱處理 將破菌處理后的溶液放入水浴中保溫?cái)嚢瑁瑴囟葹?0 85°C，攪拌速度控制在100 200rpm，處理時(shí)間為15 40分鐘； 3)離心 將熱處理后的溶液放入離心機(jī)中離心，離心力10000 20000 X g，時(shí)間10 20分鐘，取上清液，加入I 2M MgCl2至終濃度為IOmM 20mM，經(jīng)0.45 μ m的濾膜過(guò)濾； 4)金屬螯合親和層析 金屬螯合層析首先用緩沖液I平衡色譜柱，用量為3 5CV，上樣后沖洗，用量為5 10CV，使UV280吸收降至基線，然后用緩沖液II洗脫雜蛋白，用量為5 10CV，使UV280吸收降至基線，最后用緩沖液III洗脫目的蛋白，收集UV280吸收大于IOOmAu組分，加入固體硫酸銨至飽和濃度60 70%進(jìn)行沉淀，得到呈混懸狀態(tài)的蛋白產(chǎn)品置于4°C長(zhǎng)期保存； 其中破菌緩沖液為 20 50mM Tris-HCl，pH7.5 8.5、0.1 5mMEDTA、0.5 IM NaCl、5 10%甘油、溶菌酶0.5 2mg/ml、5 IOmM咪唑、0.02 ImM PMSF ;緩沖液I為20 50mM Tris-HCl,pH7.5 8.5、0.5 IM NaCl、5 10%甘油、5 IOmM 咪唑；緩沖液 II 為20 50mM Tris-HCl, pH7.5 8.5、0.5 IM NaCl、5 10%甘油、50 70mM 咪唑；緩沖液 III 為 20 50mM Tris-HCl,pH7.5 8.5、0.5 IM NaCU5 10%甘油、200 300mM咪唑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于:所述破菌步驟中破菌法選自高壓均質(zhì)法。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的純化方法，其特征在于:所述均質(zhì)法是指將菌體和破菌緩沖液的混合液放入高壓均質(zhì)機(jī)中，控溫10 30°C、工作壓力為500 800bar，均質(zhì)2 3遍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于:所述熱處理步驟中，溫度為75 80 °C，處理時(shí)間為20 30分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于:所述金屬螯合親和層析步驟中介質(zhì)配基為亞氨基二乙酸(IDA)或次氮基三乙酸(NTA)。
6.根據(jù)權(quán)利要求6所述的純化方法，其特征在于:所述金屬螯合親和層析步驟中介質(zhì)配基為亞氨基二乙酸(IDA)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于:所述金屬螯合親和層析步驟中柱高為5 15cm，上樣線性流速為30 120cm/h，洗脫線性流速為100 300cm/h，上樣量為每ml填料上樣菌體蛋白100 300mg。
8.根據(jù)權(quán)利要求8所述的純化方法，其特征在于:所述金屬螯合親和層析步驟中上樣線性流速為60 lOOcm/h，洗脫線性流速為100 150cm/h，上樣量為每ml填料上樣菌體蛋白100 200mg。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組耐熱的β-1，4內(nèi)切纖維素酶的純化方法，主要步驟為破菌、熱處理、離心、金屬螯合親和層析、鹽析。本發(fā)明具有純度高、比活高、收率高、生產(chǎn)成本低、有利于工業(yè)化生產(chǎn)的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/42GK103088004SQ20111034716
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2011年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月7日
發(fā)明者鄭春陽(yáng), 聶立影, 原素英, 王燕, 徐彬 申請(qǐng)人:天津強(qiáng)微特生物科技有限公司