丹頂鶴α干擾素、其編碼基因和在抗病毒中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種丹頂鶴α干擾素、其編碼基因和在抗病毒中的應用。本發明的一種丹頂鶴α干擾素（IFN-α），其特征在于其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示或SEQ?ID?NO.5所示。本發明一方面公開了丹頂鶴IFN-α的核苷酸序列及其編碼的蛋白質序列，另一方面也驗證了克隆得到的丹頂鶴IFN-α在抗病毒，特別是抗水泡性口炎病毒和抗H9N2禽流感病毒中的應用。本發明的提出為丹頂鶴干擾素對其他病毒性疾病的深入研究奠定了基礎，同時也為丹頂鶴干擾素產品的問世提供了理論基礎。
【專利說明】丹頂鶴α干擾素、其編碼基因和在抗病毒中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種干擾素及其應用，特別涉及一種丹頂鶴α干擾素及在抗病毒中的應用，本發明屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]我國是世界上丹頂鶴棲息的主要國家，國家林業局已經把丹頂鶴作為唯一的國鳥候選鳥上報國務院，是國家一級保護動物。近年來，丹頂鶴禽流感、新城疫、皰疹、馬立克病等危害丹頂鶴生存的傳染病時常發生，造成嚴重的損失，因此對這些疾病的防疫與治療是不可忽視的。
[0003]干擾素(interferon，IFN)是在特定誘生劑的作用下由細胞基因組控制產生的一(或多)種蛋白質，具有抗病毒繁殖及免疫調節等生物學功能。干擾素可分為I型、II型和III型。I型干擾素又稱病毒干擾素或白細胞干擾素，包括IFN-α、β、ω、Κ、τ、δ、和ζ等，主要功能是抑制病毒增殖。II型干擾素又稱免疫干擾素，只有IFN-Y —個成員，主要起免疫調節的作用。III型干擾素包括IFN-λ (IL-28/29)。
[0004]迄今為止，哺乳動物的IFN-α的研究(尤其是人和鼠的研究)已取得很多成果，但是禽類的IFN-α的研究起步較晚，只在雞、鴨、鵝、鸚鵡、鷓鴣等物種中有些進展。尚未出現丹頂鶴IFN-a基因的核苷酸序列與它相對應的氨基酸序列的報道。由于還沒有丹頂鶴干擾素的產品問世，大多是使用雞干擾素來代替丹頂鶴干擾素。然而雞和丹頂鶴之間存在種屬差異，其干擾素對丹頂鶴的病毒性疾病的治療效果并不是很好，因而研究丹頂鶴干擾素是有必要的。

【發明內容】

`[0005]本發明所要解決的技術問題之一是提供丹頂鶴a干擾素(IFN-a )基因的核苷酸和相應的氨基酸序列；
[0006]本發明所要解決的技術問題之二是通過將丹頂鶴α干擾素(IFN-a )基因在原核細胞中進行重組表達，從而驗證該蛋白對病毒生長的抑制作用。
[0007]為了達到上述目的，本發明采用的技術手段為:
[0008]克隆丹頂鶴IFN-a全序列的實施方案:
[0009]( I)丹頂鶴基因組DNA的提取；
[0010](2)利用兩對簡并引物 AIF-TYla 和 AIF_TY2b，POAU 和 AIF_TY2b 進行PCR擴增，將PCR產物連接到合適的克隆載體上，轉化到大腸桿菌感受態細胞中，測序獲得丹頂鶴IFN- α基因的部分序列，其中引物AIF-TYla的核苷酸序列為:5’ -CASCRSYACRBCCASCASCTCSAGC-3，，引物POAU的核苷酸序列為:5’-CYRSYSCTCNYGCTCCTYCT-3’，其共同的下游簡并引物AIF_TY2b的核苷酸序列為:5’_AGGMGGACGRGKTCCCASGCGCAG-3’，其中 R=A/G，Y=C/T, M=A/C, K=G/T, S=C/G, B=C/G/T, N=A/C/G/T ；[0011](3)利用染色體步移技術，獲取側翼的未知序列；
