重組微生物及其用途

文檔序號：467611閱讀：1101來源：國知局

重組微生物及其用途
【專利摘要】將細菌遺傳改造以產生3-羥基丙酸鹽(3-HP)。該細菌是一氧化碳營養產乙酸細菌。該細菌使用用于固定CO/CO2的Wood-Ljungdahl途徑而產生乙酰輔酶A。引入來自含有此類酶的細菌的丙二酰輔酶A還原酶。另外，還可引入乙酰輔酶A羧化酶。3-HP的生產可通過乙酰輔酶A羧化酶的過度生產或通過生物素的過度生產得到改善。這可通過改善的啟動子或更高的拷貝數或催化上更有效的酶來實現。
【專利說明】重組微生物及其用途

【技術領域】
[0001] 本發明涉及用于通過對包含C0和/或C02的底物的微生物發酵生產3-羥基丙酸鹽[3-Hydroxypropionate, 3-HP]的重組微生物和方法。

【背景技術】
[0002] 3-羥基丙酸鹽[3-HP]是平臺化學品，充當用于生產聚合物材料的前體和化學原料。聚（3-羥基丙酸）[P(3_HP)]是具有有希望的特征例如罕見的高熱穩定性的生物可降解聚合物。
[0003] 3-HP可用于獲得許多有價值的工業化學品，包括：用于制造油漆、紙張、粘合劑、紡織品、特種涂料、油墨和超吸收性聚合物聚丙烯酸酯的丙烯酸；用作溶劑、粘合劑、化妝品或制備地毯和紡織品中使用的聚對苯二甲酸丙二酯的1，3-丙二醇；用于制備食物、用作飼料添加劑和營養工業中的防腐劑的3-輕基丙醒（3-hydroxypropinaldehyde)。
[0004] 3-HP被美國能源部列為第三重要的可再生化學品，并且對于3-HP的全球市場缺口估計為每年363萬噸（Paster et al，2003, USD0E報告：48_ 49)。
[0005] 本發明的目的是提供用于通過微生物發酵生產3-HP的重組微生物和方法，所述方法可提供超過已知方法的一個或多個優點，或至少為公眾提供有用的選擇。

【發明內容】

[0006] 總的來說，本發明尤其提供了用于通過對包含C0和/或co2的底物的微生物發酵生產3-HP的方法，以及在此類方法中使用的重組微生物。它組合兩種不同的0)2固定途徑以產生單一代謝產物。
[0007] 在第一個方面，本發明提供了能夠通過對包含C0和/或0)2的底物發酵產生3-HP 以及任選的一種或多種其他產物的厭氧產乙酸重組微生物。
[0008] 在一個特定實施方案中，微生物被改造為適于表達3-HP生物合成途徑中的一種或多種酶（或其一個或多個亞基），所述酶并非天然存在于用于獲得所述重組微生物的親本微生物中。在另一個實施方案中，微生物被改造為適于過表達3-HP生物合成途徑中的一種或多種酶（或其一個或多個亞基），所述酶天然存在于用于獲得所述重組微生物的親本微生物中。在一個實施方案中，微生物被改造為適于表達3-HP生物合成途徑中的一種或多種酶（或其一個或多個亞基），所述酶并非天然存在于親本微生物中，并且過表達3-HP生物合成途徑中的一種或多種酶（或其一個或多個亞基），所述酶天然存在于親本微生物中。
[0009] 在一個實施方案中，所述一種或多種酶選自：丙二酰輔酶A還原酶（EC 1. 2. 1. 75);乙酰輔酶A羧化酶（ACC)(EC6. 4. 1. 2);以及其中任何一種的功能等價變體。
[0010] 在一個實施方案中，所述親本微生物能夠發酵包含C0和/或co2的底物，以產生乙酰輔酶A，但不能將乙酰輔酶A轉化為3-HP，并且重組微生物被改造為適于表達涉及乙酰輔酶A轉化為3-HP的一種或多種酶（或其一個或多個亞基）。
[0011] 在一個實施方案中，所述微生物包含被改造為適于增加所述親本微生物天然包含的一種或多種核酸的表達的一種或多種外源核酸，并且所述一種或多種核酸編碼上文提及的酶中的一種或多種（或其一個或多個亞基）。
[0012] 在一個實施方案中，被改造為適于增加表達的一種或多種外源核酸是調節元件。在一個實施方案中，所述調節元件是啟動子。
[0013] 在一個實施方案中，所述啟動子是組成型啟動子。在一個實施方案中，所述啟動子選自Wood-Ljungdahl基因簇或磷酸轉乙酰酶/乙酸激酶操縱子啟動子。
[0014] 在一個實施方案中，該微生物包含編碼并被改造為適于表達上文提及的酶中的一種或多種（或其一個或多個亞基）的一種或多種外源核酸。在一個實施方案中，該微生物包含編碼并被改造為適于表達酶中的至少兩種（或其一個或多個亞基）的一種或多種外源核酸。
[0015] 在一個實施方案中，所述一種或多種外源核酸是編碼上文提及的酶中的一種或多種的任何組合的核酸構建體或載體，在一個特定實施方案中，是編碼上文提及的酶中的一種或多種的任何組合的質粒。
[0016] 在一個實施方案中，所述外源核酸是表達質粒。
[0017] 在一個實施方案中，所述親本微生物選自厭氧產乙酸菌。
[0018] 在一個特定實施方案中，所述親本微生物選自一氧化碳營養產乙酸細菌，在一個實施方案中，選自自產乙醇梭菌（Clostridiumautoethanogenum)、揚氏梭菌（Clostridiumljungdahlii)、拉氏梭菌（Clostridiumragsdalei)、食撰基化物梭菌（Clostridiumcarboxidivorans)、德氏梭菌（Clostridiumdrakei)、奠味梭菌（Clostridiumscatologenes)、乙酸梭菌（Clostridiumaceticum)、蟻酸乙酸梭菌（Clostridiumformicoaceticum)、大梭菌（Clostridiummagnum)、食甲基丁酸桿菌（Butyribacteriummethylotrophicum)、伍氏乙酸桿菌（Acetobacteriumwoodii) > 巴氏嗜喊菌（Alkalibaculumbacchii)、Blautiaproducta、游泥真桿菌（Eubacterium limosum)、熱乙酸穆爾氏菌（Moorellathermoacetica)、熱自養穆爾氏菌（Moorella thermautotrophica)、卵形鼠抱菌（Sporomusaovata) >Sporomusasilvacetica、球形鼠抱菌（Sporomusasphaeroides)、普氏產醋桿菌（Oxobacterpfennigii)和凱伍熱厭氧菌 (Thermoanaerobacterkiuvi)〇
[0019] 在一個實施方案中，所述親本微生物是自產乙醇梭菌或揚氏梭菌。在一個特定實施方案中，所述微生物是自產乙醇梭菌DSM23693。在另一個特定實施方案中，所述微生物是揚氏梭菌DSM13528 (或ATCC55383)。
[0020] 在一個實施方案中，所述親本微生物缺乏編碼丙二酰輔酶A還原酶和/或乙酰輔酶A羧化酶或者其一個或多個亞基的一種或多種基因。
[0021] 在第二個方面，本發明提供了編碼一種或多種酶（或其一個或多個亞基）的核酸，當在微生物中表達時，其允許該微生物通過對包含C0和/或C02的底物的發酵產生3-HP。
[0022] 在一個實施方案中，所述核酸編碼兩種或更多種酶（或其一個或多個亞基），當在微生物中表達時，其允許該微生物通過對包含⑶的底物的發酵產生3-HP。
[0023] 在一個實施方案中，所述酶選自丙二酰輔酶A還原酶和乙酰輔酶A羧化酶，以及其任何一種或多種的功能等價變體。
[0024] 在一個實施方案中，所述核酸以任何次序包含編碼丙二酰輔酶A還原酶、乙酰輔酶A羧化酶或其任何一種或多種的功能等價變體的核酸序列。
[0025] 在一個實施方案中，編碼丙二酰輔酶A還原酶的核酸具有SEQIDN0:1或 GI: 163848165,Caur2614的序列，或者是其功能等價變體。
[0026] 在一個實施方案中，編碼乙酰輔酶A羧化酶的核酸包含序列SEQIDN0:18、 20、22 和 24(或CLJU_c42100-40，GI:9447826-31 和GI:163847210-11，Caur_1647-48， GI: 163849262,Caur_3739,GI: 163848951，Caur_3421，GI: 163846951，Caur_1378)，或其任何一種或多種的功能等價變體。乙酰輔酶A羧化酶可包含多個亞基。需要時，這些可在一種或多種核酸上編碼。
[0027] 在一個實施方案中，本發明的核酸還包含啟動子。在一個實施方案中，所述啟動子允許所述基因在其控制下的組成型表達。在特定實施方案中，使用Wood-Ljungdahl簇啟動子。在另一個特定實施方案中，使用磷酸轉乙酰酶/乙酸激酶操縱子啟動子。在一個特定實施方案中，所述啟動子來自自產乙醇梭菌。
[0028] 在第三個方面，本發明提供了包含第二個方面的一種或多種核酸的核酸構建體或載體。
[0029] 在一個特定實施方案中，所述核酸構建體或載體是表達構建體或載體。在一個特定實施方案中，所述表達構建體或載體是質粒。
[0030] 在第四個方面，本發明提供了包含第七個方面的核酸中的任何一種或多種或者第三個方面的載體或構建體的宿主生物。
[0031] 在第五個方面，本發明提供了包含如本發明的第三個方面中提及的表達構建體或載體以及甲基化構建體或載體的組合物。
[0032] 優選地，該組合物能夠產生根據本發明的第一個方面的重組微生物。
