重組微生物及其用途
【專利摘要】本發明提出了重組微生物及其用途，重組微生物包含異源核酸分子，異源核酸分子編碼具有醛還原酶活性的蛋白質。利用該重組微生物可以有效地用于以脂肪醛為原料制備脂肪醇。
【專利說明】重組微生物及其用途

【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】。具體而言，本發明涉及重組微生物及其用途。

【背景技術】
[0002]脂肪醇(fatty alcohols)是洗漆劑用表面活性劑的原料之一,在洗漆劑、護膚品、化妝品、藥品中有大量運用。脂肪醇最早是由鯨蠟制取的，所得的混合脂肪醇經磺化中和后成為硫酸鹽，是最早的一種陰離子洗滌劑。其后開發利用來源比較豐富的椰子油、棕櫚油和牛油為原料，水解所得脂肪酸再還原為醇，統稱為天然脂肪醇。石油化學工業發展后，以石油產品為原料，生產的脂肪醇稱為合成脂肪醇。近年來由于石油原料價格持續高漲，且依靠石油產品為原料的脂肪醇也大量消耗石油的儲備量，在資源日益稀缺的今天，這種發展方式將會逐漸淘汰，因此，需要一種更環保、可再生的生產方式。
[0003]目前工業上已經有許多利用微生物生產發酵獲得產品的成功實例，這種生產方式能不受環境、地理因素等條件的限制，適于工廠化生產、易于普及等特點。因此對生物能的開發正成為能源研究的熱點領域，競爭日趨激烈。
[0004]然而，目前對于微生物發酵生產脂肪醇的研究仍有待深入。


【發明內容】

[0005]本發明旨在至少在一定程度上解決上述技術問題之一。
[0006]本發明是基于發明人的下列發現而完成的:發明人首次發現醛還原酶能夠對碳原子數為至少8的脂肪醛進行還原處理，并生成脂肪醇。
[0007]由此，在本發明的一個方面，本發明提出了一種重組微生物，所述微生物包含異源核酸分子，所述異源核酸分子編碼具有醛還原酶活性的蛋白質。由此利用該重組微生物體內的異源核酸分子編碼的蛋白質可以將脂肪醛還原成脂肪醇。進而可以實現利用微生物發酵生產脂肪醇。
[0008]另外，根據本發明上述實施例的重組微生物還可以具有下列附加技術特征:
[0009]根據本發明的一個實施例，所述異源核酸編碼下列基因至少一種的表達產物:Escherichia coli adhP、Escherichia coli adhE、Escherichia coli yqhD、Escherichiacoli yjgB、Escherichia coli yiaY、Escherichia coli eutG、Escherichia coli fucO、Escherichia coli yd1、 Saccharomyces cerevisiae ADHK Saccharomyces cerevisiaeADH2λSaccharomyces cerevisiae ADH3、Saccharomyces cerevisiae ADH4ΛSaccharomycescerevisiae ADH5、 Saccharomyces cerevisiae ADH6、 Saccharomyces cerevisiae ADH7、Saccharomyces kluyveri ADHl、以及 Saccharomyces kluyveri ADH2。由此可以在相應基因表達產物的作用下，將脂肪醛還原成脂肪醇。
[0010]根據本發明的一個實施例，所述具有醛還原酶活性的蛋白質具有如SEQ ID No:2、
4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32 或 34 所示的氨基酸序列。由此可以進一步提高異源核酸分子編碼表達產物的效率，從而進一步提高利用該微生物制備脂肪醇的效率。
[0011]根據本發明的一個實施例，所述異源核酸分子具有SEQ ID No:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33所示的核苷酸序列。由此，可以進一步提高重組微生物包含的異源核酸分子編碼的蛋白質的酶活性，從而進一步提高利用該微生物制備脂肪醇的效率。
[0012]根據本發明的一個實施例，所述微生物為選自真核微生物和原核微生物的至少一種，任選地，所述微生物為選自細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母的至少一種，任選地，所述微生物為酵母或大腸桿菌，任選地，所述微生物為畢赤酵母或釀酒酵母。由此可以進一步提高利用該微生物制備脂肪醇的效率，以便降低生產成本。
[0013]在本發明的第二方面，本發明提出了一種用于重組微生物的系統，包括:適于轉化微生物的載體，所述載體上攜帶有異源核酸分子，所述異源核酸分子編碼具有醛還原酶活性的蛋白質。由此，利用該系統可以有效地將異源核酸分子引入微生物細胞中，從而獲得前面所述的重組微生物，進而可以利用該系統獲得的重組微生物，還原脂肪醛合成脂肪醇。
[0014]在本發明的第三方面，本發明提出了一種制備重組微生物的方法，該方法主要包括利用上述用于重組微生物的系統轉化微生物，以便獲得所述重組微生物。由此，通過該方法能夠有效獲得重組微生物，進而可以利用該方法獲得的重組微生物，通過重組微生物中包含的異源核酸分子編碼表達具有醛還原酶活性的蛋白，從而可以利用該蛋白還原脂肪醛合成脂肪醇。
[0015]在本發明的第四方面，本發明提出了一種生產脂肪醇的方法，該方法包括下列步驟:培養前面所述的重組微生物，以便利用所述重組微生物將脂肪醛還原成脂肪醇；以及分離所述脂肪醇。由此，可以利用該方法借助本發明實施例的重組微生物合成脂肪醇。
[0016]根據本發明的實施例，利用包含脂肪醛的培養基培養所述重組微生物。由此可以擴大原料脂肪醛的含量，以便進一步提高生產脂肪醇的效率。
[0017]在本發明的第五方面，本發明提出了一種用于生產脂肪醇的系統，其特征在于，包括:生物反應器，所述生物反應器中設置有前面所述的重組微生物和適于所述微生物生長的培養基，以便使所述微生物利用脂肪醛合成脂肪醇；以及分離裝置，所述分離裝置與所述生物反應器相連，用于分離所述脂肪醇。由此，利用本發明的實施例的生產脂肪醇的系統，可以有效地實施前面所述的生產脂肪醇的方法，從而可以有效地用于制備脂肪醇。根據本發明的實施例，所述培養基中包含脂肪醛。由此使得該微生物可以利用培養基中含有的脂肪醛生產脂肪醇，由此可以擴大原料脂肪醛的含量，以便進一步提高生產脂肪醇的效率。
[0018]在本發明的第六方面，本發明提出了一種生產脂肪醇的方法。根據本發明的實施例，該方法包括利用醛還原酶對脂肪醛進行還原處理，以便得到脂肪醇，其中，所述脂肪醛的碳原子數為至少8。由此，可以有效地通過利用碳原子數為至少8，例如至少20個碳原子的脂肪醛作為底物來獲得脂肪醇。根據本發明的實施例，該醛還原酶的形式并不受特別限制，既可以在細胞外作用，也可以在細胞內表達而發揮作用，還可以以固定化酶的形式發揮作用。
[0019]本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0021]圖1.顯示了根據本發明的一個實施例設計構建的ρΕΧΙΟΟ整合載體，將adhP基因克隆在PET28載體上。
[0022]圖2.顯示了根據本發明的一個實施例設計構建的PEXlOl整合載體示意圖，將adhE基因克隆到pET28載體上。
[0023]圖3.顯示了根據本發明的一個實施例設計構建的PEX102整合載體示意圖，將yqhD基因克隆到pET28載體上。
[0024]圖4.顯示了根據本發明的一個實施例設計構建的PRLllO整合載體示意圖，將Acyl ACP reductase基因克隆到pET28載體上。
[0025]圖5.顯示了根據本發明的一個實施例設計構建的pRLlll整合載體示意圖，將Acyl ACP reductase基因和adhP基因克隆在釀酒酵母雙表達質粒pESC-LEU載體上。
[0026]圖6.顯示了根據本發明的一個實施例設計構建的PRL112整合載體示意圖，將Acyl ACP reductase基因克隆在畢赤酵母表達質粒pA0815載體上。
[0027]圖7.顯示了根據本發明的一個實施例設計構建的PRL113整合載體示意圖，將adhP基因克隆在畢赤酵母表達質粒pA0815載體上。
[0028]圖8.顯示了根據本發明的一個實施例設計構建的PRL114整合載體示意圖，將Acyl ACP reductase基因和adhP基因克隆在畢赤酵母表達質粒pA0815載體上。
[0029]圖9.顯示了根據本發明的一個實施例進行化學合成高純度碳十六醛的GC-MS檢測結果圖。
[0030]圖10.顯示了根據本發明的一個實施例進行化學體外驗證醛合成酶功能的GC-MS檢測圖。對照代表未加任何醛還原酶蛋白的空白對照組，AdhP代表加了 AdhP醛還原酶的實驗組，AdhE代表加了 AdhE醛還原酶的實驗組，YqhD代表加了 YqhD醛還原酶的實驗組。
[0031]圖11.顯示了根據本發明的一個實施例檢測Acyl ACP reductase還原酶產物的同位素標記TLC結果圖。
[0032]圖12.顯示了構建的重組大腸桿菌RLllO進行誘導表達檢測產物的GC-MS結果圖。
[0033]圖13.顯示了構建的重組釀酒酵母RLlll進行誘導表達檢測產物的GC-MS結果圖。
[0034]圖14.顯示了構建的重組畢赤酵母RL112進行誘導表達檢測產物的GC-MS結果圖。

【具體實施方式】
[0035]下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
[0036]在本發明中，除非另有明確的規定和限定，術語“安裝”、“相連”、“連接”、“固定”等術語應做廣義理解，例如，可以是固定連接，也可以是可拆卸連接，或一體地連接；可以是機械連接，也可以是電連接；可以是直接相連，也可以通過中間媒介間接相連，可以是兩個元件內部的連通。對于本領域的普通技術人員而言，可以根據具體情況理解上述術語在本發明中的具體含義。
[0037]縮寫及術語
[0038]提供下列關于術語和方法的解釋以便更好的描述本發明，并指導本領域普通技術人員實施本發明。本文使用的“包括”表示“包含”，單數形式的“一個”，除非上下明確的另外指出。例如，“包括一個細胞”指包含一個或者多個這類細胞，“包括醒還原酶”指包含一種或者多種醛還原酶肽以及本領域普通技術人員已知的其同等物，等等。術語“或者”是指陳述的可選擇要素或者兩個或更多個要素組合中的單個要素，除非上下文明確的另外指出。例如“醛還原酶和含脂肪醛的底物。或者所述的微生物”是指醛還原酶、含脂肪醛的底物、含醛還原酶的微生物和含脂肪醛的微生物之間的任一組合。
[0039]除非另外解釋，所有本文使用的技術和科學術語與本發明所屬領域的普通技術人員通常的理解具有相同的含義。盡管與本文描述的類似或者等同的方法和材料可用于本發明的實施或者實驗，但下文描述了適合的方法和材料。所述材料、方法和實施例子只是說明性的，而不是用于限制。根據下面的詳細說明和權利要求，本發明的其他特征將是明顯。
[0040]登錄號:貫穿本說明書的登錄號來源于美國國立衛生研究院維護的NCBI數據庫(國立生物技術信息中心)。所述登錄號是2011年3月I日由該數據庫提供的。
[0041]酶分類號(EC):貫穿本說明書提供的EC編號來自京都基因與基因百科全書(Kyoto Encyclopedia o f Genes and Genomics)維護的 KEGG Ligand 數據庫，這由東京大學部分資助。所述EC編號是2011年3月I日由該數據庫提供的。
[0042]碳源:通常指適合作為原核生物或者簡單真核生物細胞生長的碳源的底物或者化合物。碳源可以是各種形式，包括但不限于聚合物，糖、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽，等等。這些包括，例如，各種單糖諸如葡萄糖、低聚糖、多糖、纖維素質、木糖和阿拉伯糖，二糖，諸如蔗糖、飽和或者不飽和的脂肪酸、琥珀酸鹽、乳酸鹽、乙酸鹽、乙醇，等等，或者其混合物。此外，碳源還可以是光合作用產物，包括但不限于葡萄糖。
[0043]可檢測的:能夠確定出現或者存在。例如，使用下面實施例子提供的方法，從發酵液中產物是可檢測的。
[0044]DNA:脫氧核糖核酸。DNA是長鏈聚合物，其包括大部分的有機體(一些病毒具有包括核糖核酸RNA的基因)的遺傳物質。DNA聚合物中的重復單位是4種不同的核苷酸，其包括4種堿基，腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一種，所述堿基上結合有脫氧核糖，而磷酸基與所述脫氧核糖連接。DNA分子中被稱為密碼子的是核苷酸三聯體編碼肽的氨基酸。術語密碼子還指mRNA中3核苷酸的對應(和互補)序列,所述DNA序列被轉錄成所述mRNA。
[0045]內源的:當在本文中對核酸分子和特定的細胞或者微生物使用時，是指位于細胞內的核酸序列或者肽，其不是利用重組工程技術導入細胞的。例如，當細胞最初從自然界分離時，已經存在于所述細胞中的基因。即使調控序列諸如激活轉錄或者翻譯的啟動子或者增強子序列已經通過重組技術被改變，基因仍被認為是內源的。
[0046]異源的:本文中對核酸分子和特定的細胞使用時，是指不是來源于自然界發現的特定細胞的任意核酸分子。因此，一旦非天然存在的核酸分子被引入細胞，則其被認為是異源的。對特定細胞來說，天然存在的核酸分子也可以是異源的。例如，一旦從細胞X分離的完整編碼序列被引入細胞Y，則該編碼序列對細胞Y來說是異源核酸，即使X和Y是相同的細胞類型。
[0047]表達:基因的編碼信息被轉變為細胞的結構與功能諸如蛋白、轉移RNA或者核糖體RNA的過程。表達的基因包括那些被轉錄為mRNA然后被翻譯為蛋白的基因，以及那些被轉錄為RNA但不被翻譯為蛋白的基因(例如，核糖體RNAs)。
[0048]發酵肉湯:包括任意支持微生物生命(即主動代謝碳的微生物)的培養基。發酵培養基通常包含碳源。碳源是可以被微生物用作(利用或者不利用其他的酶)能量的任何物。