[0033] 在一個特定實施方案中，所述表達構建體/載體和/或甲基化構建體/載體是質粒。
[0034] 在第六個方面，本發明提供了通過包括使用本發明的第一個方面的重組微生物發酵包含C0和/或C02的底物的微生物發酵，用于生產3-HP以及任選的一種或多種其他產物的方法。
[0035] 在一個實施方案中，該方法包括下述步驟：
[0036] (a)向含有本發明的第一個方面的一種或多種微生物的培養物的生物反應器中提供包含C0和/或0)2的底物；和
[0037] (b)使生物反應器中的培養物厭氧發酵，以產生3-HP。
[0038] 在一個實施方案中，該方法包括下述步驟：
[0039] (a)在由工業過程產生的含C0和/或C02的氣體釋放到大氣中之前，捕獲所述氣體；
[0040] (b)通過含有本發明的第一個方面的一種或多種微生物的培養物厭氧發酵含C0 和/或C02的氣體，以至少產生3-HP。
[0041] 在所述方法方面的特定實施方案中，所述微生物維持在水性培養基內。
[0042] 在所述方法方面的特定實施方案中，所述底物的發酵在生物反應器中發生。
[0043] 優選地，所述包含C0和/或C02的底物是包含C0和/或C02的氣態底物。在一個實施方案中，所述底物包含工業廢氣。在某些實施方案中，所述氣體是鋼鐵廠廢氣或合成氣。
[0044] 在特定實施方案中，所述底物是包含⑶的底物。
[0045] 在其中所述底物包含C02但不含C0的本發明的實施方案中，所述底物優選地還包含h2。
[0046] 在一個實施方案中，所述底物包含C0和C02。在一個實施方案中，所述底物包含 0)2和H2。在另一個實施方案中，所述底物包含0)、0)2和H2。
[0047] 在一個實施方案中，所述底物通常含有較大比例的C0,例如按體積計至少約20% 至約100%C0,按體積計20 %至70 %C0,按體積計30 %至60 %C0,以及按體積計40 %至 55%C0。在特定實施方案中，所述底物包含按體積計約25%、或約30%、或約35%、或約 40%、或約 45%、或約 50%C0、或約 55%C0、或約 60%C0。
[0048] 在某些實施方案中，該方法還包括從發酵液中回收3-HP以及任選的一種或多種其他產物的步驟。
[0049] 在第七個方面，本發明提供了通過第六個方面的方法產生的3-HP。
[0050] 在另一個方面中，本發明提供了用于產生本發明的第一個方面的微生物的方法，所述方法包括用一種或多種外源核酸轉化親本微生物，使得該微生物能夠通過對包含C0 和/或C02的底物的發酵，產生3-HP以及任選的一種或多種其他產物，其中所述親本微生物不能通過對包含C0和/或C02的底物的發酵產生3-HP。
[0051] 在一個特定實施方案中，用經改造適于表達3-HP生物合成途徑中的一種或多種酶的一種或多種外源核酸轉化親本微生物，所述一種或多種酶并非天然存在于所述親本微生物中。在另一個實施方案中,用經改造適于過表達3-HP生物合成途徑中的一種或多種酶的一種或多種核酸轉化親本微生物，所述一種或多種酶天然存在于所述親本微生物中。在另一個實施方案中，將親本微生物用經改造適于表達3-HP生物合成途徑中的一種或多種酶（所述一種或多種酶并非天然存在于所述親本微生物中）并且過表達3-HP生物合成途徑中的一種或多種酶（所述一種或多種酶天然存在于親本微生物中）的一種或多種外源核酸轉化。
[0052] 在某些實施方案中，所述一種或多種酶是如本文所描述。
[0053] 在某些實施方案中，所述親本微生物是如上文所描述。
[0054] 根據一個實施方案，本發明提供了用于將C0或C02轉化成3-羥基丙酸鹽（3-HP) 的方法。將含C0和/或含0)2的氣態底物傳送至含有在培養基中的一氧化碳營養產乙酸細菌的培養物的生物反應器，使得所述細菌將C0和/或C02轉化為3-HP。所述一氧化碳營養產乙酸細菌被遺傳改造為表達丙二酰輔酶A還原酶。它們還表達不論是天然的還是外源的乙酰輔酶A羧化酶。將3-HP從所述生物反應器中回收。
[0055] 根據另一個實施方案，本發明提供了分離的、遺傳改造的一氧化碳營養產乙酸細菌，其包含編碼丙二酰輔酶A還原酶的核酸。所述核酸對于所述宿主細菌而言是外源的。該細菌表達丙二酰輔酶A還原酶，并且該細菌獲得將三個C0或0)2分子固定到一個3-羥基丙酸鹽（3-HP)分子內的能力。丙二酰輔酶A還原酶通常與SEQIDNO: 1的核苷酸序列編碼的氨基酸序列至少85%相同。
[0056] 該細菌還可包含編碼乙酰輔酶A羧化酶的外源核酸。乙酰輔酶A羧化酶通常與SEQIDN0:18-21的核苷酸序列編碼的氨基酸序列至少85%相同。核酸可與啟動子可操作地連接。核酸可已經是密碼子優化的。所述核酸或所編碼的羧化酶可來自非硫、光合作用細菌。該細菌可選自自產乙醇梭菌、揚氏梭菌、拉氏梭菌、食羰基化物梭菌、德氏梭菌、糞味梭菌、乙酸梭菌、蟻酸乙酸梭菌、大梭菌、食甲基丁酸桿菌、伍氏乙酸桿菌、巴氏嗜堿菌、Blautiaproducta、游泥真桿菌、熱乙酸穆爾氏菌、熱自養穆爾氏菌、卵形鼠孢菌、 Sporomusasilvacetica、球形鼠孢菌、普氏產醋桿菌和凱伍熱厭氧菌。所述外源核酸的供體細菌可以是非硫、光合作用細菌，例如橙色綠屈撓菌（Chloroflexusauranticus)、生金球形菌屬（Metallosphaera)和硫化葉菌屬（Sulfolobus)種。
[0057] 遺傳改造的細菌可通過在包含氣態碳源的培養基中生長而培養。所述碳源可包含 C0和/或C02，其可用作能源或碳源中的任一種或兩者。該細菌可任選地在嚴格的厭氧條件下生長。所述碳源可包含工業廢棄物或廢氣。
[0058] 本發明還可在廣義上被說成單獨地或共同地包含在本申請的說明書中個別或共同提及或指出的部分、元素和特征，以及包含所述部分、元素或特征的兩個或更多個的任何或所有組合，并且當在本文中提及在本發明涉及的領域中具有已知等價物的特定整數時，此類已知等價物應被認為如同單獨提出一樣納入本文。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0059] 應從其所有新穎的方面加以考慮的本發明的這些及其他方面將通過下述參考附圖的描述變得顯而易見，所述描述僅作為示例給出，在所述附圖中：
[0060] 圖1 :用于由3個C0或0)2分子可持續生產1個3-HP分子的兩種C0 2固定途徑的組合。

【具體實施方式】
[0061] 對優選實施方案的下述描述是在廣義上給出的。本發明還由在本文下文的標題 "實例"下給出的公開內容來進一步闡明，所述公開內容提供了支持本發明的實驗數據、本發明的多個方面的具體實例和實施本發明的方式。
[0062] 本發明人已能夠令人驚訝地改造一氧化碳營養產乙酸微生物，以通過發酵包含C0 和/或C02的底物來產生3-羥基丙酸鹽（3-HP)。這提供了用于生產3-HP的可替代方式，所述可替代方式可具有優于當前用于生產3-HP的方法的益處。此外，它提供了使用來自工業過程的一氧化碳的方式，所述一氧化碳原本將被釋放到大氣中并污染環境。
[0063] 在改造本發明的微生物時，本發明人已能夠令人驚訝地組合兩種單獨的0)2固定途徑，如圖1中示出的。這提供了使用包含C0的底物和/或包含C02的底物產生3-HP的可持續發酵。兩種固定〇)2的途徑因此被連接起來以產生所需的產物。
[0064] 在一個實施方案中，本發明描述了通過組合兩種單獨的0)2固定途徑（圖1)，將三個〇)2分子固定到一個3-HP分子內，所述兩種途徑是允許固定兩個C02分子的產乙酸菌的Wood-Ljungdahl途徑，以及允許固定另一個C02分子的3-HP循環的起始碳固定步驟。C02 還可替換為一氧化碳（C0)，因為Wood-Ljungdahl途徑的關鍵酶--C0脫氫酶（C0DH)能夠在生物水煤氣變換反應（C0+H20〈->C02+H2)中將C0轉化成C02和能量。可使用C0和0)2的任何混合物。當使用單獨的(302時,可能需要供應以氫氣（Hydrogen)或電形式的能量，而 C0可充當碳源和能源兩者。
[0065] 雖然本發明人已在自產乙醇梭菌中證實了本發明的效力，但本發明可應用于更廣泛的厭氧產乙酸微生物以及對包含C0和/或co2的底物的發酵，如本文上文和進一步討論的。
[0066] 如本文提及的，"發酵液"是至少包含營養培養基和細菌細胞的培養基。
[0067] 如本文提及的，"穿梭微生物"是在其中表達甲基轉移酶并且不同于目的微生物的微生物。
[0068] 如本文提及的，"目的微生物"是在其中表達在包括表達構建體/載體上的基因并且不同于穿梭微生物的微生物。這也被稱為宿主微生物。
[0069] 術語"主要發酵產物"意指以最高濃度和/或產率產生的一種發酵產物。可存在一種或多種發酵產物。最普遍的可以是或可以不是最有商業價值的。
[0070] 當在提及發酵過程中使用時，術語"增加效率"、"增加的效率"等等包括但不限于增加下列中的一種或多種：催化發酵的微生物生長速率、在升高產物濃度下的生長和/或產物生產率、所產生的所需產物的體積/所消耗底物的體積、所需產物的生產率或生產水平、以及與發酵的其他副產物相比較所產生的所需產物的相對比例。
[0071] 短語"包含一氧化碳的底物"和相似術語應理解為包括其中一氧化碳可被一種或多種細菌菌株利用以例如用于生長和/或發酵的任何底物。
[0072] 短語"包含一氧化碳的氣態底物"以及相似短語和術語包括含有一定水平的一氧化碳的任何氣體。在某些實施方案中，所述底物含有按體積計至少約20 %至約100%C0,按體積計20 %至70%C0,按體積計30 %至60%C0,以及按體積計40 %至55%C0。在特定實施方案中，底物包含按體積計約25%、或約30%、或約35%、或約40%、或約45%、或約 50%C0、或約 55%C0、或約 60%C0。
[0073] 雖然包含C0的底物并不必須要包含任何氫，但4的存在不應不利于依照本發明方法的產物形成。在特定實施方案中，氫的存在導致醇生產的總體效率改善。例如，在特定實施方案中，所述底物可包含大約2:1、或1:1或1:2的H2:C0比。在一個實施方案中，所述底物包含按體積計約30 %或更少的H2、按體積計20 %或更少的H2、按體積計約15 %或更少的4、或者按體積計約10%或更少的4。在其他實施方案中，所述底物流包含低濃度的H2，例如小于5%、或小于4%、或小于3%、或小于2%、或小于1 %或基本上不含氫。所述底物還可含有一些C02，例如按體積計約1%至約80%C02、或按體積計1%至約30%C02。在一個實施方案中，所述底物包含按體積計小于或等于約20%C02。在特定實施方案中，所述底物包含按體積計小于或等于約15%C02、按體積計小于或等于約10%C02、按體積計小于或等于約5 %C02或基本上不含C0 2。
[0074] 短語"包含二氧化碳的底物"和相似術語應理解為包括其中二氧化碳可被一種或多種細菌菌株利用以例如用于生長和/或發酵的任何底物。包含二氧化碳的底物還可包含氫和/或一氧化碳。
[0075] 短語"包含二氧化碳的氣態底物"以及相似短語和術語包括含有一定水平的二氧化碳的任何氣體。在某些實施方案中，底物含有按體積計至少約10%至約60%C02，按體積計20%至50%C02，按體積計30%至60%C02，以及按體積計40%至55%C02。在特定實施方案中，所述底物包含按體積計約20%、或約25%、或約30%、或約35%、或約40%、或約 45%、或約50%0)、或約55%0)、或約60%0) 2。
[0076] 優選地，包含C02的底物還將包含一定水平的C0或112。在特定實施方案中，所述底物包含至少約1:1、或至少約1:2、或至少約1:3、或至少約1:4、或至少約1:5的0)2:11 2比例。
[0077] 在下文的描述中，以遞送并發酵"含有C0和/或0)2的氣態底物"來描述本發明的實施方案。然而，應當理解氣態底物可以替代形式提供。例如，可提供溶解于液體中的含有C0和/或co2的氣態底物。基本上，將液體用含有一氧化碳的氣體飽和，并且隨后將該液體加入生物反應器中。這可使用標準方法來實現。例如，可使用微泡分布發生器（Hensirisak etal,Scale-upofmicrobubbledispersiongeneratorforaerobicfermentation； AppliedBiochemistryandBiotechnology，Volume101，Number3/2002 年 10月）。又例如，含有CO的氣態底物可吸附到固體載體上。使用術語"包含CO和/或C02的底物"等時包括了此類替代方法。
[0078] 在本發明的特定實施方案中，含C0氣態底物（或包含C02、或C0和co2、或〇)2和 H2以及C0的氣態底物）是工業廢氣（offgas或wastegas)。"工業廢氣"應在廣義上理解為為包括由工業過程產生的包含C0和/或C02的任何氣體，并且包括因鐵金屬產品制造、非鐵產品制造、石油精煉過程、煤炭氣化、生物質氣化、電力生產、碳黑生產和焦炭制造而產生的氣體。進一步的例子可在本文其他地方提供。
[0079] 除非上下文另有要求，否則如本文使用的，短語"發酵"、"發酵過程"或"發酵反應" 等意欲包含所述過程的生長期和產物生物合成期兩者。如本文進一步描述的，在一些實施方案中，生物反應器可包括第一生長反應器和第二發酵反應器。因此，向發酵反應中添加金屬或組合物應理解為包括向這些反應器中的任一或兩者中的添加。
[0080] 術語"生物反應器"包括由一個或多個容器和/或塔或管道排列組成的發酵裝置，所述發酵裝置包括連續攪拌釜式反應器（CSTR)、固定化細胞反應器（ICR)、滴流床反應器 (TBR)、鼓泡塔、氣升式發酵罐、靜態混合器或者適合于氣體-液體接觸的其他容器或其他裝置。在一些實施方案中，生物反應器可包括第一生長反應器和第二發酵反應器。因此，當提及向生物反應器或發酵反應中添加底物時，應理解為包括適當時向這些反應器中的任一或兩者中的添加。
[0081] "外源核酸"是源于待將它們引入其中的微生物之外的核酸。外源核酸可源自任何適當來源，包括但不限于待將它們引入其中的微生物，與待將它們引入其中的生物不同的微生物菌株或物種，或者它們可以是人工或重組方法制備的。當生物是遺傳改造的或重組體時，它含有與不同于天然存在于微生物中的序列的序列鄰近的序列。在一個實施方案中，外源核酸代表天然存在于待將它們引入其中的微生物中的核酸序列，并且將它們引入以增加特定基因的表達或過表達特定基因（例如，通過增加所述序列（例如基因）的拷貝數，或引入強啟動子或組成型啟動子以增加表達）。在另一個實施方案中，外源核酸代表并非天然存在于待將它們引入其中的微生物中的核酸序列，并且所述外源核酸允許表達并非天然存在于微生物內的產物或增加微生物中天然基因的表達（例如在引入調節元件例如啟動子的情況下）。外源核酸可被改造為適于整合到待將它引入其中的微生物的基因組內，或保持染色體外的狀態。外源序列可來自異源來源，例如另一個種、屬、科或界。在任何情況下，如此產生的細菌是非天然存在的，具有例如因序列差異或因拷貝數差異而不同于天然存在的細菌的遺傳互補。
[0082] 應當理解本發明可使用其序列不同于本文具體示例的序列的核酸來實施，條件是它們執行基本上相同的功能。對于編碼蛋白質或肽的核酸序列，這意指所編碼的蛋白質或肽具有基本上相同的功能。對于代表啟動子序列的核酸序列，變體序列將具有促進一種或多種基因表達的能力。此類核酸在本文中可被稱為"功能等價變體"。例如，核酸的功能等價變體包括等位基因變體、基因的片段、包括突變（缺失、插入、核苷酸置換等）和/或多態性的基因等。來自其他微生物的同源基因也可視為本文具體示例的序列的功能等價變體的實例。
[0083] 這些包括在諸如揚氏梭菌、橙色綠屈撓菌、生金球形菌屬或硫化葉菌屬種的物種中的同源基因，其細節在網站例如Genbank或NCBI上可公開獲得。短語"功能等價變體"還應視為包括其序列因針對特定生物的密碼子優化而改變的核酸。本文中核酸的"功能等價變體"優選與經鑒定的核酸具有至少大約70%、優選大約80%、更優選大約85%、優選大約 90%、優選大約95%或更高的核酸序列同一性。
[0084] 還應當理解本發明可使用其序列不同于本文具體示例的氨基酸序列的多肽實施。這些變體在本文中可被稱為"功能等價變體"。蛋白質或肽的功能等價變體包括這樣的蛋白質或肽，即所述蛋白質或肽與經鑒定的蛋白質或肽享有至少40%、優選50%、優選60%、優選70%、優選75%、優選80%、優選85%、優選90%、優選95%或更高的氨基酸同一性并且具有與目的肽或蛋白質基本上相同的功能。此類變體在它們的范圍內包括蛋白質或肽的片段，其中所述片段包含截短形式的多肽，其中缺失可以是1至5、至10、至15、至20、至25個氨基酸，并且可在多肽的任一末端處從1位殘基延伸到25位殘基，并且其中缺失可為所述區域內的任何長度；或可在內部位置處。本文中具體多肽的功能等價變體還應視為包括由其他細菌菌種中的同源基因表達的多肽，例如如先前段落中示例的。
[0085] 如本文使用的"基本上相同的功能"意指核酸或多肽能夠進行它是其變體的核酸或多肽的功能。例如，本發明的酶的變體將能夠與該酶一樣催化相同的反應。然而，它不應視為意指變體具有與它是其變體的多肽或核酸相同的活性水平。
[0086] 可使用很多已知方法評價功能等價變體是否具有與它是其變體的核酸或多肽基本上相同的功能。然而，例如，由ffligler等人（2002,J.Bacteriol. 184:2404 - 2410)或Kroeger等人（2011，Anal.Biochem. 411:100-5)概述的方法可分別用于測量丙二酰輔酶A 還原酶和乙酰輔酶A羧化酶的活性。
[0087] 當用于本發明時，"過表達"以及相似術語和短語應在廣義上視為包括在相同條件下與親本微生物的蛋白質表達水平相比較，一種或多種蛋白質表達的任何增加。它不應視為意指蛋白質以任何特定水平表達。
[0088] "親本微生物"是用于生成本發明的重組微生物的微生物。親本微生物可以是在自然界中存在的微生物（即，野生型微生物），或已被預先修飾但不表達或不過表達本發明中題述酶中的一種或多種的微生物。因此，本發明的重組微生物已被修飾，以表達或過表達在親本微生物中不表達或不過表達的一種或多種酶。
[0089] 術語核酸"構建體"或"載體"和相似術語應在廣義上視為包括適合用作載體 (vehicle)以將遺傳材料轉移到細胞內的任何核酸（包括DNA和RNA)。該術語應視為包括質粒、病毒（包括細菌噬菌體）、粘粒和人工染色體。構建體或載體可包括一種或多種調節元件、復制起點、多克隆位點和/或可選擇標記。在一個特定實施方案中，構建體或載體被改造為適于允許表達由該構建體或載體編碼的一種或多種基因。核酸構建體或載體包括裸核酸以及用一種或多種試劑配制的核酸，以促進向細胞的遞送（例如脂質體綴合的核酸，包含所述核酸的生物）。
[0090] "3-HP生物合成途徑"是允許下列轉化的酶促途徑：乙酰輔酶A至丙二酰輔酶A至丙二酸半醛至3-HP的轉化。除非上下文另有明確要求，否則提及3-HP生物合成途徑中的酶應視為包括提及該酶的任何一個或多個亞基。僅作為實例，乙酰輔酶A羧化酶可包含四個亞基。
[0091] 微牛物
[0092] 如本文上文討論的，本發明提供了能夠通過發酵包含C0和/或C02的底物，產生 3-HP以及任選的一種或多種其他產物的重組微生物。
[0093] 在一個特定實施方案中，所述微生物被改造為適于表達3-HP生物合成途徑中的一種或多種酶（或其一個或多個亞基），所述一種或多種酶并非天然存在于用于獲得該微生物的親本微生物中。在另一個實施方案中，所述微生物被改造為適于過表達3-HP生物合成途徑中的一種或多種酶（或其一個或多個亞基），所述一種或多種酶天然存在于親本微生物中。
[0094] 在一個實施方案中，所述親本微生物能夠發酵包含C0的底物，以產生乙酰輔酶A，但不能將乙酰輔酶A轉化為3-HP，并且所述重組微生物被改造為適于表達參與乙酰輔酶A 轉化為3-HP的一種或多種酶（或其一個或多個亞基）。在一個實施方案中，所述親本微生物能夠將乙酰輔酶A轉化為丙二酰輔酶A，但不能將丙二酰輔酶A轉化為3-HP。在另一個實施方案中，所述親本微生物能夠將丙二酰輔酶A轉化為3-HP，但不能將乙酰輔酶A轉化為丙二酰輔酶A。
[0095] 在一個實施方案中，所述3-HP生物合成中的一種或多種酶選自：丙二酰輔酶A還原酶、乙酰輔酶A羧化酶以及其任何一種或多種的功能等價變體。
[0096] 所述微生物可被改造為適于通過很多重組方法表達或過表達一種或多種酶（或其一個或多個亞基），所述重組方法包括例如，增加該微生物內的天然基因的表達（例如通過引入更強的啟動子或組成型啟動子以驅動基因的表達），通過引入編碼并被改造為適于表達該酶的外源核酸來增加編碼特定酶的基因拷貝數，引入編碼并被改造為適于表達并非天然存在于親本微生物內的酶的外源核酸。
[0097] 在某些實施方案中，可轉化所述親本微生物，以提供所述親本微生物天然包含的一種或多種基因的表達增加或過表達與引入非親本微生物天然包含的一種或多種基因的組合。例如，編碼3-HP生物合成途徑中的一種或多種酶的一種或多種基因是所述親本微生物天然包含的，但它可能不包括編碼該途徑中的一種或多種其他酶的一種或多種其他基因。所述微生物可例如被改造，以過表達天然的乙酰輔酶A羧化酶，并且引入編碼用于將丙二酰輔酶A轉化為3-HP的酶（例如丙二酰輔酶A還原酶）的丙二酰輔酶A還原酶基因。或者，所述微生物可被改造，以過表達天然的丙二酰輔酶A還原酶，并且引入編碼乙酰輔酶 A羧化酶的基因。技術人員將知道在本發明中使用的多種其他組合。
[0098] 僅作為例子，丙二酰輔酶A還原酶的示例性序列信息在本文中以SEQIDNO: 1的形式提供，并且還使用登錄號YP_001636209. 1/Caur_2614,GI: 163848165在公共數據庫上提供。作為另外的例子，乙酰輔酶A羧化酶的示例性序列信息在本文中以SEQIDN0:18-21 的形式提供，并且還使用登錄號NC_014328. 1-33. l/CLJU_c42100-40，GI:9447826-31和GI:163847210-11，Caur_1647-48，YP_001635254. 1-55. 1 ;GI:163849262,Caur_3739, YP_001637306. 1；GI:163848951, Caur_3421, YP_001636995. 1；GI:163846951, Caur_1378, YP_001634995. 1在公共數據庫上提供。可使用天然存在的酶或合成的酶。通常，該酶與由根據SEQ ID NO: 1或18-21的核酸編碼的序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少 88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
[0099] 在本發明的微生物中使用的酶（以及編碼它們的任何相應基因）可源自任何適當來源，包括細菌的不同屬和種或其他生物。然而，在一個實施方案中，丙二酰輔酶A還原酶是源自橙色綠屈撓菌、揚氏梭菌、生金球形菌屬或硫化葉菌屬種的酶。在一個實施方案中，丙二酰輔酶A還原酶具有上文示例的氨基酸序列，或它是其功能等價變體。在一個實施方案中，乙酰輔酶A羧化酶是源自揚氏梭菌、橙色綠屈撓菌、生金球形菌屬或硫化葉菌屬種的酶。在一個實施方案中，乙酰輔酶A羧化酶具有上文示例的氨基酸序列，或它是其功能等價變體。
[0100] 丙二酰輔酶A還原酶（EC 1.2. 1.75)屬于短鏈還原酶（SDR)組，并且可得自細菌如綠色非硫光養細菌（綠彎菌門（Chloroflexi))橙色綠屈撓菌（YP_001636209. 1 ; AAS20429.1)、聚集綠曲撓絲狀菌（Chloroflexus aggregans)(YP_002462600. 1)、毛樣顫綠菌（Oscillochloris trichoides) (WP_006561105. 1)、卡斯特玫瑰彎菌 (Roseiflexus castenholzii)(YP_001433009.1)或玫瑰彎菌屬種（Roseiflexus sp. )(YP_001277512. 1)，以及a變形菌綱（alpha-proteobacteria)如赤桿菌屬種（Erythrobacter sp.)(WP_0〇7l6368〇)和如Y變形菌綱（WP_0〇9〇l9528.l、 WP_007234918. 1、WP_009021869. 1、WP_009470571. 1)，并且可得自嗜熱嗜酸古細菌如泉古頭寇硫化葉菌（Crenarchaeotes Sulfolobus tokodaii)(NP_378167.1)、好客嗜酸兩面菌（Acidianus hospitalis) (YP_004459517. 1)、銅生金球形菌（Metallosphaera cuprina) (YP_004410014. 1)、勤奮生金球形菌（Metallosphaera sedula)(YP_001190808. 1)、硫橫礦硫化葉菌（Sulfolobus solfataricus) (NP_343563. 1)、黃石生金球形菌 (Metallosphaera yellowstonensis)(WP_009071519. 1)、冰島硫化葉菌（Sulfolobus islandicus)(YP_002844727.1;YP_002833533.1;YP_002830795.1)、嗜酸熱硫化葉菌（Sulfolobus acidocaldarius) (YP_256941. 1 ;YP_256733. 1)，以及如深處古生球菌 (Archaeoglobus profundus)(YP_003401535. 1),和Candidatus Chloracidobacterium thermophilum(YP_004863680. 1)或Caldiarchaeum subterraneum(BAJ47902. 1)。
[0101] 乙酰輔酶A羧化酶（EC1.2. 1.75)屬于生物素依賴性羧化酶組，并且可得自細菌如綠色非硫光養細菌（綠彎菌門）如橙色綠屈撓菌（YP_001635254. 1-55. 1 ; YP_001637306. 1 ;YP_001636995. 1 ;YP_001634995. 1)，或一氧化碳營養產乙酸菌如揚氏梭菌（NC_014328. 1-33.1)。
[0102] 在一個實施方案中，該微生物包含被改造為適于增加所述親本微生物天然包含的一種或多種核酸的表達的一種或多種外源核酸，并且所述一種或多種核酸編碼上文提及的酶中的一種或多種（或其一個或多個亞基）。在一個實施方案中，被改造為適于增加表達的一種或多種外源核酸是調節元件。在一個實施方案中，所述調節元件是啟動子。在一個實施方案中，啟動子是優選在適當發酵條件下具有高度活性的組成型啟動子。還可使用誘導型啟動子。在優選實施方案中，所述啟動子選自Wood-Ljungdahl基因簇或磷酸轉乙酰酶/ 乙酸激酶操縱子啟動子。本領域技術人員應當理解可指導表達（優選在適當發酵條件下高水平表達）的其他啟動子可有效作為示例實施方案的替代物。當啟動子處于使得它驅動下游編碼序列表達的位置時，它被稱為可操作地連接的。
[0103]在一個實施方案中，該微生物包含編碼并被改造為適于表達上文提及的酶中的一種或多種（或其一種或多種亞基）的一種或多種外源核酸。在一個實施方案中，該微生物包含編碼并被改造為適于表達所述酶中的至少兩種（或其一個或多個亞基）的一種或多種外源核酸。