[0049]分離的:“分離的”生物學組分(諸如核酸分子、蛋白或者細胞)已經基本上從該組分天然存在的其他生物學組分中分離或者純化，諸如其他染色體的和染色體外的DNA和RNA,以及蛋白。已經被“分離的”核酸分子和蛋白包括通過標準純化方法純化的核酸分子和蛋白。該術語還包括在宿主細胞中利用重組表達制備的核酸分子和蛋白，以及化學合成的核酸分子和蛋白。
[0050]微生物:包括來自古細菌域、真細菌域和真核生物域的原核和真核微生物種，后者包括酵母和絲狀酵母、原生動物、藻類或者更高等的原生生物。術語“微生物細胞”可以與“微生物”互換使用。
[0051]核酸分子:包括RNA和DNA分子，其包括但不限于，cDNA、基因組DNA和mRNA。包括合成的核酸分子，例如那些化學合成或者重組產生的核酸分子。核酸分子可以是雙鏈或者單鏈的。單鏈時，核酸分子可以是正義鏈或者反義鏈。此外，核酸分子可以是環狀或者線性的。
[0052]可操作的連接:當第一核酸序列與第二核酸序列具有功能關系時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作的連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄或者表達，則所述啟動子與所述編碼序列為可操作的連接。通常，可操作連接的DNA序列是連接的，并且必要時在相同閱讀框內連接兩個蛋白編碼區域。作為單個信使RNA串聯轉錄的分離基因的結構被稱為操縱子。因此將基因緊密相鄰置于單個啟動子的轉錄調節下，例如在質粒載體中，則構成合成操縱子。
[0053]ORF (開放閱讀框):不含任何終止密碼子的一系列編碼氨基酸的核苷酸三聯體(密碼子)。這些序列通常可以被翻譯為肽。
[0054]過表達:當基因的轉錄速率與其內源轉錄速率相比提高的時候。在一些實例中，過表達還包括基因的翻譯速率高于該基因的內源翻譯速率。檢測過表達的方法是本領域公知的。例如可以利用RT-PCR評價轉錄的RNA水平，以及利用SDS-PAGE凝膠分析評價蛋白水平。
[0055]純化的:術語“純化的”并不需要絕對的純度；它只是一個相對術語。因此，例如，純化的生物燃料或其中間體是指比位于其細胞環境內的產物濃度更高的產物。
[0056]重組:重組核酸分子或者蛋白，其具有非天然存在的序列，具有由人工組合序列的兩個另外分離的序列片段制備的序列，或者以上兩者。例如可以通過化學合成或者人工操作核酸分子或者蛋白的分離片段，諸如遺傳工程技術，實現這種人工組合。重組還用于描述以下核酸分子，它們已經被人工處理，但包含的調控序列和編碼區與分離所述核酸的生物體中發現的相同。重組細胞或者微生物是包含異源核酸分子諸如重組核酸分子的細胞或者微生物。
[0057]轉化或者重組細胞:例如通過分子生物學技術，已經被引入核酸分子(諸如編碼醛還原酶的核酸分子)的細胞。轉化包括能夠將核酸分子引入這類細胞的所有技術，包括但不限于，利用病毒載體轉染、接合作用、利用質粒載體轉化、通過電穿孔的裸DNA引入、脂質體轉染和顆粒槍加速。
[0058]在允許產物生成的條件下:任何允許微生物產生所需產物(諸如脂肪醇、烷烴、烯烴等)的發酵條件。發酵條件通常包括溫度范圍、通氣水平和培養基選擇，將上述條件組合時允許微生物生長。示例性培養基包括肉湯或者凝膠。通常，培養基包括碳源諸如葡萄糖、果糖、纖維素或者可以被微生物直接代謝的類似物，或者可以在培養基中使用促進代謝碳源的酶。為了確定培養條件是否允許產物生成，將微生物培養8、16或者24小時，收集并分析樣品。例如，可以檢測樣品或者培養基(細胞在其中生長)的細胞中所需產物存在。當分析產物的存在時，可以使用下面實例提供的那些方法。
[0059]載體:作為引入細胞從而產生轉化細胞的核酸分子。載體可以包括允許其在細胞中復制的核酸序列，諸如復制原點。載體還可以包括一種或者多種選擇性標志物基因和本領域已知的其他遺傳成分。
[0060]本發明是基于發明人的下列發現而完成的:發明人首次發現醛還原酶能夠對碳原子數為至少8的脂肪醛進行還原處理，并生成脂肪醇。
[0061]由此，本發明提出了一種生產脂肪醇的方法。根據本發明的實施例，該方法包括利用醛還原酶對脂肪醛進行還原處理，以便得到脂肪醇，其中，所述脂肪醛的碳原子數為至少
8。由此，可以有效地通過利用碳原子數為至少8，例如至少20個碳原子的脂肪醛作為底物來獲得脂肪醇。根據本發明的實施例，該醛還原酶的形式并不受特別限制，既可以在細胞外作用，也可以在細胞內表達而發揮作用，還可以以固定化酶的形式發揮作用。
[0062]根據本發明的實施例，本發明提出了一種重組微生物，該重組微生物包含異源核酸分子，該異源核酸分子編碼具有醛還原酶活性的蛋白質。由于該異源核酸分子編碼的蛋白質具有醛還原酶的活性，因此該蛋白質可以是醛還原酶或者可以具有能夠編碼醛還原酶的功能等同體。因此該重組微生物具有將脂肪醛還原成脂肪酸的作用。
[0063]根據本發明的一個實施例，異源核酸編碼下列基因至少一種的表達產物:Escherichia coli adhP、Escherichia coli adhE、Escherichia coli yqhD、Escherichiacoli yjgB、Escherichia coli yiaY、Escherichia coli eutG、Escherichia coli fucO、Escherichia coli yd1、 Saccharomyces cerevisiae ADHl> Saccharomyces cerevisiaeADH2、Saccharomyces cerevisiae ADH3>Saccharomyces cerevisiae ADH4、Saccharomycescerevisiae ADH5、 Saccharomyces cerevisiae ADH6、 Saccharomyces cerevisiae ADH7、Saccharomyces kluyveri ADHl、以及 Saccharomyces kluyveri ADH2。由此上述基因可以編碼的蛋白質均具有醛還原酶的活性，能夠將脂肪醛還原為脂肪醇。同時上述基因編碼的蛋白質均具有相同的功能，可以稱為功能等同體，本文中所使用的術語“功能等同體”是指這樣的一種基因，例如:其能夠發揮與醛還原酶相同的功能，但在序列上與醛還原酶有所區別的基因，從而利用該功能等同體同樣發揮醛還原酶的功能。因此根據本發明的具體實施例，上述基因的表達產物均具有醛還原酶的活性，因此具有將脂肪醛還原成脂肪醇的功能。
[0064]根據本發明的具體實施例，重組微生物可以利用脂肪醛合成脂肪醇，其中脂肪醛可以是微生物體內合成的脂肪醛，也可是異源添加的脂肪醛。因此，可以將這些脂肪醛用于生產脂肪醇類化合物，以便用于化工原料或者生物燃料。根據本發明的具體實施例，該微生物包括的異源核酸能夠編碼adhP基因或其功能類似物，該酶可以將脂肪醛還原生產脂肪醇。
[0065]根據本發明的一個實施例，重組微生物中包含的異源核酸分子具有下列所示的核苷酸序列，根據本發明的具體實施例，上述異源核酸分子可以為編碼醛還原酶的基因adhp，其核苷酸序列如下:
[0066]atgaaggctgcagttgttacgaaggatcatcatgttgacgttacgtataaaacactgcgctcactgaaacatggcgaagccctgctgaaaatggagtgttgtggtgtatgtcataccgatcttcatgttaagaatggcgattttggtgacaaaaccggcgtaattctgggccatgaaggcatcggtgtggtggcagaagtgggtccaggtgtcacctcattaaaaccaggcgatcgtgccagcgtggcgtggttctacgaaggatgcggtcattgcgaatactgtaacagtggtaacgaaacgctctgccgttcagttaaaaatgccggatacagcgttgatggcgggatggcggaagagtgcatcgtggtcgccgattacgcggtaaaagtgccagatggtctggactcggcggcggccagcagcattacctgtgcgggagtcaccacctacaaagccgttaagctgtcaaaaattcgtccagggcagtggattgctatctacggtcttggcggtctgggtaacctcgccctgcaatacgcgaagaatgtctttaacgccaaagtgatcgccattgatgtcaatgatgagcagttaaaactggcaaccgaaatgggcgcagatttagcgattaactcacacaccgaagacgccgccaaaattgtgcaggagaaaactggtggcgctcacgctgcggtggtaacagcggtagctaaagctgcgtttaactcggcagttgatgctgtccgtgcaggcggtcgtgttgtggctgtcggtctaccgccggagtctatgagcctggatatcccacgtcttgtgctggatggtattgaagtggtcggttcgctggtcggcacgcgccaggatttaactgaagccttccagtttgccgccgaaggtaaagtggtgccgaaagtcgccctgcgtccgttagcggacatcaacaccatctttactgagatggaagaaggcaaaatccgtggccgcatggtgattgatttccgtcactaa (SEQ ID NO:1),
[0067]基因adhp編碼的蛋白具有下列所不的氣基酸序列:
[0068]MKAAVVTKDHHVDVTYKTLRSLKHGEALLKMECCGVCHTDLHVKNGDFGDKTGVILGHEGIGVVAEVGPGVTSLKP⑶RASVAWFYEGCGHCEYCNSGNETLCRSVKNAGYSVDGGMAEECIVVADYAVKVPDGLDSAAASSITCAGVTTYKAVKLSKIRPGQWIAIYGLGGLGNLALQYAKNVFNAKVIAIDVNDEQLKLATEMGADLAINSHTEDAAKIVQEKTGGAHAAVVTAVAKAAFNSAVDAVRAGGRVVAVGLPPESMSLDIPRLVLDGIEVVGSLVGTRQDLTEAFQFAAEGKVVPKVALRPLADINTIFTEMEEGKIRGRMVIDFRH (SEQ ID NO:2)。
[0069]發明人驚奇地發現，當采用上述異源核酸分子時，所編碼的醛還原酶可以將脂肪醛高效地還原為脂肪醇，進而可以進一步提高生產脂肪醇類化合物的效率。
[0070]根據本發明的一個實施例，上述異源核酸還可以編碼下列基因表達的產物，該基因可以為醛還原酶adhE基因，具有如下核苷酸序列:
[0071]atggctgttactaatgtcgctgaacttaacgcactcgtagagcgtgtaaaaaaagcccagcgtgaatatgccagtttcactcaagagcaagtagacaaaatcttccgcgccgccgctctggctgctgcagatgctcgaatcccactcgcgaaaatggccgttgccgaatccggcatgggtatcgtcgaagataaagtgatcaaaaaccactttgcttctgaatatatctacaacgcctataaagatgaaaaaacctgtggtgttctgtctgaagacgacacttttggtaccatcactatcgctgaaccaatcggtattatttgcggtatcgttccgaccactaacccgacttcaactgctatcttcaaatcgctgatcagtctgaagacccgtaacgccattatcttctccccgcacccgcgtgcaaaagatgccaccaacaaagcggctgatatcgttctgcaggctgctatcgctgccggtgctccgaaagatctgatcggctggatcgatcaaccttctgttgaactgtctaacgcactgatgcaccacccagacatcaacctgatcctcgcgactggtggtccgggcatggttaaagccgcatacagctccggtaaaccagctatcggtgtaggcgcgggcaacactccagttgttatcgatgaaactgctgatatcaaacgtgcagttgcatctgtactgatgtccaaaaccttcgacaacggcgtaatctgtgcttctgaacagtctgttgttgttgttgactctgtttatgacgctgtacgtgaacgttttgcaacccacggcggctatctgttgcagggtaaagagctgaaagctgttcaggatgttatcctgaaaaacggtgcgctgaacgcggctatcgttggtcagccagcctataaaattgctgaactggcaggcttctctgtaccagaaaacaccaagattctgatcggtgaagtgaccgttgttgatgaaagcgaaccgttcgcacatgaaaaactgtccccgactctggcaatgtaccgcgctaaagatttcgaagacgcggtagaaaaagcagagaaactggttgctatgggcggtatcggtcatacctcttgcctgtacactgaccaggataaccaaccggctcgcgtttcttacttcggtcagaaaatgaaaacggcgcgtatcctgattaacaccccagcgtctcagggtggtatcggtgacctgtataacttcaaactcgcaccttccctgactctgggttgtggttcttggggtggtaactccatctctgaaaacgttggtccgaaacacctgatcaacaagaaaaccgttgctaagcgagctgaaaacatgttgtggcacaaacttccgaaatctatctacttccgccgtggctccctgccaatcgcgctggatgaagtgattactgatggccacaaacgtgcgcteatcgtgactgaccgcttcctgttcaacaatggttatgctgatcagatcacttccgtactgaaagcagcaggcgttgaaactgaagtcttcttcgaagtagaagcggacccgaccctgagcatcgttcgtaaaggtgcagaactggcaaactccttcaaaccagacgtgattatcgcgctgggtggtggttccccgatggacgccgcgaagatcatgtgggttatgtacgaacatccggaaactcacttcgaagagctggcgctgcgctttatggatatccgtaaacgtatctacaagttcccgaaaatgggcgtgaaagcgaaaatgatcgctgtcaccaccacttctggtacaggttctgaagtcactccgtttgcggttgtaactgacgacgctactggtcagaaatatccgctggcagactatgcgctgactccggatatggcgattgtcgacgccaacctggttatggacatgccgaagtccctgtgtgctttcggtggtctggacgcagtaactcacgccatggaagcttatgtttctgtactggcatctgagttctctgatggtcaggctctgcaggcactgaaactgctgaaagaatatctgccagcgtcctaccacgaagggtctaaaaatccggtagcgcgtgaacgtgttcacagtgcagcgactatcgcgggtatcgcgtttgcgaacgccttcctgggtgtatgtcactcaatggcgcacaaactgggttcccagttccatattccgcacggtctggcaaacgccctgctgatttgtaacgttattcgctacaatgcgaacgacaacccgaccaagcagactgcattcagccagtatgaccgtccgcaggctcgccgtcgttatgctgaaattgccgaccacttgggtctgagcgcaccgggcgaccgtactgetgetaagatcgagaaactgctggcatggctggaaacgctgaaagctgaactgggtattccgaaatctatccgtgaagctggcgttcaggaagcagacttcctggcgaacgtggataaactgtctgaagatgcattcgatgaccagtgcaccggcgctaacccgcgttacccgctgatctccgagctgaaacagatcctgctggatacctactacggtcgtgattatgtagaaggtgaaactgcagcgaaaaaagaa gccgctccggctaaagctgagaaaaaagcgaaaaaatccgcttaa (SEQ ID No:3)，
[0072]上述醛還原酶adhE基因編碼的蛋白具有下列所示的氨基酸序列:
[0073]MAVTNVAELNALVERVKKAQREYASFTQEQVDKIFRAAALAAADARIPLAKMAVAESGMGIVEDKVIKNHFASEYIYNAYKDEKTCGVLSEDDTFGTITIAEPIGIICGIVPTTNPTSTAIFKSLISLKTRNAIIFSPHPRAKDATNKAADIVLQAAIAAGAPKDLIGWIDQPSVELSNALMHHPDINLILATGGPGMVKAAYSSGKPAIGVGAGNTPVVIDETADIKRAVASVLMSKTFDNGVICASEQSVVVVDSVYDAVRERFATHGGYLLQGKELKAVQDVILKNGALNAAIVGQPAYKIAELAGFSVPENTKILIGEVTVVDESEPFAHEKLSPTLAMYRAKDFEDAVEKAEKLVAMGGIGHTSCLYTDQDNQPARVSYFGQKMKTARILINTPASQGGI⑶LYNFKLAPSLTLGCGSWGGNSISENVGPKHLINKKTVAKRAENMLWHKLPKSIYFRRGSLPIALDEVITDGHKRALIVTDRFLFNNGYADQITSVLKAAGVETEVFFEVEADPTLSIVRKGAELANSFKPDVIIALGGGSPMDAAKIMWVMYEHPETHFEELALRFMDIRKRIYKFPKMGVKAKMIAVTTTSGTGSEVTPFAVVTDDATGQKYPLADYALTPDMAIVDANLVMDMPKSLCAFGGLDAVTHAMEAYVSVLASEFSDGQALQALKLLKEYLPASYHEGSKNPVARERVHSAATIAGIAFANAFLGVCHSMAHKLGSQFHIPHGLANALLICNVIRYNANDNPTKQTAFSQYDRPQARRRYAEIADHLGLSAP⑶RTAAKIEKLLAWLETLKAELGIPKSIREAGVQEADFLANVDKLSEDAFDDQCTGANPRYPLISELKQILLDTYYGRDYVEGETAAKKEAAPAKAEKKAKKSA (SEQ ID No:4)0
[0074]根據本發明的一個實施例，上述異源核酸還可以編碼下列基因表達的產物，該基因可以為醛還原酶yqhD基因，具有如下核苷酸序列:
[0075]atgaacaactttaatctgcacaccccaacccgcattctgtttggtaaaggcgcaatcgctggtttacgcgaacaaattcctcacgatgctcgcgtattgattacctacggcggcggcagcgtgaaaaaaaccggcgttctcgatcaagttctggatgccctgaaaggcatggacgtgctggaatttggcggtattgagccaaacccggcttatgaaacgctgatgaacgccgtgaaactggttcgcgaacagaaagtgactttcctgctggcggttggcggcggttctgtactggacggcaccaaatttatcgccgcagcggctaactatccggaaaatatcgatccgtggcacattctgcaaacgggcggtaaagagattaaaagcgccatcccgatgggctgtgtgctgacgctgccagcaaccggttcagaatccaacgcaggcgcggtgatctcccgtaaaaccacaggcgacaagcaggcgttccattctgcccatgttcagccggtatttgccgtgctcgatccggtttatacctacaccctgccgccgcgtcaggtggctaacggcgtagtggacgcctttgtacacaccgtggaacagtatgttaccaaaccggttgatgccaaaattcaggaccgtttcgcagaaggcattttgctgacgctaatcgaagatggtccgaaagccctgaaagagccagaaaactacgatgtgcgcgccaacgtcatgtgggcggcgactcaggcgctgaacggtttgattggcgctggcgtaccgcaggactgggcaacgcatatgctgggccacgaactgactgcgatgcacggtctggatcacgcgcaaacactggctatcgtcctgcctgcactgtggaatgaaaaacgcgataccaagcgcgctaagctgctgcaatatgctgaacgcgtctggaacatcactgaaggttccgatgatgagcgtattgacgccgcgattgccgcaacccgcaatttctttgagcaattaggcgtgccgacccacctctccgactacggtctggacggcagctccatcccggctttgctgaaaaaactggaagagcacggcatgacccaactgggcgaaaatcatgacattacgttggatgtcagccgccgtatatacgaagccgcccgctaa (SEQ ID No:5)，
[0076]上述醛還原酶yqhD基因編碼的蛋白具有下列所示的氨基酸序列:
[0077]MNNFNLHTPTRILFGKGAIAGLREQIPHDARVLITYGGGSVKKTGVLDQVLDALKGMDVLEFGGIEPNPAYETLMNAVKLVREQKVTFLLAV GGGSVLDGTKFIAAAANYPENIDPWHILQTGGKEIKSAIPMGCVLTLPATGSESNAGAVISRKTTCDKQAFHSAHVQPVFAVLDPVYTYTLPPRQVANGVVDAFVHTVEQYVTKPVDAKIQDRFAEGILLTLIEDGPKALKEPENYDVRANVMWAATQALNGLIGAGVPQDWATHMLGHELTAMHGLDHAQTLAIVLPALWNEKRDTKRAKLLQYAERVWNITEGSDDERIDAAIAATRNFFEQLGVPTHLSDYGLDGSSIPALLKKLEEHGMTQLGENHDITLDVSRRIYEAAR (SEQ ID No:6)。
[0078]根據本發明的一個實施例，上述異源核酸還可以編碼下列基因表達的產物，該基因可以為醛還原酶yjgB基因，具有如下核苷酸序列:
[0079]atgtcgatgataaaaagctatgccgcaaaagaagcgggcggagaactggaagtttatgagtacgatcccggtgagctgaggccacaagatgttgaagtgcaggtggattactgcgggatctgccattccgatctgtcgatgatcgataacgaatggggattttcacaatatccgctggttgccgggcatgaggtgattgggcgcgtggtggcactcgggagcgccgcgcaggataaaggtttgcaggtcggtcagcgtgtcgggattggctggacggcgcgtagctgtggtcactgcgacgcctgtattagcggtaatcagatcaactgcgagcaaggtgcggtgccgacgattatgaatcgcggtggctttgccgagaagttgcgtgcggactggcaatgggtgattccactgccagaaaatattgatatcgagtccgccgggccgctgttgtgcggcggtatcacggtctttaaaccactgttgatgcaccatatcactgctaccagccgcgttggggtaattggtattggcgggctggggcatatcgctataaaacttctgcacgcaatgggatgcgaggtgacagcctttagttctaatccggcgaaagagcaggaagtgctggcgatgggtgccgataaagtggtgaatagccgcgatccgcaggcactgaaagcactggcggggcagtttgatctcattatcaacaccgtcaacgtcagcctcgactggcagccctattttgaggcgctgacctatggcggtaatttccatacggtcggtgcggttctcacgccgctgtctgttccggcctttacgttaattgcgggcgatcgcagcgtctctggttctgctaccggcacgccttatgagctgcgtaagctgatgcgttttgccgcccgcagcaaggttgcgccgaccaccgaactgttcccgatgtcgaaaattaacgacgccatccagcatgtgcgcgacggtaaggcgcgttaccgcgtggtgttgaaagccgattattga (SEQ ID No -J),
[0080]上述醒還原酶yjgB基因編碼的蛋白具有下列所不的氣基酸序列:
[0081]MSMIKSYAAKEAGGELEVYEYDPGELRPQDVEVQVDYCGICHSDLSMIDNEWGFSQYPLVAGHEVIGRVVALGSAAQDKGLQVGQRVGIGWTARSCGHCDACISGNQINCEQGAVPTIMNRGGFAEKLRADWQWVIPLPENIDIESAGPLLCGGITVFKPLLMHHITATSRVGVIGIGGLGHIAIKLLHAMGCEVTAFSSNPAKEQEVLAMGADKVVNSRDPQALKALAGQFDLIINTVNVSLDWQPYFEALTYGGNFHTVGAVLTPLSVPAFTLIAGDRSVSGSATGTPYELRKLMRFAARSKVAPTTELFPMSKINDAIQHVRDGKARYRVVLKADY (SEQ ID No:8)。
[0082]根據本發明的一個實施例，上述異源核酸還可以編碼下列基因表達的產物，該基因可以為醛還原酶yiaY基因，具有如下核苷酸序列:
[0083]atggcatcttcaactttctttattccttctgtgaatgtcatcggcgctgattcattgactgatgcaatgaatatgatggcagattatggatttacccgtaccttaattgtcactgacaatatgttaacgaaattaggtatggcgggtgatgtgcaaaaagcactggaagaacgcaatatttttagcgttatttatgatggcacccaacctaacccaaccacggaaaacgtcgccgcaggtttgaaattacttaaagaaaataattgcgatagcgtgatttccttaggcggtggttctccgcatgactgtgcaaaaggtattgcgctggtggcagccaatggtggtgatatccgtgattatgaaggcgttgaccgctctgcaaaaccgcagctgccgatgatcgccatcaataccactgcgggtacagcatcagaaatgactcgtttctgcatcatcaccgacgaagcgcgtcacatcaaaatggcgattgttgataagcacgtgactccgctgctttctgtcaatgactcctcgctgatgatcggtatgccgaagtcactgaccgccgccactggtatggacgccttaacgcacgctatcgaagcgtatgtttctattgccgccacgccgatcactgacgcttgtgcactgaaagccgtgaccatgattgccgaaaacctgccgttagccgttgaagatggcagtaatgcgaaagcgcgtgaagcaatggcttatgcccagttcctcgccggtatggcgttcaataatgcttctctgggttatgttcatgcgatggcgcaccagctgggcggtttctacaacctgccacacggtgtatgtaacgccgttttgctgccgcatgttcaggtattcaacagcaaagtcgccgccgcacgtctgcgtgactgtgccgctgcaatgggcgtgaacgtgacaggtaaaaacgatgcggaaggtgctgaagcctgcattaacgccatccgtgaactggcgaagaaagtggatatcccggcaggcctacgcgacctgaacgtgaaagaagaagatttcgcggttctggcgactaatgccctgaaagatgcctgtggttttactaacccgatccaggcaactcacgaagaaattgtggcgatttatcgcgcagcgatgta (SEQ ID No:9)，
[0084]上述醛還原酶yiaY基因編碼的蛋白具有下列所示的氨基酸序列:
[0085]MASSTFFIPSVNVIGADSLTDAMNMMADYGFTRTLIVTDNMLTKLGMAGDVQKALEERNIFSVIYDGTQPNPTTENVAAGLKLLKENNCDSVISLGGGSPHDCAKGIALVAANGGDIRDYEGVDRSAKPQLPMIAINTTAGTASEMTRFCIITDEARHIKMAIVDKHVTPLLSVNDSSLMIGMPKSLTAATGMDALTHAIEAYVSIAATPITDACALKAVTMIAENLPLAVEDGSNAKAREAMAYAQFLAGMAFNNASLGYVHAMAHQLGGFYNLPHGVCNAVLLPHVQVFNSKVAAARLRDCAAAMGVNVTGKNDAEGAEACINAIRELAKKVDIPAGLRDLNVKEEDFAVLATNALKDACGFTNPIQATHEEIVAIYRAAM (SEQ ID No:10)。
[0086]根據本發明的一個實施例，上述異源核酸還可以編碼下列基因表達的產物，該基因可以為醛還原酶eutG基因，具有如下核苷酸序列:
[0087]atgcaaaatgaattgcagaccgcgctctttcaggcgttcgataccctgaatctgcaacgggtaaaaacatttagcgttccaccggtgacgctttgcggtccgggcgcggtgagcagttgcgggcagcaagcgcaaacgcgtgggctgaaacatctgttcgtgatggcagacagctttttgcatcaggcggggatgaccgccgggctgacgcgcagcctggctgttaaaggcatcgccatgacgctctggccatgtccggtgggcgaaccgtgcattaccgacgtgtgtgcagccgtggcgcagttgcgtgagtcaggctgtgatggggtgatcgcatttggcggcggctcggtgctggatgcggcgaaagccgtggcgttgctggtgacgaaccccgatagcacgctggcagagatgtcagaaaccagcgttctgcaaccgcgcttgccgctgattgccattccaacgaccgccggaaccggctctgaaaccaccaatgtaacggtgattatcgacgcggtgagcgggcgcaagcaggtgttagcccatgcctcgctgatgccggatgtggcgatcctcgacgccgcattgaccgaaggtgtgccgtcgcatgtcacggcgatgaccggcattgatgcgttaacccatgccattgaagcatacagcgccctgaacgctacaccgtttaccgacagcctggcgattggtgccattgcgatgattggcaaatcgctgccgaaagcggtgggctacggtcacgaccttgccgcgcgcgagagcatgttactggcttcatgtatggcgggaatggcgttttccagtgcgggtcttgggttgtgccacgcgatggcgcatcagccgggcgcggcgctgcatattccgcacggtctcgcgaacgccatgttgctgccaacggtgatggaatttaaccggatggtttgtcgtgaacgctttagtcagattggtcgggcactgcgaactaaaaaatccgacgatcgtgacgctattaacgcggtaagtgagetgattgcggaagttgggattggtaaacgactgggcgatgttggtgcgacatctgcgcattacggcgcatgggcgcaggccgcgctggaagatatttgtctgcgcagtaacccgcgtaccgccagcctggagcagattgtcggcctgtacgcagcggcgcaataa (SEQ ID No:11)，
[0088]上述醒還原酶eutG基因編碼的蛋白具有下列所不的氣基酸序列:
[0089]MQNELQTALFQAFDTLNLQRVKTFSVPPVTLCGPGAVSSCGQQAQTRGLKHLFVMADSFLHQAGMTAGLTRSLAVKGIAMTLWPCPVGEPCITDVCAAVAQLRESGCDGVIAFGGGSVLDAAKAVALLVTNPDSTLAEMSETSVLQPRLPLIAIPTTAGTGSETTNVTVIIDAVSGRKQVLAHASLMPDVAILDAALTEGVPSHVTAMTGIDALTHAIEAYSALNATPFTDSLAIGAIAMIGKSLPKAVGYGHDLAARESMLLASCMAGMAFSSAGLGLCHAMAHQPGAALHIPHGLANAMLLPTVMEFNRMVCRERFSQIGRALRTKKSDDRDAINAVSELIAEVGIGKRLGDVGATSAHYGAWAQAALEDICLRSNPRTASLEQIVGLYAAAQ (SEQ ID No:12)。
[0090]根據本發明的一個實施例，上述異源核酸還可以編碼下列基因表達的產物，該基因可以為醛還原酶fucO基因，具有如下核苷酸序列:
[0091]atgatggctaacagaatgattctgaacgaaacggcatggtttggtcggggtgctgttggggctttaaccgatgaggtgaaacgccgtggttatcagaaggcgctgatcgtcaccgataaaacgctggtgcaatgcggcgtggtggcgaaagtgaccgataagatggatgctgcagggctggcatgggcgatttacgacggcgtagtgcccaacccaacaattactgtcgtcaaagaagggctcggtgtattccagaatagcggcgcggattacctgatcgctattggtggtggttctccacaggatacttgtaaagcgattggcattatcagcaacaacccggagtttgccgatgtgcgtagcctggaagggctttccccgaccaataaacccagtgtaccgattctggcaatccccaccacagcaggcactgcggcagaagtgaccattaactacgtgatcactgacgaagaaaaacggcgcaagtttgtttgcgttgatccgcatgatatcccgcaggtggcgtttattgacgctgacatgatggatggtatgcctccagcgctgaaagctgcgacgggtgtcgatgcgctcactcatgctattgaggggtatattacccgtggcgcgtgggcgctaaccgatgcactgcacattaaagcgattgaaatcattgctggggcgctgcgaggatcggttgctggtgataaggatgccggagaagaaatagcgctcgggcagtatgttgcgggtatgggcttctcgaatgttgggttagggttggtgcatggtatggcgcatccactgggcgcgttttataacactccacacggtgttgcaaacgccatcctgctaccgcatgtcatgcgctataacgctgactttaccggtgagaagtaccgcgatatcgcgcgcgttatgggcgtgaaagtggaaggtatgagcctggaagaggcgcgtaatgccgctgttgaagcggtgtttgctctcaaccgtgatgtcggtattccgccacatttgcgtgatgttggggtacgcaaggaagacattccggcactggcgcaggcggcactgaatgatgtttgtaccggtggcaacccgcgtgaagcaacgcttgaggatattgtagagctttaccataccgcctggtaa (SEQ ID No: 13),
[0092]上述醛還原酶fucO基因編碼的蛋白具有下列所示的氨基酸序列:
[0093]MMANRMILNETAWFGRGAVGALTDEVKRRGYQKALIVTDKTLVQCGVVAKVTDKMDAAGLAWAIYDGVVPNPTITVVKEGLGVFQNSGADYLIAIGGGSPQDTCKAIGIISNNPEFADVRSLEGLSPTNKPSVPILAIPTTAGTAAEVTINYVITDEEKRRKFVCVDPHDIPQVAFIDADMMDGMPPALKAATGVDALTHAIEGYITRGAWALTDALHIKAIEIIAGALRGSVAGDKDAGEEIALGQYVAGMGFSNVGLGLVHGMAHPLGAFYNTPHGVANAILLPHVMRYNADFTGEKYRDIARVMGVKVEGMSLEEARNAAVEAVFALNRDVGIPPHLRDVGVRKEDIPALAQAALNDVCTGGNPREATLEDIVELYHTAW (SEQ ID No:14)。
[0094]根據本發明的一個實施例，上述異源核酸還可以編碼下列基因表達的產物，該基因可以為醛還原酶yd1基因，具有如下核苷酸序列:
[0095]atggatttttctttaactgaagaacaagaactgctgctggccagtattcgcgaactgattacgactaactttccggaagagtatttccgcacctgcgatcaaaacgggacatatccgcgtgagtttatgcgggcgctggcggataacggtatttccatgcttggcgtgccggaagaatttggtggtatccctgcggattacgtcacccaaatgctggcgcagatggaagtgtcaaaatgcggtgctccggcatttttaattaccaacggtcaatgtattcacagtatgcgccgtttcggttctgcagagcagctacgtaaaacggcagaaagcaccctggaaaccggcgaccccgcctatgccctggcgttgacggaaccaggtgctggctcagataacaacagtgccaccaccacttacacgcgtaaaaacggcaaggtttacatcaacggacagaaaacctttattaccggtgcgaaagagtacccgtatatgctggtgttggcgcgcgatccgcaaccgaaagatcccaaaaaagccttcaccctgtggtgggtcgactccagtaagcccggcattaagattaacccgctgcataaaatcggctggcatatgctcagcacctgcgaagtctatctcgacaacgtggaagttgaagagagcgacatggtgggcgaagaaggaatgggtttcctcaatgtgatgtacaactttgagatggagcgcctgatcaacgccgcgcgcagcaccggctttgccgaatgcgcctttgaagatgccgcccgctatgccaaccaacgtatcgcttttggtaagcccattggtcataaccagatgatccaggaaaaactggcgctgatggcgattaagattgacaacatgcgcaacatggtgctgaaagtggcatggcaagccgatcagcatcagtcactgcgcaccagcgcggcgctggcaaaactgtattgcgcacgtaccgcaatggaagtcattgatgatgcgattcaaatcatgggcggtctgggctataccgatgaagcgcgcgtctcccgcttctggcgtgatgtccgttgtgaacgtatcggcggcggtacagacgaaattatgatttacgtagcaggtcggcagatcctgaaagactatcagaacaaataa (SEQ ID No: 15),