[0104]在一個特定實施方案中，該微生物包含編碼丙二酰輔酶A還原酶或其功能等價變體的一種或多種外源核酸。在一個特定實施方案中，該微生物包含編碼乙酰輔酶A羧化酶或其功能等價變體的一種或多種外源核酸。乙酰輔酶A羧化酶可由4個亞基組成，其中每個亞基由不同基因編碼。這些基因可被組合在單一核酸中或者一起編碼完整酶的兩種或更多種核酸中。此外，特定親本微生物可含有針對這些亞基中的僅一個、兩個或三個的基因。因此，本發明包含使用一種或多種外源核酸改造所述微生物，以僅表達所述亞基中的一個、兩個或三個。類似地，它包含改造微生物以過表達所述亞基中的一個或多個，如果所述基因是所述微生物天然包含的。還設想了天然亞基基因的過表達和任何缺失亞基基因的引入的組合。
[0105]在一個實施方案中，丙二酰輔酶A還原酶是由包含SEQIDNO: 1的核酸或其功能等價變體編碼。在一個實施方案中，乙酰輔酶A羧化酶是由包含SEQIDN0:18、19、20和21 的一種或多種核酸或者其中任何一種或多種的功能等價變體編碼。或者，該酶可由如可公開獲得的數據庫中所述的核酸序列編碼，例如上文所列出的。
[0106]該微生物可包含一種或多種外源核酸。當希望用兩種或更多種遺傳元件（例如基因或調節元件（例如啟動子））轉化親本微生物時，它們可被包含在一種或多種外源核酸上。
[0107]在一個實施方案中，所述一種或多種外源核酸是編碼上文提及的酶中的一種或多種的任何組合的核酸構建體或載體（在一個特定實施方案中，是質粒）。
[0108]所述外源核酸在轉化親本微生物后可保留在染色體外或可整合到親本微生物的基因組內。因此，它們可包括另外的核苷酸序列，所述另外的核苷酸序列被改造為適于協助整合（例如，允許同源重組和靶向整合到宿主基因組內的區域）或染色體外構建體的表達和復制（例如復制起點、啟動子和其他調節元件或序列）。
[0109]在一個實施方案中，編碼如本文上文提及的一種或多種酶（或其一個或多個亞基）的外源核酸還將包含被改造為適于促進由外源核酸編碼的一種或多種酶的表達的啟動子。在一個實施方案中，所述啟動子是優選在適當發酵條件下具有高度活性的組成型啟動子。還可使用誘導型啟動子。在優選實施方案中，所述啟動子選自Wood-Ljungdahl基因簇和磷酸轉乙酰酶/乙酸激酶啟動子。本領域技術人員應當理解可指導表達（優選在適當發酵條件下高水平表達）的其他啟動子有效作為示例實施方案的替代物。
[0110] 在一個實施方案中，外源核酸是表達質粒。
[0111] 在一個實施方案中，親本微生物選自厭氧產乙酸菌。
[0112] 在一個特定實施方案中，所述親本微生物選自一氧化碳營養產乙酸細菌。在某些實施方案中，該微生物選自自產乙醇梭菌、揚氏梭菌、拉氏梭菌、食羰基化物梭菌、德氏梭菌、糞味梭菌、乙酸梭菌、蟻酸乙酸梭菌、大梭菌、食甲基丁酸桿菌、伍氏乙酸桿菌、巴氏嗜堿菌、Blautiaproducta、游泥真桿菌、熱乙酸穆爾氏菌、熱自養穆爾氏菌、卵形鼠孢菌、 Sporomusasilvacetica、球形鼠孢菌、普氏產醋桿菌和凱伍熱厭氧菌。
[0113] 在一個特定實施方案中，所述親本微生物選自產乙醇、產乙酸梭菌，包括以下種：自產乙醇梭菌、楊氏梭菌和拉氏梭菌以及相關分離物。這些包括但不限于下述菌株：自產乙醇梭菌JAI_1T(DSM10061)[AbriniJ，NaveauH，NynsE-J:Clostridium autoethanogenum,sp.nov. ,ananaerobicbacteriumthatproducesethanolfrom carbonmonoxide.ArchMicrobiol1994, 4:345-351]，自產乙醇梭菌LBS1560 (DSM19630) [SimpsonSD，ForsterRL，TranPT,RoweMJ,WarnerIL:Novelbacteriaandmethods thereof.國際專利 2009,W0/2009/064200]，自產乙醇梭菌LBS1561 (DSM23693)，楊氏梭菌 PETCt(DSM13528 =ATCC55383)[TannerRS,MillerLM,YangD:Clostridium. 1jungdahlii sp.nov.,anAcetogenicSpeciesinClostridialrRNAHomologyGroupI.IntJSyst Bacteriol1993,43:232-236]，楊氏梭菌ERI-2(ATCC55380)[GaddyJL:Clostridium stainwhichproducesaceticacidfromwastegases.美國專利 1997, 5, 593, 886]，楊氏梭菌C_01(ATCC55988)[GaddyJL，ClausenEC，KoC_W:Microbialprocessfor thepreparationofaceticacidaswellassolventforitsextractionfrom thefermentationbroth?美國專利，2002,6,368,819]，楊氏梭菌 0-52(ATCC55989) [GaddyJL，ClausenEC,KoC-W:Microbialprocessforthepreparationofacetic acidaswellassolventforitsextractionfromthefermentationbroth.美國專利，2002,6,368,819]，拉氏梭菌P11t(ATCCBAA-622)[HuhnkeRL，LewisRS，Tanner RS:IsolationandCharacterizationofnovelClostridialSpecies.國際專利 2008， TO2008/028055]，相關分離物例如 "C.coskatii"[Zahnetal-Novelethanologenic speciesClostridiumcoskatii(美國專利申請號US20110229947)]和"梭菌屬種"(Tyurin etal.，2012,J.BiotechRes. 4:1-12)，或突變株例如拉氏梭菌 0TA-1 (Tirado-Acevedo 0.ProductionofBioethanolfromSynthesisGasUsingClostridium1jungdahlii. PhDthesis，北卡羅萊納州立大學，2010)。這些菌株在梭菌rRNA簇I內形成亞簇，并且它們的16SrRNA基因超過99%相同，具有相似的約30%的低GC含量。然而，DNA-DNA重新組合和DNA指紋實驗顯不這些菌株屬于種[HuhnkeRL，LewisRS，TannerRS:Isolationand CharacterizationofnovelClostridialSpecies?國際專利 2008,TO2008/028055]。
[0114] 該簇的所有種均具有相似的形態和大小（對數生長的細胞為0.5-0. 7x3-5um)，是嗜溫的（最適生長溫度為30-37 °C)和嚴格厭氧菌[TannerRS^illerLM，Yang D:Clostridium1jungdahliisp.nov. ,anAcetogenicSpeciesinClostridialrRNA HomologyGroupI.IntJSystBacteriol1993, 43:232-236；AbriniJ,NaveauH,Nyns E-J:Clostridiumautoethanogenum,sp.nov. ,ananaerobicbacteriumthatproduces ethanolfromcarbonmonoxide.ArchMicrobiol1994,4:345-351;HuhnkeRL,Lewis RS，TannerRS:IsolationandCharacterizationofnovelClostridialSpecies. 國際專利2008,W0 2008/028055]。此外，它們均共享相同的主要的系統發育性狀，例如相同的pH范圍（pH4-7. 5,最適起始pH為5. 5-6)，以含CO氣體的強自養生長并伴隨相似的生長速率，和以乙醇和乙酸作為主要發酵終產物的相似的代謝譜，以及在某些條件下形成少量的2,3-丁二醇和乳酸。[131111611^，]\1；[1161'111，￥31^0:(]1〇81：1'1(1；[11111 1jungdahliisp.nov. ,anAcetogenicSpeciesinClostridialrRNAHomologyGroup I.IntJSystBacteriol1993, 43:232-236；AbriniJ,NaveauH,NynsE-J:Clostridium autoethanogenum,sp.nov. ,ananaerobicbacteriumthatproducesethanolfrom carbonmonoxide.ArchMicrobiol1994, 4:345-351;HuhnkeRL,LewisRS,Tanner RS:IsolationandCharacterizationofnovelClostridialSpecies.國際專利 2008, W02008/028055]。對于所有三個種還觀察到吲哚產生。然而，所述種的區別在于多種糖（例如鼠李糖、阿拉伯糖）、酸（例如葡糖酸、檸檬酸）、氨基酸（例如精氨酸、組氨酸）或其他底物（例如甜菜堿、丁醇）的底物利用。此外，發現一些種對于某些維生素（例如硫胺素、生物素）是營養缺陷型的，而其他種則不是。
[0115] 在一個實施方案中，所述親本菌株使用C0作為其唯一碳源和能源。
[0116] 在一個實施方案中，所述親本微生物是自產乙醇梭菌或揚氏梭菌。在一個特定實施方案中，所述微生物是自產乙醇梭菌DSM23693。在另一個特定實施方案中，所述微生物是揚氏梭菌DSM13528 (或ATCC55383)。
[0117] 在一個實施方案中，所述親本微生物缺乏編碼丙二酰輔酶A還原酶或乙酰輔酶A 羧化酶（或其一個或多個亞基）的一種或多種基因。
[0118] 核酸
[0119] 本發明還提供了用于生成本發明的重組微生物的核酸和核酸構建體。
[0120] 在一個實施方案中，所述核酸包含編碼3-HP生物合成途徑中的一種或多種酶（或其一個或多個亞基）的一種或多種序列，當在微生物中表達時，其允許該微生物通過發酵包含C0和/或C02的底物產生3-HP。在一個特定實施方案中，本發明提供了編碼兩種或更多種酶（或其一個或多個亞基）的核酸，當在微生物中表達時，其允許該微生物通過發酵包含C0和/或C02的底物產生3-HP。
[0121] 在一個特定實施方案中，該酶選自丙二酰輔酶A還原酶、乙酰輔酶A羧化酶以及其中任何一種或多種的功能等價變體。
[0122] 在一個實施方案中，本發明的核酸以任何次序包含編碼丙二酰輔酶A還原酶、乙酰輔酶A羧化酶或其中任何一種或多種的功能等價變體的一種或多種核酸序列。
[0123] 在一個實施方案中，本發明的核酸以任何次序包含編碼乙酰輔酶A羧化酶的一個或多個亞基或其中任何一種或多種的功能等價變體的一種或多種核酸序列。
[0124] 編碼上述酶中每一種的示例性氨基酸序列和核酸序列在本文中提供，或者可獲自如上文提及的GenBank。然而，考慮到在本文中、在GenBank及其他數據庫中所含有的信息和遺傳密碼，技術人員應當容易地知道編碼所述酶或其功能等價變體的可替代核酸序列。
[0125] 在一個實施方案中，丙二酰輔酶A還原酶具有如上文描述的序列或是其功能等價變體。
[0126] 在一個實施方案中，編碼乙酰輔酶A羧化酶的核酸序列具有如上文描述的序列或是其功能等價變體。
[0127] 在一個實施方案中，本發明的核酸還包含啟動子。在一個實施方案中，所述啟動子允許所述基因在其控制下的組成型表達。然而，還可采用誘導型啟動子。技術人員應當容易地知道用于本發明的啟動子。優選地，啟動子可指導在適當發酵條件下的高水平表達。在特定實施方案中，使用Wood-Ljungdahl簇啟動子。在另一個實施方案中，使用磷酸轉乙酰酶/乙酸激酶啟動子。在另一個實施方案中，使用丙酮酸鹽：鐵氧還蛋白氧化還原酶啟動子、Rnf復合體操縱子啟動子或ATP合酶操縱子啟動子。在一個特定實施方案中，所述啟動子來自自產乙醇梭菌。
[0128] 本發明的核酸在轉化親本微生物后可保留在染色體外或可被改造為適于整合到所述微生物的基因組內。因此，本發明的核酸可包括另外的核苷酸序列，所述另外的核苷酸序列被改造為適于協助整合（例如，允許同源重組和靶向整合到宿主基因組內的區域）或染色體外構建體的穩定表達和復制（例如復制起點、啟動子和其他調節序列）。
[0129] 在一個實施方案中，所述核酸是核酸構建體或載體。在一個特定實施方案中，所述核酸構建體或載體是表達構建體或載體，然而，本發明包含其他構建體和載體例如用于克隆的那些。在一個特定實施方案中，所述表達構建體或載體是質粒。
[0130] 應當理解，出所述啟動子外，本發明的表達構建體/載體還可包含任意數目的調節元件，以及需要時適合于表達其他蛋白質的另外的基因。在一個實施方案中，所述表達構建體/載體包括一個啟動子。在另一個實施方案中，所述表達構建體/載體包括兩個或更多個啟動子。在一個特定實施方案中，對于待表達的每種基因，所述表達構建體/載體包括一個啟動子。在一個實施方案中，所述表達構建體/載體包括一個或多個核糖體結合位點，優選用于每種待表達基因的核糖體結合位點。
[0131] 本領域技術人員應當理解本文描述的核酸序列和構建體/載體序列可含有標準接頭核苷酸，例如核糖體結合位點和/或限制性位點所需的那些接頭核苷酸。此類接頭序列不應解釋為是必需的并且不對所定義的序列產生限制。
[0132] 本發明的核酸和核酸構建體，包括表達構建體/載體，可使用任意數目的本領域中已知的技術進行構建。例如，可使用化學合成或重組技術。此類技術記載于例如Sambrook etal(MolecularCloning:Alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratory Press,ColdSpringHarbor,NY, 1989)。進一步的示例性技術記載于在下文實施例部分中。基本上，各個基因和調節元件彼此可操作地連接，使得可表達所述基因以形成所需蛋白質。本領域普通技術人員應當理解用于本發明的合適載體。然而，例如，下述載體可以是合適的：PMTL80000載體、pMPl、pJIR750以及下文實施例部分中示例的質粒。
[0133] 應當理解本發明的核酸可采取任何適當的形式，包括RNA、DNA或cDNA。
[0134] 本發明還提供了包含本文描述的核酸中的任何一種或多種的宿主生物，特別是微生物，并且包括病毒、細菌和酵母。
[0135] 所述一種或多種外源核酸可作為裸核酸遞送至親本微生物，或可用一種或多種試劑配制以促進轉化過程（例如脂質體綴合的核酸，其中包含核酸的生物）。適當時，所述一種或多種核酸可以是DNA、RNA或其組合。限制性抑制劑可用于某些實施方案中；參見例如 Murray,N.E.etal. (2000)Microbial.Molec.Biol.Rev. 64, 412. ) 〇
[0136] 可使用任何數目的本領域中已知的用于產生重組微生物的技術，由親本微生物和一種或多種外源核酸制備本發明的微生物。僅作為實例，轉化（包括轉導或轉染）可通過電穿孔、超聲處理、聚乙二醇介導的轉化、化學或天然感受態或者綴合來實現。合適的轉化技術記載于例如SambrookJ，FritschEF，ManiatisT:MolecularCloning:Alaboratory Manual,ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour, 1989 中。
[0137] 在某些實施方案中，由于待轉化的微生物中有活性的限制系統，必須甲基化待引入微生物內的核酸。這可使用多種技術包括下文描述的技術來完成，并且在下文實施例部分中進一步示例。
[0138] 例如，在一個實施方案中，本發明的重組微生物是通過包括下述步驟的方法產生：將下述引入穿梭微生物內：（i)如本文描述的表達構建體/載體，和（ii)包含甲基轉移酶基因的甲基化構建體/載體；表達甲基轉移酶基因；從穿梭微生物中分離一種或多種構建體/載體；以及將一種或多種構建體/載體引入目的微生物內。
[0139] 在一個實施方案中，步驟B的甲基轉移酶基因是組成型地表達的。在另一個實施方案中，步驟B的甲基轉移酶基因的表達是被誘導的。
[0140] 所述穿梭微生物是促進對構成所述表達構建體/載體的核酸序列的甲基化的微生物，優選是限制性陰性微生物。在特定實施方案中，所述穿梭微生物是限制性陰性大腸桿菌（E.coli)、枯草芽抱桿菌（Bacillussubtilis)或乳酸乳球菌（Lactococcuslactis)。
[0141] 甲基化構建體/載體包含編碼甲基轉移酶的核酸序列。
[0142] -旦將表達構建體/載體和甲基化構建體/載體引入穿梭微生物內，就誘導甲基化構建體/載體上存在的甲基轉移酶基因。誘導可以是通過任何合適的啟動子系統，盡管在本發明的一個特定實施方案中，甲基化構建體/載體包含誘導型lac啟動子，并且是通過添加乳糖或其類似物，更優選異丙基-P-D-硫代半乳糖苷（IPTG)進行誘導。其他合適的啟動子包括ara、tet或17系統。在本發明的另一個實施方案中，甲基化構建體/載體啟動子是組成型啟動子。
[0143] 在一個特定實施方案中，所述甲基化構建體/載體具有特異性針對所述穿梭微生物的種類的復制起點，使得所述甲基化構建體/載體上存在的任何基因在所述穿梭微生物中表達。優選地，所述表達構建體/載體具有特異性針對目的微生物的種類的復制起點，使得所述表達構建體/載體上存在的任何基因在目的微生物中表達。
[0144] 甲基轉移酶的表達導致所述表達構建體/載體上存在的基因的甲基化。根據許多已知方法中的任何一種，隨后可從所述穿梭微生物中分離所述表達構建體/載體。僅作為實例，下文描述的實施例部分中所述的方法可用于分離表達構建體/載體。
[0145] 在一個特定實施方案中，兩種構建體/載體被同時分離。