[0096]上述醛還原酶yd1基因編碼的蛋白具有下列所示的氨基酸序列:
[0097]MDFSLTEEQELLLASIRELITTNFPEEYFRTCDQNGTYPREFMRALADNGISMLGVPEEFGGIPADYVTQMLAQMEVSKCGAPAFLITNGQCIHSMRRFGSAEQLRKTAESTLE1DPAYALALTEPGAGSDNNSATTTYTRKNGKVYINGQKTFITGAKEYPYMLVLARDPQPKDPKKAFTLWWVDSSKPGIKINPLHKIGWHMLSTCEVYLDNVEVEESDMVGEEGMGFLNVMYNFEMERLINAARSTGFAECAFEDAARYANQRIAFGKPIGHNQMIQEKLALMAIKIDNMRNMVLKVAWQADQHQSLRTSAALAKLYCARTAMEVIDDAIQIMGGLGYTDEARVSRFWRDVRCERIGGGTDEIMIYVAGRQILKDYQNK (SEQ ID No:16)。
[0098]根據本發明的一個實施例，上述異源核酸還可以編碼下列基因表達的產物，該基因可以為來自釀酒酵母醛還原酶ADHl基因，具有如下核苷酸序列:
[0099]atgtctatcccagaaactcaaaaaggtgttatcttctacgaatcccacggtaagttggaatacaaagatattccagttccaaagccaaaggccaacgaattgttgatcaacgttaaatactctggtgtctgtcacactgacttgcacgcttggcacggtgactggccattgccagttaagctaccattagtcggtggtcacgaaggtgccggtgtcgttgteggcatgggtgaaaacgttaagggctggaagatcggtgactacgccggtatcaaatggttgaacggttcttgtatggcctgtgaatactgtgaattgggtaacgaatccaactgtcctcacgctgacttgtctggttacacccacgacggttctttccaacaatacgctaccgctgacgctgttcaagccgctcacattcctcaaggtaccgacttggcccaagtcgcccccatcttgtgtgctggtatcaccgtctacaaggctttgaagtctgctaacttgatggccggtcactgggttgctatctccggtgctgctggtggtctaggttctttggctgttcaatacgccaaggctatgggttacagagtcttgggtattgacggtggtgaaggtaaggaagaattattcagatccatcggtggtgaagtcttcattgacttcactaaggaaaaggacattgtcggtgctgttctaaaggccactgacggtggtgctcacggtgtcatcaacgtttccgtttccgaagccgctattgaagcttctaccagatacgttagagctaacggtaccaccgttttggtcggtatgccagctggtgccaagtgttgttctgatgtcttcaaccaagtcgtcaagtccatctctattgttggttcttacgtcggtaacagagctgacaccagagaagctttggacttcttcgccagaggtttggtcaagtctccaatcaaggttgtcggcttgtctaccttgccagaaatttacgaaaagatggaaaagggtcaaatcgttggtagatacgttgttgacacttctaaataa (SEQ ID No:17),
[0100]上述ADHl基因編碼的蛋白具有下列所不的氣基酸序列:
[0101]MSIPETQKGVIFYESHGKLEYKDIPVPKPKANELLINVKYSGVCHTDLHAWHGDWPLPVKLPLVGGHEGAGVVVGMGENVKGWKI⑶YAGIKWLNGSCMACEYCELGNESNCPHADLSGYTHDGSFQQYATADAVQAAHIPQGTDL.AQVAPILCAGITVYKALKSANLMAGHWVAISGAAGGLGSLAVQYAKAMGYRVLGIDGGEGKEELFRSIGGEVFIDFTKEKDIVGAVLKATDGGAHGVINVSVSEAAIEASTRYVRANGTTVLVGMPAGAKCCSDVFNQVVKSISIVGSYVGNRADTREALDFFARGLVKSPIKVVGLSTLPEIYEKMEKGQIVGRYVVDTSK (SEQ ID No:18)。
[0102]根據本發明的一個實施例，上述異源核酸還可以編碼下列基因表達的產物，該基因可以為來自釀酒酵母醛還原酶ADH2基因，具有如下核苷酸序列:
[0103]atgtctattccagaaactcaaaaagccattatcttctacgaatccaacggcaagttggagcataaggatatcccagttccaaagccaaagcccaacgaattgttaatcaacgtcaagtactctggtgtctgccacaccgatttgcacgcttggcatggtgactggccattgccaactaagttaccattagttggtggtcacgaaggtgccggtgtcgttgteggcatgggtgaaaacgttaagggctggaagatcggtgactacgccggtatcaaatggttgaacggttcttgtatggcctgtgaatactgtgaattgggtaacgaatccaactgtcctcacgctgacttgtctggttacacccacgacggttctttccaagaatacgctaccgctgacg ctgttcaagccgctcacattcctcaaggtactgacttggctgaagtcgcgccaatcttgtgtgctggtatcaccgtatacaaggctttgaagtctgccaacttgagagcaggccactgggcggccatttctggtgctgctggtggtctaggttctttggctgttcaatatgctaaggcgatgggttacagagtcttaggtattgatggtggtccaggaaaggaagaattgtttacctcgctcggtggtgaagtattcatcgacttcaccaaagagaaggacattgttagcgcagtcgttaaggctaccaacggcggtgcccacggtatcatcaatgtttccgtttccgaagccgctatcgaagcttctaccagatactgtagggcgaacggtactgttgtcttggttggtttgccagccggtgcaaagtgctcctctgatgtcttcaaccacgttgtcaagtctatctccattgtcggctcttacgtggggaacagagctgataccagagaagccttagatttctttgccagaggtctagtcaagtctccaataaaggtagttggcttatccagtttaccagaaatttacgaaaagatggagaagggccaaattgctggtagatacgttgttgacacttctaaataa (SEQ ID No: 19),
[0104]上述ADH2基因編碼的蛋白具有下列所不的氣基酸序列:
[0105]MSIPETQKAIIFYESNGKLEHKDIPVPKPKPNELLINVKYSGVCHTDLHAWH⑶WPLPTKLPLVGGHEGAGVVVGMGENVKGWKI⑶YAGIKWLNGSCMACEYCELGNESNCPHADLSGYTHDGSFQEYATADAVQAAHIPQGTDL.AEVAPILCAGITVYKALKSANLRAGHWAAISGAAGGLGSLAVQYAKAMGYRVLGIDGGPGKEELFTSLGGEVFIDFTKEKDIVSAVVKATNGGAHGIINVSVSEAAIEASTRYCRANGTVVLVGLPAGAKCSSDVFNHVVKSISIVGSYVGNRADTREALDFFARGLVKSPIKVVGLSSLPEIYEKMEKGQIAGRYVVDTSK (SEQ ID No:20)。
[0106]根據本發明的一個實施例，上述異源核酸還可以編碼下列基因表達的產物，該基因可以為來自釀酒酵母醛還原酶ADH3基因，具有如下核苷酸序列:
[0107]atgttgagaacgtcaacattgttcaccaggcgtgtccaaccaagcctattttctagaaacattcttagattgcaatccacagctgcaatccctaagactcaaaaaggtgtcatcttttatgagaataaggggaagctgcattacaaagatatccctgtccccgagcctaagccaaatgaaattttaatcaacgttaaatattctggtgtatgtcacaccgatttacatgcttggcacggcgattggccattacctgttaaactaccattagtaggtggtcatgaaggtgctggtgtagttgtcaaactaggttccaatgtcaagggctggaaagtcggtgatttagcaggtatcaaatggctgaacggttcttgtatgacatgcgaattctgtgaatcaggtcatgaatcaaattgtccagatgctgatttatctggttacactcatgatggttctttccaacaatttgcgaccgctgatgctattcaagccgccaaaattcaacagggtaccgacttggccgaagtagccccaatattatgtgctggtgttactgtatataaagcactaaaagaggcagacttgaaagctggtgactgggttgccatctctggtgctgcaggtggcttgggttccttggccgttcaatatgcaactgcgatgggttacagagttctaggtattgatgcaggtgaggaaaaggaaaaacttttcaagaaattggggggtgaagtattcatcgactttactaaaacaaagaatatggtttctgacattcaagaagctaccaaaggtggccctcatggtgtcattaacgtttccgtttctgaagccgctatttctctatctacggaatatgttagaccatgtggtaccgtcgttttggttggtttgcccgctaacgcctacgttaaatcagaggtattctctcatgtggtgaagtccatcaatatcaagggttcttatgttggtaacagagctgatacgagagaagccttagacttctttagcagaggtttgatcaaatcaccaatcaaaattgttggattatctgaattaccaaaggtttatgacttgatggaaaagggcaagattttgggtagatacgtcgtcgatactagtaaataa (SEQ ID No:21)，
[0108]上述ADH3基因編碼的蛋白具有下列所不的氣基酸序列:
[0109]MLRTSTLFTRRVQPSLFSRNILRLQSTAAIPKTQKGVIFYENKGKLHYKDIPVPEPKPNEILINVKYSGVCHTDLHAWHGDWPLPVKLPLVGGHEGAGVVVKLGSNVKGWKV⑶LAGIKWLNGSCMTCEFCESGHESNCPDADLSGYTHDGSFQQFATADAIQAAKIQQGTDLAEVAPILCAGVTVYKALKEADLKAGDWVAISGAAGGLGSLAVQYATAMGYRVLGIDAGEEKEKLFKKLGGEVFIDFTKTKNMVSDIQEATKGGPHGVINVSVSEAAISLSTEYVRPCGTVVLVGLPANAYVKSEVFSHVVKSINIKGSYVGNRADTREALDFFSRGLIKSPIKIVGLSELPKVYDLMEKGKILGRYVVDTSK(SEQ ID No:22)。
[0110]根據本發明的一個實施例，上述異源核酸還可以編碼下列基因表達的產物，該基因可以為來自釀酒酵母醛還原酶ADH4基因，具有如下核苷酸序列:
[0111]atgtcttccgttactgggttttacattccaccaatctctttctttggtgaaggtgctttagaagaaaccgctgattacatcaaaaacaaggattacaaaaaggctttgatcgttactgatcctggtattgcagctattggtctctccggtagagtccaaaagatgttggaagaacgtgacttaaacgttgctatctatgacaaaactcaaccaaacccaaatattgccaatgtcacagctggtttgaaggttttgaaggaacaaaactctgaaattgttgtttccattggtggtggttctgctcacgacaatgctaaggccattgctttattggctactaacggtggggaaatcggagactatgaaggtgtcaatcaatctaagaaggctgctttaccactatttgccatcaacactactgctggtactgcttccgaaatgaccagattcactattatctctaatgaagaaaagaaaatcaagatggctatcattgacaacaacgtcactccagctgttgctgtcaacgatccatctaccatgtttggtttgccacctgctttgactgctgctactggtctagatgctttgactcactgtatcgaagcttatgtttccaccgcctctaacccaatcaccgatgcctgtgctttgaagggtattgatttgatcaatgaaagcttagtcgctgcatacaaagacggtaaagacaagaaggccagaactgacatgtgttacgctgaatacttggcaggtatggctttcaacaatgcttctctaggttatgttcatgcccttgctcatcaacttggtggtttctaccacttgcctcatggtgtttgtaacgctgtcttgttgcctcatgttcaagaggccaacatgcaatgtccaaaggccaagaagagattaggtgaaattgctttgcatttcggtgcttctcaagaagatccagaagaaaccatcaaggctttgcacgttttaaacagaaccatgaacattccaagaaacttgaaagaattaggtgttaaaaccgaagattttgaaattttggctgaacacgccatgcatgatgcctgccatttgactaacccagttcaattcaccaaagaacaagtggttgccattatcaagaaagcctatgaatattaa (SEQ ID No:23)，
[0112]上述ADH4基因編碼的蛋白具有下列所示的氨基酸序列:
[0113]MSSVTGFYIPPISFFGEGALEETADYIKNKDYKKALIVTDPGIAAIGLSGRVQKMLEERDLNVAIYDKTQPNPNIANVTAGLKVLKEQNSEIVVSIGGGSAHDNAKAIALLATNGGEI⑶YEGVNQSKKAALPLFAINTTAGTASEMTRFTIISNEEKKIKMAIIDNNVTPAVAVNDPSTMFGLPPALTAATGLDALTHCIEAYVSTASNPITDACALKGIDLINESLVAAYKDGKDKKARTDMCYAEYLAGMAFNNASLGYVHALAHQLGGFYHLPHGVCNAVLLPHVQEANMQCPKAKKRLGEIALHFGASQEDPEETIKALHVLNRTMNIPRNLKELGVKTEDFEILAEHAMHDACHLTNPVQFTKEQVVAIIKKAYEY (SEQ ID No:24)。
[0114]根據本發明的一個實施例，上述異源核酸還可以編碼下列基因表達的產物，該基因可以為來自釀酒酵母醛還原酶ADH5基因，具有如下核苷酸序列:
[0115]atgccttcgcaagtcattcctgaaaaacaaaaggctattgtcttttatgagacagatggaaaattggaatataaagacgtcacagttccggaacctaagcctaacgaaattttagtccacgttaaatattctggtgtttgtcatagtgacttgcacgcgtggcacggtgattggccatttcaattgaaatttccattaatcggtggtcacgaaggtgctggtgttgttgttaagttgggatctaacgttaagggctggaaagtcggtgattttgcaggtataaaatggttgaatgggacttgcatgtcctgtgaatattgtgaagtaggtaatgaatctcaatgtccttatttggatggtactggcttcacacatgatggtacttttcaagaatacgcaactgccgatgccgttcaagctgcccatattccaccaaacgtcaatcttgctgaagttgccccaatcttgtgtgcaggtatcactgtttataaggcgttgaaaagagccaatgtgataccaggccaatgggtcactatatccggtgcatgcggtggcttgggttctctggcaatccaatacgcccttgctatgggttacagggtcattggtatcgatggtggtaatgccaagcgaaagttatttgaacaattaggcggagaaatattcatcgatttcacggaagaaaaagacattgttggtgctataataaaggccactaatggcggttctcatggagttattaatgtgtctgtttctgaagcagctatcgaggcttctacgaggtattgtaggcccaatggtactgtcgtcctggttggtatgccagctcatgcttactgcaattccgatgttttcaatcaagttgtaaaatcaatctccatcgttggatcttgtgttggaaatagagctgatacaagggaggctttagatttcttcgccagaggtttgatcaaatctccgatccacttagctggcctatcggatgttcctgaaatttttgcaaagatggagaagggtgaaattgttggtagatatgttgttgagacttctaaatga (SEQ ID No:25)，
[0116]上述ADH5基因編碼的蛋白具有下列所不的氣基酸序列:
[0117]MPSQVIPEKQKAIVFYETDGKLEYKDVTVPEPKPNEILVHVKYSGVCHSDLHAWHGDWPFQLKFPLIGGHEGAGVVVKLGSNVKGWKVGDFAGIKWLNGTCMSCEYCEVGNESQCPYLDGTGFTHDGTFQEYATADAVQAAHIPPNVNLAEVAPILCAGITVYKALKRANVIPGQWVTISGACGGLGSLAIQYALAMGYRVIGIDGGNAKRKLFEQLGGEIFIDFTEEKDIVGAIIKATNGGSHGVINVSVSEAAIEASTRYCRPNGTVVLVGMPAHAYCNSDVFNQVVKSISIVGSCVGNRADTREALDFFARGLIKSPIHLAGLSDVPEIFAKMEKGEIVGRYVVETSK (SEQ ID No:26)。
[0118]根據本發明的一個實施例，上述異源核酸還可以編碼下列基因表達的產物，該基因可以為來自釀酒酵母醛還原酶ADH6基因，具有如下核苷酸序列:
[0119]atgtcttatcctgagaaatttgaaggtatcgctattcaatcacacgaagattggaaaaacccaaagaagacaaagtatgacccaaaaccattttacgatcatgacattgacattaagatcgaagcatgtggtgtctgcggtagtgatattcattgtgcagctggtcattggggcaatatgaagatgccgctagtcgttggtcatgaaatcgttggtaaagttgtcaagctagggcccaagtcaaacagtgggttgaaagtcggtcaacgtgttggtgtaggtgctcaagtcttttcatgcttggaatgtgaccgttgtaagaatgataatgaaccatactgcaccaagtttgttaccacatacagtcagccttatgaagacggctatgtgtcgcagggtggctatgcaaactacgtcagagttcatgaacattttgtggtgcctatcccagagaatattccatcacatttggctgctccactattatgtggtggtttgactgtgtactctccattggttcgtaacggttgcggtccaggtaaaaaagttggtatagttggtcttggtggtatcggcagtatgggtacattgatttccaaagccatgggggcagagacgtatgttatttctcgttcttcgagaaaaagagaagatgcaatgaagatgggcgccgatcactacattgctacattagaagaaggtgattggggtgaaaagtactttgacaccttcgacctgattgtagtctgtgcttcctcccttaccgacattgacttcaacattatgccaaaggctatgaaggttggtggtagaattgtctcaatctctataccagaacaacacgaaatgttatcgctaaagccatatggcttaaaggctgtctccatttcttacagtgctttaggttccatcaaagaattgaaccaactcttgaaattagtctctgaaaaagatatcaaaatttgggtggaaacattacctgttggtgaagccggcgtccatgaagccttcgaaaggatggaaaagggtgacgttagatatagatttaccttagtcggctacgacaaagaattttcagactag (SEQ ID No:27)，
[0120]上述ADH6基因編碼的蛋白具有下列所不的氣基酸序列:
[0121]MSYPEKFEGIAIQSHEDWKNPKKTKYDPKPFYDHDIDIKIEACGVCGSDIHCAAGHWGNMKMPLVVGHEIVGKVVKLGPKSNSGLKVGQRVGVGAQVFSCLECDRCKNDNEPYCTKFVTTYSQPYEDGYVSQGGYANYVRVHEHFVVPIPENIPSHLAAPLLCGGLTVYSPLVRNGCGPGKKVGIVGLGGIGSMGTLISKAMGAETYVISRSSRKREDAMKMGADHYIATLEEGDWGEKYFDTFDLIVVCASSLTDIDFNIMPKAMKVGGRIVSISIPEQHEMLSLKPYGLKAVSISYSALGSIKELNQLLKLVSEKDIKIWVETLPVGEAGVHEAFERMEKGDVRYRFTLVGYDKEFSD (SEQ ID No:28)。
[0122]根據本發明的一個實施例，上述異源核酸還可以編碼下列基因表達的產物，該基因可以為來自釀酒酵母醛還原酶ADH7基因，具有如下核苷酸序列:
[0123]atgctttacccagaaaaatttcagggcatcggtatttccaacgcaaaggattggaagcatcctaaattagtgagttttgacccaaaaccctttggcgatcatgacgttgatgttgaaattgaagcctgtggtatctgcggatctgattttcatatagccgttggtaattggggtccagtcccagaaaatcaaatccttggacatgaaataattggccgcgtggtgaaggttggatccaagtgccacactggggtaaaaatcggtgaccgtgttggtgttggtgcccaagccttggcgtgttttgagtgtgaacgttgcaaaa gtgacaacgagcaatactgtaccaatgaccacgttttgactatgtggactccttacaaggacggctacatttcacaaggaggctttgcctcccacgtgaggcttcatgaacactttgctattcaaataccagaaaatattccaagtccgctagccgctccattattgtgtggtggtattacagttttctctccactactaagaaatggctgtggtccaggtaagagggtaggtattgttggcatcggtggtattgggcatatggggattctgttggctaaagctatgggagccgaggtttatgcgttttcgcgaggccactccaagcgggaggattctatgaaactcggtgctgatcactatattgctatgttggaggataaaggctggacagaacaatactctaacgctttggaccttcttgtcgtttgctcatcatctttgtcgaaagttaattttgacagtatcgttaagattatgaagattggaggctccatcgtttcaattgctgctcctgaagttaatgaaaagcttgttttaaaaccgttgggcctaatgggagtatcaatctcaagcagtgctatcggatctaggaaggaaatcgaacaactattgaaattagtttccgaaaagaatgtcaaaatatgggtggaaaaacttccgatcagcgaagaaggcgtcagccatgcctttacaaggatggaaagcggagacgtcaaatacagatttactttggtcgattatgataagaaattccataaatag (SEQ ID No:29)，
[0124]上述ADH7基因編碼的蛋白具有下列所不的氣基酸序列:
[0125]MLYPEKFQGIGISNAKDWKHPKLVSFDPKPFGDHDVDVEIEACGICGSDFHIAVGNWGPVPENQILGHEIIGRVVKVGSKCHTGVKI⑶RVGVGAQALACFECERCKSDNEQYCTNDHVLTMWTPYKDGYISQGGFASHVRLHEHFAIQIPENIPSPLAAPLLCGGITVFSPLLRNGCGPGKRVGIVGIGGIGHMGILLAKAMGAEVYAFSRGHSKREDSMKLGADHYIAMLEDKGWTEQYSNALDLLVVCSSSLSKVNFDSIVKIMKIGGSIVSIAAPEVNEKLVLKPLGLMGVSISSSAIGSRKEIEQLLKLVSEKNVKIWVEKLPISEEGVSHAFTRMES⑶VKYRFTLVDYDKKFHK (SEQ ID No:30)。
[0126]根據本發明的一個實施例，上述異源核酸還可以編碼下列基因表達的產物，該基因可以為來自Saccharomyces kluyveri醒還原酶ADHl基因，具有如下核苷酸序列:
[0127]atgtctgctccacaaatcccagaaactcaaaaggccgttatcttctacgaaaatggtggtgaattgcaatacaaagacatcccagtcccaaagcctaagtccaatgaaatcttgatcaacatcaagtactccggtgtctgccacaccgacttgcacgcctggaagggtgactggccattgccaaccaagttgcctttagtcggtggtcacgagggtgctggtatcgttgtcggcatgggtgaaaacgtcaagggctggaagatcggtgactacgccggtatcaagtggttgaacggttcttgtatgtcctgtgaatactgtgaattgtccaacgaatccaactgtccagacgccgacttgtccggttacactcacgacggttctttccaacaatacgccactgctgacgccgtccaagccgccagaatcgctccaggtaccgacttggccgaagttgccccagtcttgtgtgccggtatcactgtgtacaaggccttgaagtctgccaacttgagagccggtgaatgggttgccatctccggtgcttgtggtggtctaggttctttggccatccaatacgccaaggccatgggttaccgtgttctaggtatcgacggtggtgacgaaaaggccgctttgttcaaggaattgggcggtgaagtgtttatcgatttcaccaagaccaaggacgtcgtcaaggctgtcgtcgacgccactaacggtggtgcccacggtgtcatcaacgtttctgtctctgaagccgctatcgaggcctctaccgtgtactgtagagccaacggtaccgttgtcctggtcggtttgccaggcggtgccaagtgtaagtctgatgtcttcaaccaagtcgtcaagtccatctccattgtcggttcttacgtcggtaacagagctgacaccagagaagccttggactttttctccagaggtttggtcaagtctccaatcatgattgtcggtttgtccgaattgccaagcatttacgaaaagatggaaaagggtgccattgtcggtagatacgttgtcgacacctccaaataagctcctttcacgccttgatagaagtgatgagcacgctt (SEQ ID No:31)，
[0128]其編碼的蛋白具有下列所示的氨基酸序列:
[0129]MSAPQIPETQKAVIFYENGGELQYKDIPVPKPKSNEILINIKYSGVCHTDLHAWKGDWPLPTKLPLVGGHEGAGIVVGMGENVKGWKIGDYAGIKWLNGSCMSCEYCELSNESNCPDADLSGYTHDGSFQQYATADAVQAARIAPGTDLAEVAPVLCAGITVYKALKSANLRAGEWVAISGACGGLGSLAIQYAKAMGYRVLGIDGGDEKAALFKELGGEVFIDFTKTKDVVKAVVDATNGGAHGVINVSVSEAAIEASTVYCRANGTVVLVGLPGGAKCKSDVFNQVVKSISIVGSYVGNRADTREALDFFSRGLVKSPIMIVGLSELPSIYEKMEKGAIVGRYVVDTSK (SEQ ID No:32)。
[0130]根據本發明的一個實施例，上述異源核酸還可以編碼下列基因表達的產物，該基因可以為來自Saccharomyces kluyveri醒還原酶ADH2基因，具有如下核苷酸序列:
[0131]atgtctgcttcccaaatcccagaaactcaaaaggccgttattttctacgaaaacggcggtgaattgcaatacaaggatatcccagtcccaaagccaaagtccaatgaaatcttgatcaatgtcaagtactccggtgtctgccacaccgacttgcacgcctggaagggtgactggccattgccaaccaagttgcccctggtcggtggccacgagggtgccggtgtcgttgtcgccattggtgaaaacgtcaagggctggaagatcggcgactacgccggtatcaagtggttgaacggttcctgtatggcttgtgaatactgtgagttgtccaacgaatccaactgtccagaagccgacttgtccggttacacccacgacggttctttccaacagtacgctaccgccgacgctgtgcaggcggccagaatccctgctggcaccgacttggccgaagttgccccagtcttgtgtgccggtatcaccgtgtacaaggccttgaagtctgccaacttgagagccggtgaatgggttgccatctccggtgcttgtggtggtctaggttctttggccatccaatacgccaaggccatgggttaccgtgttctaggtatcgacggtggtgacgaaaaggccgctttgttcaatgagttgggcggtgaagtgtttatcgatttcaccaagaccaaggacgttaccaaggccgtcatcgatgccaccaacggtggtgcccacggtgtcatcaacgtttccgtctccgaagccgctatcgaggcctctaccgtgtactgtagagccaacggtaccgttgtcctggtcggtttgccaggtggtgccaagtgtaagtctgatgtcttcaaccaagtcgtcaagtccacgaccattgtcggttcctacgtcggtaacagagctgacaccagagaagccttggactttttcgccagagggttggtcaagtctccaatcaaggttgtcggtttgtccgaattgccaagcatttacgaaaagatgcaaaagggtgccattgtcggtagatacgttgtcgacacttccaaatga (SEQ ID No:33)，
[0132] 其編碼的蛋白具有下列所示的氨基酸序列:
[0133]MSASQIPETQKAVIFYENGGELQYKDIPVPKPKSNEILINVKYSGVCHTDLHAWKGDWPLPTKLPLVGGHEGAGVWAIGENVKGWKI⑶YAGIKWLNGSCMACEYCELSNESNCPEADLSGYTHDGSFQQYATADAVQAARIPAGTDLAEVAPVLCAGITVYKALKSANLRAGEWVAISGACGGLGSLAIQYAKAMGYRVLGIDGGDEKAALFNELGGEVFIDFTKTKDVTKAVIDATNGGAHGVINVSVSEAAIEASTVYCRANGTVVLVGLPGGAKCKSDVFNQVVKSTTIVGSYVGNRADTREALDFFARGLVKSPIKVVGLSELPSIYEKMQKGAIVGRYVVDTSK (SEQ ID No:34)。
[0134]根據本發明的一個實施例，上述重組的微生物其類型并不受特別限制，根據本發明的具體實施例，該微生物可以為真核微生物，也可以為原核微生物。例如，根據本發明的具體示例，可以采用的微生物包括但不限于細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體或者病毒和酵母，可以為上述微生物的至少一種。根據本發明的具體實施例，上述微生物優選采用大腸桿菌或酵母，還可以優選為畢赤酵母或者釀酒酵母。由此可以進一步提高利用該微生物制備得到的重組微生物的性能，以便進一步提高利用該重組微生物制備脂肪醇的效率。
[0135]適于轉化微生物的系統、制備重組微生物的方法
[0136]根據本發明的一個實施例，可以通過常規的分子生物學方法獲得上述微生物。由此，在本發明的第二方面，本發明還提出了一種適于轉化微生物的系統。利用該系統可以通過常規的方法，將異源核酸分子引入微生物細胞中，從而得到重組微生物，該重組微生物適于制備脂肪醇類化合物。根據本發明的具體實施例，該系統具體可以包括:適于轉化微生物的載體，該載體上攜帶有異源核酸分子，該異源核酸分子編碼具有醛還原酶活性的蛋白質。由此，可以通過常規的分子生物學手段，將該攜帶有異源核酸分子的載體引入到微生物中，從而可以在微生物細胞中表達該異源核酸，從而編碼具有醛還原酶活性的蛋白質。進一步可以通過在微生物細胞內表達醛還原酶基因或其功能等同體，從而發揮醛還原酶的生物活性，進而催化脂肪醛還原為脂肪醇。
[0137]根據本發明的一個實施例，異源核酸編碼下列基因至少一種的表達產物:Escherichia coli adhP、Escherichia coli adhE、Escherichia coli yqhD、Escherichiacoli yjgB、Escherichia coli yiaY、Escherichia coli eutG、Escherichia coli fucO、Escherichia coli yd1、 Saccharomyces cerevisiae ADHl> Saccharomyces cerevisiaeADH2、Saccharomyces cerevisiae ADH3、Saccharomyces cerevisiae ADH4>Saccharomycescerevisiae ADH5、 Saccharomyces cerevisiae ADH6、 Saccharomyces cerevisiae ADH7、Saccharomyces kluyveri ADHl、以及 Saccharomyces kluyveri ADH2。由此可以在相應基因表達產物的作用下，將脂肪醛還原成脂肪醇。
[0138]根據本發明的一個實施例，具有醛還原酶活性的蛋白質具有如SEQ ID No:2、4、6、
8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34所示的氨基酸序列。由此可以進一步提高異源核酸分子編碼表達產物的效率，從而進一步提高利用該微生物制備脂肪醇的效率。
[0139]根據本發明的一個實施例，異源核酸分子具有SEQ ID No:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33所示的核苷酸序列。由此，可以進一步提高重組微生物包含的異源核酸分子編碼的蛋白質的酶活性，從而進一步提高利用該微生物制備脂肪醇的效率。
[0140]根據本發明的實施例，上述適于轉化微生物的系統，可以轉化的微生物的類型并不受特別限制。可以為真核微生物，也可以為原核微生物。其類型并不受特別限制。例如，根據本發明的實施例，可以采用的微生物包括但不限于細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母。可以為上述微生物的至少一種。根據本發明的實施例，上述微生物優選采用酵母和大腸桿菌，根據本發明的具體示例，上述微生物優選釀酒酵母、畢赤酵母和大腸桿菌作為生產生物燃料的微生物。
[0141]根據本發明的具體實施例，該適于轉化微生物的系統可以進一步包括表達調控序列(啟動子，增強子，等等)，以指導所編碼基因產物的合成，優選啟動子，更優選IPTG-誘導型啟動子。所述核酸序列的至少之一被設置在所述IPTG-誘導型啟動子的控制之下。由此，可以通過在IPTG-誘導型啟動子的控制下，由此容易通過啟動子的調控，表達目的蛋白，從而實現脂肪醇的合成。根據本發明的實施例，可以用于本發明的啟動子可以來源于微生物或者病毒，包括CMV和SV40。根據使用的宿主/載體系統，表達載體可以使用大量合適的轉錄和翻譯控制元件中的任意一種，包括組成型和誘導型啟動子，轉錄增強子元件，轉錄終止子，等等(參見例如，Bitter et al., Methods in Enzymology, 153:156-544,1987,通過參照并入本文)。
[0142]根據本發明的具體實施例，用于原核宿主細胞的合適啟動子包括，但不限于能夠識別T4、T3、Sp6和T7聚合酶的啟動子，噬菌體λ的PR和PL啟動子，大腸桿菌的trp、recA、熱休克和IacZ啟動子，枯草芽孢桿菌的α -淀粉酶和Σ特異性啟動子，桿菌噬菌體啟動子，鏈霉菌啟動子，噬菌體λ的int啟動子，pBR322i3-內酰胺酶基因的bla啟動子，和氯霉素乙酰轉移酶基因的CAT啟動子。關于原核啟動子的綜述可參見Glick，J.1nd.Microb1l.1:277,1987 ；ffatson et al., Benjamin Cummins(1987);和 Sambrook et al.,上文，通過參照并入本文。
[0143]根據本發明的實施例，該適于轉化微生物的系統可以進一步包括表達調控序列(啟動子，增強子，等等)，以指導所編碼基因產物的合成，優選啟動子，更優選AOX-誘導型啟動子。所述核酸序列的至少之一被設置在所述甲醇誘導型啟動子的控制之下。由此，可以通過在AOX-誘導型啟動子的控制下，由此容易通過啟動子的調控，表達目的蛋白，從而實現脂肪醇的合成。根據本發明的實施例，可以用于本發明的啟動子可以來源于微生物或者病毒，包括CMV和SV40。
[0144]根據本發明的實施例，用于真核宿主內使用的合適真核啟動子的非限制性實例來源于病毒，包括小鼠金屬硫蛋白I基因的啟動子；皰疹病毒的TK啟動子；SV40早期啟動子；Rous肉瘤病毒啟動子；巨細胞病毒啟動子；酵母gal4基因啟動子；IgG啟動子和AOX啟動子。