[0146] 可使用任意數目的已知方法將所述表達構建體/載體引入所述目的微生物內。然而，例如，可使用下文實施例部分中所述的方法。因為所述表達構建體/載體是甲基化的，所以所述表達構建體/載體上存在的核酸序列能夠被納入目的微生物內并成功表達。
[0147] 應想到可將甲基轉移酶基因引入穿梭微生物內并過表達。因此，在一個實施方案中，所得的甲基轉移酶可使用已知方法收集，并且在體外用于甲基化表達質粒。隨后可將所述表達構建體/載體引入目的微生物內用于表達。在另一個實施方案中，將所述甲基轉移酶基因引入穿梭微生物的基因組內，隨后將所述表達構建體/載體引入所述穿梭微生物內，從所述穿梭微生物中分離一種或多種構建體/載體,并且隨后將所述表達構建體/載體引入所述目的微生物內。
[0148] 應想到可組合如上定義的所述表達構建體/載體和所述甲基化構建體/載體，以提供物質的組合物。此類組合物在避開限制性障礙機制以產生本發明的重組微生物中特別有用。
[0149] 在一個特定實施方案中，所述表達構建體/載體和/或所述甲基化構建體/載體是質粒。
[0150] 本領域普通技術人員應當理解用于產生本發明的微生物的許多合適的甲基轉移酶。然而，例如，可使用枯草芽孢桿菌噬菌體OT1甲基轉移酶和下文實施例中所述的甲基轉移酶。在一個實施方案中，所述甲基轉移酶具有SEQIDN0:6的氨基酸序列，或是其功能等價變體。考慮到所需甲基轉移酶的序列和遺傳密碼，編碼合適甲基轉移酶的核酸是容易想到的。在一個實施方案中，編碼甲基轉移酶的核酸是如下文實施例中所述（例如SEQID NO:26的核酸，或它是其功能等價變體）。
[0151] 被改造為適于允許甲基轉移酶基因表達的任意數目的構建體/載體均可用于生成所述甲基化構建體/載體。然而，例如，可使用下文實施例部分中所述的質粒（例如，SEQ IDN0:7)。
[0152] 牛產方法
[0153] 本發明提供了通過包括使用本發明的重組微生物發酵包含C0和/或C02的底物的微生物發酵，用于生產3-HP以及任選的一種或多種其他產物的方法。優選地，3-HP是主要發酵產物。本發明的方法可用于減少來自工業過程的總大氣碳排放。
[0154] 優選地，所述發酵包括使用本發明的重組微生物厭氧發酵生物反應器中的底物以至少產生3-HP的步驟。
[0155] 在一個實施方案中，該方法包括下述步驟：
[0156] (a)向含有本發明的一種或多種微生物的培養物的生物反應器中提供包含C0和/ 或〇)2的底物；和
[0157] (b)厭氧發酵生物反應器中的培養物，以至少產生3-HP。
[0158] 在一個實施方案中，該方法包括下述步驟：
[0159] (a)在因工業過程產生的含C0和/或0)2氣體釋放到大氣中之前，捕獲所述氣體；
[0160] (b)通過含有本發明的一種或多種微生物的培養物厭氧發酵所述含C0和/或C02 氣體，以至少產生3-HP。
[0161] 在一個實施方案中，底物包含C0。在一個實施方案中，底物包含C0和C02。在另一個實施方案中，底物包含〇)2和h2。在另一個實施方案中，底物包含〇)2和C0以及h2。
[0162] 在本發明的一個特定實施方案中，由微生物發酵的氣態底物是含有C0的氣態底物。所述氣態底物可以是作為工業過程的副產物而獲得的含C0廢氣，或來自一些其他來源例如來自汽車尾氣。在某些實施方案中，所述工業過程選自鐵金屬產品制造例如鋼鐵廠、非鐵產品制造、石油精煉過程、煤炭氣化、電力生產、碳黑生產、氨生產、甲醇生產和焦炭制造。在這些實施方案中，可在含C0氣體被排放到大氣中之前，使用任何方便的方法從所述工業過程中將其捕獲。C0可以是合成氣（包含一氧化碳和氫的氣體）的組分。由工業過程產生的C0通常被燃燒掉以產生co2，因此本發明可特別用于減少co2溫室氣體排放并產生用作生物燃料的丁醇。取決于含C0的氣態底物的組成，可能還需要在將其引入發酵之前對其進行處理，以去除任何不需要的雜質例如塵粒。例如，可使用已知方法對氣態底物進行過濾或洗漆。
[0163] 在本發明的特定實施方案中，由微生物發酵的氣態底物是包含0)2和112的氣態底物。所述含co2/H2底物可以是作為工業過程的副產物而獲得的廢氣。在某些實施方案中，所述工業過程選自氫生產。在某些實施方案中，所述包含(30 2和H2的氣態底物可以是混合氣流，其中將源自一種或多種工業過程的氣流的至少一部分與至少一部分〇) 2或112混合，以優化所述氣態底物的co2:H2比例。這對于富含〇)2或112的工業氣流而言可以是特別有益的。產生可以用作〇) 2和h2底物或〇)2和112混合底物的來源的副產物氣流的工業過程的實例包括焦炭制造、精煉過程、氨生產過程、甲醇生產過程、乙酸生產、天然氣精煉廠和發電廠。
[0164] 應當理解，為了發生細菌生長以及氣體至包含3-HP的產物的轉化，需要將合適的液體營養培養基與含C0和/或〇)2的底物氣體進料給生物反應器。所述底物和培養基可以連續、分批或分批補料的形式進料給生物反應器。營養培養基含有足以允許使所用的微生物生長的維生素和礦物質。適合于使用C0和/或co2發酵以產生一種或多種產物的厭氧培養基是本領域中已知的。例如，合適的培養基記載于Biebel(2001)中。在本發明的一個實施方案中，所述培養基是如下文實施例部分中所述。
[0165] 需要在發生支持所述氣體至包含3-HP的產物的轉化的發酵的適當條件下進行發酵。應考慮的反應條件包括壓力、溫度、氣體流速、液體流速、培養基pH、培養基氧化還原電位、攪拌速度（如果使用連續攪拌釜式反應器）、接種物水平、確保液相中的C0和/或C02 不變成限制性的最大氣體底物濃度以及避免產物抑制的最大產物濃度。
[0166] 此外，通常需要增加底物流的C0和/或C02濃度（或氣態底物中的C0和/或C02 分壓），并且因此增加其中C0和/或co2是底物的發酵反應的效率。在增加的壓力下的操作允許C0和/或C02從氣相轉移至液相的速率得到顯著提高，其中C0和/或C0 2可被微生物作為碳源攝取，以生產包含3-HP的產物。這又意味著當將生物反應器保持在高壓而不是大氣壓力下時，可減少保留時間（被定義為生物反應器中的液體體積除以輸入氣體流速）。最佳反應條件將部分取決于所用的本發明的具體微生物。然而，一般而言，優選在高于大氣壓的壓力下進行發酵。同樣，因為給定的C0和/或C02到至少3-HP的轉化率在某種程度上是底物保留時間的函數，而且實現所需的保留時間又決定了所需的生物反應器體積，所以加壓系統的使用可極大地減少所需的生物反應器體積，從而減少發酵設備的資金成本。根據美國專利第5, 593, 886號中給出的實施例，反應器體積可與反應器操作壓力的增加成線性比例地減小，即在10個大氣壓下操作的生物反應器只需為在1個大氣壓下操作的生物反應器體積的十分之一。
[0167] 例如，在高壓下進行氣體至乙醇發酵的益處已有記載。例如，W002/08438描述了在30psig和75psig的壓力下進行的氣體至乙醇的發酵，分別提供150g/l/天和369g/l/ 天的乙醇生產率。然而，發現在大氣壓下使用類似的培養基和輸入氣體組合物進行的示例發酵每天每升產生1/10至1/20的乙醇。
[0168] 還期望含C0和/或C02氣態底物的引入速率能夠確保液相中的C0和/或C0 2濃度不變成限制性的。這是因為C0和/或〇)2受限的條件的后果可能是一種或多種產物被培養物消耗。
[0169] 用于進料給發酵反應的氣流的組成可對該反應的效率和/或成本具有顯著影響。例如，〇 2可降低厭氧發酵過程的效率。在發酵前或發酵后的發酵過程各階段中處理不需要或不必要的氣體可增加對此類階段的負擔（對于包含其中氣流在進入生物反應器前被壓縮的產物，不必要的能量被用于壓縮在發酵中不需要的氣體）。因此，可能需要處理底物流，特別是源自工業源的底物流，以去除不需要的組分并增加所需組分的濃度。
[0170] 在某些實施方案中，將本發明的細菌培養物維持在水性培養基中。優選地，水性培養基是最低厭氧微生物生長培養基。合適的培養基是本領域已知的，并且例如在美國專利第5, 173, 429號和第5, 593, 886號以及W0 02/08438中有描述，以及如本文下文實施例部分中所述。
[0171] 3-HP，或含有3-HP和/或一種或多種其他產物的混合流，可通過本領域中已知的方法從發酵液中回收，所述方法例如分餾或蒸發、滲透蒸發、汽提和萃取發酵，包括例如液液萃取。
[0172] 在本發明的某些優選實施方案中，3-HP和一種或多種產物通過下述方法從發酵液中回收：從生物反應器中連續移出發酵液的一部分，從發酵液中分離微生物細胞（方便地通過過濾），并且從發酵液中回收一種或多種產物。醇類可方便地例如通過蒸餾進行回收。丙酮可例如通過蒸餾進行回收。所產生的任何酸類均可例如通過吸附在活性炭上進行回收。優選地將分離的微生物細胞送回至發酵生物反應器。還優選地將已移出任何醇和酸后剩余的無細胞滲透物送回至發酵生物反應器。可向無細胞滲透物中添加另外的營養素（例如B族維生素），以在將營養培養基送回至生物反應器之前補充所述營養培養基。
[0173] 此外，如果如上所述調整發酵液的pH以增強乙酸至活性炭的吸附，則在將所述發酵液送回生物反應器前，應將pH重新調整至與發酵生物反應器中的發酵液相似的pH。
[0174] 可使用任何適當的方法包括但不限于滲透蒸發、反滲透和液液萃取技術，在發酵后回收3-HP。
[0175]實施例
[0176] 現在將參考下述非限制性實施例更詳細地描述本發明。
[0177] 實施例1
[0178] 組合兩種(1)2固定途徑，產乙酸菌的線性Wood-Ljungdahl途徑以及在綠色非硫細菌和古細菌中發現的3-HP循環（Thauer，2007,Science, 318:1732-33)，以獲得朝向平臺化學品3-羥基丙酸鹽（3-HP)的可持續途徑。該途徑允許將3個C0或0)2分子固定到一個 3-HP分子內。選擇一氧化碳營養產乙酸生物自產乙醇梭菌，并且用來自非硫光合作用菌橙色綠屈撓菌的執行起始〇) 2固定步驟的基因進行代謝改造（圖1)。
[0179] -氧化碳營養產乙酸菌例如自產乙醇梭菌或揚氏梭菌能夠通過固定兩個C0或C02 分子并且使它們融合以形成乙酰輔酶A來自養生長。非硫光合作用細菌例如橙色綠屈撓菌能夠在循環過程中固定C02。它們使用乙酰輔酶A作為起點，并將其融合到通過乙酰輔酶A 羧化酶(EC. 6. 4. 1. 2)催化的ATP依賴性步驟中以形成丙二酰輔酶A，所述丙二酰輔酶A隨后可通過丙二酰輔酶A還原酶（EC1. 2. 1. 75)的作用被還原為3-HP，即該循環的中心中間產物（Huegleretal，2002，J.Bacteriol.l84:2404-10)。將丙二酰輔酶A還原酶基因，酶 (GI: 163848165,Caur_2614 ;YP_001636209. 1)引入一氧化碳營養生物內，以形成將三個C0 或C02分子固定到3-HP內的新代謝途徑。經鑒定，乙酰輔酶A羧化酶已作為脂肪酸生物合成的一部分存在于宿主生物內（自產乙醇梭菌：SEQIDN0:18-21 ;揚氏梭菌：CLJU_c42100-4 0,GI: 9447826-31，NC_014328. 1-33. 1)，但除必需的丙二酰輔酶A還原酶之外，還可引入橙色綠屈撓菌乙酰輔酶A羧化酶（GI: 163847210-11，Caur_1647-48，YP_001635254. 1-55. 1 ; GI:163849262,Caur_3739,YP_001637306. 1 ；GI:163848951,Caur_3421,YP_001636995. 1 ；GI: 163846951,Caur_1378,YP_001634995. 1) 〇
[0180]材料與方法
[0181] 微牛物和牛長備件
[0182] 自產乙醇梭菌DSM23693是源自DSMZ(德國微生物和細胞培養物保藏中心（The GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures),Inhoffenstra旦e7 B, 38124Braunschweig，德國）的自產乙醇梭菌DSM10061的衍生物。
[0183]大腸桿菌XLl-BlueMRF'Kan購自Stratagene(SantaClara，CA95051_7201，USA)。
[0184] 將大腸桿菌在好氧條件下培養，而所有其他菌株均在血清瓶中的50ml液體培養基中以果糖（異養生長）或在頂空中以30psi含C0鋼鐵廠氣體（收集自Glenbrook，NZ的 NewZealandSteel場所；組成：44%C0、32%N2、22%C02、2%H2)(自養生長）嚴格厭氧地生長。
[0185] 根據表1-3中給出的配方，使用標準厭氧技術（HungateRE:Arolltubemethod forcultivationofstrictanaerobes,inNorrisJRandRibbonsDff(eds. ),Methods inMicrobiology,vol. 3B.AcademicPress,NewYork, 1969:117-132；ffolfeRS:Microbial formationofmethane.AdvMicrobPhysiol1971,6:107-146)制備培養基。對于固體培養基，加入 1. 2%Bacto瓊脂（BD,FranktonLakes,NJ07417,USA)。
[0186] 除非另有說明，所有菌株均在37°C下生長。
[0187] 表1 :PETC_MES培養基（自產乙醇梭菌pH5. 6)

【權利要求】
1. 一種用于將CO和/或CO 2轉化成3-羥基丙酸鹽（3-HP)的方法，所述方法包括：將含C0和/或含C02的氣態底物傳送至含有在培養基中的一氧化碳營養產乙酸細菌的培養物的生物反應器，使得所述細菌將C0和/或C02轉化為3-HP，和從所述生物反應器中回收3-HP，其中所述一氧化碳營養產乙酸細菌被遺傳改造為表達丙二酰輔酶A還原酶。
2. 經分離的、遺傳改造的一氧化碳營養產乙酸細菌，其包含編碼丙二酰輔酶A還原酶的核酸，由此所述細菌表達丙二酰輔酶A還原酶，并且所述細菌能夠將三個C0或0)2分子固定到一個3-羥基丙酸鹽（3-HP)分子內。
3. 根據權利要求2所述的經分離的、遺傳改造的一氧化碳營養產乙酸細菌，其還包含編碼來自非硫、光合作用細菌的乙酰輔酶A羧化酶的核酸，其中所述核酸與啟動子可操作地連接。
4. 根據權利要求2所述的經分離的、遺傳改造的一氧化碳營養產乙酸細菌，其選自自產乙酉享梭菌（Clostridium autoethanogenum)、揚氏梭菌（Clostridium 1 jungdahlii)、拉氏梭菌（Clostridium ragsdalei)、食撰基化物梭菌（Clostridium carboxidivorans)、德氏梭菌（Clostridium drakei)、奠味梭菌（Clostridium scatologenes)、乙酸梭菌(Clostridium aceticum)、蟲義酸乙酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、大梭菌（Clostridium magnum)、食甲基丁酸桿菌(Butyribacterium methylotrophicum) > 伍氏乙酸桿菌（Acetobacterium woodii)、巴氏嗜喊菌（Alkalibaculum bacchii)、 Blautia producta、游泥真桿菌（Eubacterium limosum)、熱乙酸穆爾氏菌（Moorella thermoacetica)、熱自養穆爾氏菌（Moorella thermautotrophica)、卵形鼠抱菌 (Sporomusa ovata)、Sporomusa silvacetica、球形鼠抱菌（Sporomusa sphaeroides)、普氏產醋桿菌（Oxobacter pfennigii)和凱伍熱厭氧菌（Thermoanaerobacter kiuvi)。
5. 根據權利要求4所述的經分離的、遺傳改造的一氧化碳營養產乙酸細菌，其為選自揚氏梭菌和自產乙醇梭菌的梭菌屬種。
6. 根據權利要求3所述的經分離的、遺傳改造的一氧化碳營養產乙酸細菌，其中所述非硫、光合作用細菌選自揚氏梭菌、生金球形菌屬（Metallosphaera)和硫化葉菌屬 (Sulfolobus)種。
7. 根據權利要求3所述的經分離的、遺傳改造的一氧化碳營養產乙酸細菌，其中所述非硫、光合作用細菌是橙色綠屈撓菌（Chloroflexus auranticus)。
8. 根據權利要求2所述的經分離的、遺傳改造的一氧化碳營養產乙酸細菌，其中所述編碼丙二酰輔酶A還原酶的核酸已進行了密碼子優化。
9. 一種培養根據權利要求2所述的經分離的、遺傳改造的一氧化碳營養產乙酸細菌的方法，其包括使所述細菌在包含氣態碳源的培養基中生長，其中所述碳源包含C0和/或 C02。
10. -種培養根據權利要求2所述的經分離的、遺傳改造的一氧化碳營養產乙酸細菌的方法，其包括使所述細菌在包含能源的培養基中生長，其中所述能源包含C0和/或C02。
11. 根據權利要求9或10所述的方法，其中所述培養是嚴格厭氧的。
12. 根據權利要求9或10所述的方法，其中所述碳源包含工業廢棄產物或廢氣。
13. 根據權利要求9或10所述的方法，其中所述細菌還包含編碼來自非硫、光合作用細菌的乙酰輔酶A羧化酶的外源核酸，其中所述核酸與啟動子可操作地連接。
14. 根據權利要求1所述的方法，其中所述丙二酰輔酶A還原酶來自非硫、光合作用細菌。
15. 根據權利要求14所述的方法，其中所述丙二酰輔酶A還原酶來自橙色綠屈撓菌。
16. 根據權利要求2所述的經分離的、遺傳改造的一氧化碳營養產乙酸細菌，其中所述丙二酰輔酶A還原酶與由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列編碼的氨基酸序列至少85%相同。
【文檔編號】C12N15/53GK104508136SQ201380040793
【公開日】2015年4月8日申請日期:2013年5月30日優先權日:2012年5月30日
【發明者】陳銥婷, M·科普克申請人:新西蘭郎澤科技公司

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