[0145]根據本發明的實施例，合適的誘導型啟動子包括不限于:受體蛋白、代謝物或者化學制品影響的啟動子。具體地，包括:牛白血病病毒啟動子、金屬硫蛋白啟動子、地塞米松誘導型MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP pol III啟動子、四環素誘導型CMV啟動子以及來自trp和Iac操縱子的啟動子。
[0146]根據本發明的一些實施例，前述的核酸序列可以被連接到組成型啟動子上。因而利用該系統轉化微生物所得到的重組微生物能夠持續地表達醛還原酶基因，從而代謝合成脂肪醇。
[0147]借助上述適于轉化微生物的系統轉化微生物的方法，并不受特別限制，可以為諸如電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂質體介導的轉染、接合作用、轉導等等，可以將異源核酸序列穩定地或者瞬時引入宿主細胞，所述異源核酸序列參與產生脂肪醇、生物燃料或其中間物。根據本發明的實施例，對于穩定轉化，異源核酸序列還包括選擇性標志物，諸如，抗生素抗性，例如新霉素、四環素、氯霉素、卡那霉素的抗性，彌補營養缺陷型的基因等等。
[0148]由此，在本發明的第三個方面，本發明還提供了一種獲得重組微生物的方法，該方法包括使用前面適于轉化微生物的系統轉化微生物，以便獲得所述重組微生物。由此，根據本發明實施例，所得到的重組微生物中具有了異源核酸分子，該異源核酸分子可以編碼具有具有醛還原酶活性的蛋白質。關于這些異源核酸序列，前面已經進行了詳細描述，在此不再贅述。
[0149]根據本發明的具體實施例，將上述異源核酸序列引入宿主細胞的酶的順序和數量并不受特別限制。既可以是同時引入到微生物細胞中，也可以是依次引入到微生物細胞中。根據本發明的實施例，可以將各個異源核酸序列設置在同一個載體上，也可以設置在不同的載體上，例如各個核酸序列包含在不同的載體上。這些載體可以是本領域中任何已知的表達載體。合適的表達載體包括，但不限于，病毒載體，諸如桿狀病毒載體，曬菌體載體，諸如噬菌體載體，質粒，噬菌體，粘粒，cosmids,細菌人工染色體，病毒載體(例如，基于以下病毒的病毒載體:牛痘病毒、脊髓灰質炎病毒、腺病毒、腺相關病毒、SV40、單純皰疹病毒，等等)，基于Pl的人工染色體，酵母質粒，酵母人工染色體，和任意對目的特定宿主具有特異性的其他載體(諸如大腸桿菌、Pseudomonas pi sum和釀酒酵母)。根據本發明的實施例，表達載體上可以進一步包括一種或者多種選擇標記基因，以提供用于選擇轉化宿主細胞的表型性狀。所述選擇標記基因編碼在選擇性培養基中生長的轉化宿主細胞存活或者生長必需的蛋白。沒有轉化包含選擇標記基因的載體的宿主細胞將不會在培養基中存活。通常的選擇標記基因編碼以下蛋白: (a)提供對抗生素或者其他毒素的抗性，例如，氨芐青霉素，新霉素，甲氨喋呤或者四環素，(b)彌補營養缺陷型缺陷，或者(c)提供復合培養基沒有的重要營養物，例如，編碼桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。在可選的實施方式中，選擇標記基因是提供氨芐青霉素或者卡那霉素抗性(用于原核宿主細胞，諸如大腸桿菌)的基因。
[0150]生產脂肪醇的方法和系統
[0151]在本發明的第四個方面，本發明還提出了一種生產脂肪醇的方法。該方法包括下列步驟:培養前面所述的重組微生物，以便利用該重組微生物將脂肪醛還原成脂肪醇，以及分離該脂肪醇。根據本發明的具體實施例，利用包含脂肪醛的培養基培養該重組微生物，由此該重組微生物可以利用自身體內產生的脂肪醛合成脂肪醇，也可以利用培養基中的脂肪醛合成脂肪醇，又可以擴大原料脂肪醛的含量，以便進一步提高制備脂肪醇的效率。由此，該方法可以借助本發明實施例的重組微生物合成脂肪醇。本領域技術人員可以通過對微生物以及所采用的核酸的載體進行分析，能夠獲得最適合的培養條件。
[0152]根據本發明的一個實施例，所采用的微生物的類型不受特別限制，根據本發明的具體實施例，上述微生物可以為真核微生物，也可以為原核微生物。例如，根據本發明的具體實施例，可以采用的微生物包括但不限于細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體或者病毒和酵母，可以為上述微生物的至少一種。根據本發明的實施例，優選采用畢赤酵母、釀酒酵母及大腸桿菌，以便用于生產脂肪醇。這是因為對于這些微生物而言，易于遺傳修飾，易于控制生長、產生以及減少或者消除降低生物合成途徑效率的副反應。此外，這種重組微生物可以直接利用可再生能源以脂肪醛作為合成脂肪醇的底物，不需要專門的儲存或運輸方法。
[0153]在本發明的第五個方面，本發明還提供了一種用于生產脂肪醇的系統。根據本發明的實施例，該系統包括:生物反應器和分離裝置，生物反應器中設置有前面所述的重組微生物和適于該重組微生物生長的培養基，以便使重組微生物利用脂肪醛合成脂肪醇；分離裝置與生物反應器相連，用于分離脂肪醇。由此利用該生產脂肪醇的系統，可以有效地實施前面所述的生產脂肪醇的方法，從而可以有效地用于制備脂肪醇。
[0154]根據本發明的具體實施例，培養基中包含脂肪醛，由此生物反應器中的重組微生物可以利用自身體內產生的脂肪醛生產脂肪醇，也可以了利用培養基中含有的脂肪醛生產脂肪醇，由此利用含有脂肪醛的培養基培養重組微生物，可以進一步提高底物脂肪醛的含量，以便進一步提高脂肪醇的生產效率。
[0155]本發明的優點是在微生物中引入異源基因構建一條合成肪醇的代謝途徑，不需要通過過多的化學合成反應，減少了環境的污染，也減少了對石油儲量的消耗。同時，由于微生物生長速度快，便于進行遺傳操作，其抗污染性能優異，且人工可以調節其生長速度和防止其肆意生長破壞環境，種種因素表明改造微生物進行工業生產脂肪醇是切實可行的。
[0156]下面參考具體實施例，對本發明進行描述，需要說明的是，這些實施例僅僅是描述性的，而不以任何方式限制本發明。
[0157]下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
[0158]下面對本發明實施例中所采用制備脂肪醇的一般方法進行描述，其中，圖1-8中提供了實施例中所涉及的主要載體的示意圖。
[0159]實施例1構建重組微生物轉化系統的方法
[0160]1、可轉化大腸桿菌的系統構建
[0161]用Qiagen 公司的Blood and Cell Culture DNA Mini Kit 純化獲得大腸桿菌BL21基因組DNA。利用表1中的引物序列，通過PCR的方法擴增出大腸桿菌的adhP，adhE和yqhD基因并克隆在載體PET28上，分別構建為質粒ρΕΧΙΟΟ，ρΕΧΙΟΙ和pEX102 (圖1_3)。將所用的Acyl ACP reductase酶按照序列進行全合成并通過NcoI和BamHI克隆在pET28上,構建可以合成脂肪醛的表達載體PRLl 10 (圖4)。
[0162]Acyl ACP reductase 酶的序列如下:
[0163] ATGGGCTTCGGATTGATCGGTCACTTGACCTCCCTTGAGCAGGCCCGTGACGTCTCCCGTCGTATGGGTTATGATGAGTACGCCGACCAGGGTTTGGAGTTCTGGTCCTCTGCTCCACCACAGATTGTCGACGAGATCACCGTCACTTCTGCCACCGGAAAGGTCATCCACGGACGTTACATCGAGTCCTGCTTCTTGCCAGAGATGTTGGCTGCCAGACGTTTCAAGACCGCCACCCGTAAGGTCTTGAACGCCATGTCTCACGCCCAGAAACACGGAATTGACATCTCCGCCTTGGGAGGATTCACCTCTATCATCTTCGAGAATTTCGACTTGGCTTCCTTGCGTCAGGTCCGTGACACCACCCTTGAGTTCGAGAGATTCACTACCGGAAACACCCATACCGCCTACGTCATTTGCCGTCAGGTCGAGGCTGCTGCTAAGACCTTGGGAATCGACATCACCCAGGCCACTGTCGCTGTCGTTGGAGCTACCGGAGACATCGGTTCTGCTGTCTGCCGTTGGTTGGAT

【權利要求】
1.一種重組微生物，其特征在于，所述微生物包含異源核酸分子，所述異源核酸分子編碼具有醛還原酶活性的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的重 組微生物，所述異源核酸編碼下列基因至少一種的表達產物:
Escherichia coli adhP、
Escherichia coli adhE、
Escherichia coli yqhD、
Escherichia coli yjgB、
Escherichia coli yiaY、
Escherichia coli eutG、
Escherichia coli fucO、
Escherichia coli yd1、
Saccharomyces cerevisiae ADHl、
Saccharomyces cerevisiae ADH2、
Saccharomyces cerevisiae ADH3、
Saccharomyces cerevisiae ADH4、
Saccharomyces cerevisiae ADH5、
Saccharomyces cerevisiae ADH6、
Saccharomyces cerevisiae ADH7、 Saccharomyces kluyveri ADHl、以及 Saccharomyces kluyveri ADH2。
3.根據權利要求1所述的重組微生物，其特征在于，所述具有醛還原酶活性的蛋白質具有如 SEQ ID No:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32 或 34 所示的氨基酸序列;所述異源核酸分子具有SEQ ID No:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33所示的核苷酸序列。
4.根據權利要求1所述的重組微生物，其特征在于，所述微生物為選自真核微生物和原核微生物的至少一種， 任選地，所述微生物為選自細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母的至少一種， 任選地，所述微生物為酵母或者大腸桿菌， 任選地，所述微生物為畢赤酵母或釀酒酵母。
5.一種用于重組微生物的系統，其特征在于，包括: 適于轉化微生物的載體，所述載體上攜帶有異源核酸分子，所述異源核酸分子編碼具有醛還原酶活性的蛋白質。
6.根據權利要求5所述的系統，所述異源核酸編碼下列基因至少一種的表達產物: Escherichia coli adhP、
Escherichia coli adhE、
Escherichia coli yqhD、
Escherichia coli yjgB、Escherichia coli yiaY、
Escherichia coli eutG、
Escherichia coli fucO、
Escherichia coli yd1、
Saccharomyces cerevisiae ADHl、
Saccharomyces cerevisiae ADH2、
Saccharomyces cerevisiae ADH3、
Saccharomyces cerevisiae ADH4、
Saccharomyces cerevisiae ADH5、
Saccharomyces cerevisiae ADH6、
Saccharomyces cerevisiae ADH7、 Saccharomyces kluyveri ADHl、以及 Saccharomyces kluyveri ADH2， 所述具有醛還原酶活性的蛋白質具有如SEQ ID No:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34所示的氨基酸序列， 所述異源核酸分子具有 SEQ ID No:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33所示的核苷酸序列， 所述微生物為選自真核微生物和原核微生物的至少一種， 任選地，所述微生物為選自細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母的至少一種， 任選地，所述微生物為酵母或者大腸桿菌， 任選地，所述微生物為畢赤酵母或釀酒酵母。
7.一種制備重組微生物的方法，其特征在于，利用權利要求5或6所述的系統轉化微生物，以便獲得所述重組微生物。
8.—種生產脂肪醇的方法，其特征在于，包括下列步驟: 利用含有脂肪醛的培養基作為底物，將微生物與所述底物接觸，以便制備得到脂肪醇，其中，所述脂肪醛來自外源加入或者由所述微生物產生，所述脂肪醛的碳原子數至少為8個； 任選地，所述醛還原酶為純化后的蛋白、所述微生物體內自身表達產生的蛋白的至少一種； 任選地，所述微生物為權利要求1-4任一項所述的重組微生物； 任選地，利用包含脂肪醛的培養基培養所述微生物。
9.一種用于生產脂肪醇的系統，其特征在于，包括: 生物反應器，所述生物反應器中設置有權利要求1-4任一項所述的重組微生物和適于所述微生物生長的培養基，以便使所述微生物利用脂肪醛合成脂肪醇；以及分離裝置，所述分離裝置與所述生物反應器相連，用于分離所述脂肪醇， 任選地，所述培養基中包含脂肪醛。
10.一種生產脂肪醇的方法，其特征在于，包括利用醛還原酶對脂肪醛進行還原處理，以便得到脂肪醇，其中，所述脂肪醛的碳原子數為至少8。
【文檔編號】C12M1/00GK104164397SQ201310184420
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2013年5月17日 優先權日:2013年5月17日
【發明者】劉然 申請人:武漢臻智生物科技有限公司