[0012](4)通過對擴增序列的拼接獲得丹頂鶴IFN-α的全序列。
[0013]丹頂鶴IFN-α基因功能驗證的實施方案:
[0014](I)PCR擴增丹頂鶴IFN- α的成熟肽基因；
[0015](2)構建重組的原核表達載體轉化到大腸桿菌中，誘導表達干擾素蛋白；
[0016](3)若為包涵體表達，將包涵體蛋白純化，復性；
[0017](4)在細胞上測定復性后的IFN-α對病毒復制的抑制情況來驗證該蛋白的功能。
[0018]在上述研究的基礎上，本發明提出了一種丹頂鶴α干擾素(IFN-a )，其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示(前肽，含有信號肽)或SEQ ID N0.5所示(成熟肽)。
[0019]進一步的，本發明還提出了編碼所述的丹頂鶴α干擾素的核苷酸序列。
[0020]優選的，所述的核苷酸序列為丹頂鶴α干擾素的全基因序列或其編碼區序列，其中，所述的丹頂鶴α干擾素的全基因序列如SEQ ID N0.1所示，所述的編碼區序列如SEQID N0.2 或 SEQ ID N0.6 所示。
[0021]含有所述的核苷酸序列的表達載體以及含有所述的表達載體的宿主細胞也在本發明的保護范圍之內。
[0022]更進一步的，本發明還提出了所述的丹頂鶴α干擾素在制備抗病毒藥物中的應用。其中，優選的，所述的病毒為水泡性口炎病毒或禽流感H9N2病毒。
`[0023]再進一步的，本發明提出了一種抗水泡性口炎病毒的藥物組合物，其特征在于有效成分為本發明的丹頂鶴α干擾素(IFN-a )。及
[0024]一種抗H9N2禽流感病毒的藥物組合物，其特征在于有效成分為權利要求1所述的丹頂鶴Ct干擾素。
[0025]綜上，本發明一方面公開了丹頂鶴IFN-α的核苷酸序列及其編碼的蛋白質序列，同時驗證了該丹頂鶴IFN-α的抗水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)和抗H9N2禽流感病毒的功能，為丹頂鶴干擾素對其他病毒性疾病的深入研究奠定了基礎，為丹頂鶴干擾素產品的問世提供了可能。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為使用簡并引物AIF-TYla和AIF_TY2b PCR擴增IFN-α部分基因的電泳結果圖；
[0027]I道:目的帶；2道:陰性對照；
[0028]圖2為使用簡并引物POAU和AIF_TY2b PCR擴增IFN-α部分基因的電泳結果圖；
[0029]I道:陰性對照；2道:目的帶；
[0030]圖3為IFN- α 5’和3’側翼序列的擴增電泳結果圖；
[0031]I道:3’端第一次擴增產物；2道:3’端第二次擴增產物；3道:3’端第三次擴增產物；4道:5’端第三次擴增產物；5道:5’端第二次擴增產物；6道:5’端第一次擴增產物；
[0032]圖4為IFN- α成熟肽序列的擴增電泳結果圖；
[0033]I道:目的帶；2道:陰性對照；
[0034]圖5為蛋白的SDS-PAGE結果；
[0035]I道:PET32a空載誘導后；2道:重組菌誘導前；3道:重組菌全菌體；4道:超聲后沉淀；5道:超聲后上清；
[0036]圖6為重組IFN- α對VSV病毒的抑制試驗的顯微鏡觀察圖；
[0037]A:病毒對照組；Β:實驗組；C:陰性對照-細胞對照組；
[0038]圖7為不同濃度的IFN- α對VSV的抑制情況的統計圖；
[0039]橫軸:IFN的不同濃度縱軸:IFN對VSV的抑制率；
[0040]圖8為重組IFN- α對Η9Ν2病毒的抑制試驗的顯微鏡觀察圖；
[0041]A:病毒對照組；Β:實驗組；C:陰性對照-細胞對照組；
[0042]圖9為不同濃度的IFN- α對Η9Ν2的抑制情況的統計圖。
[0043]橫軸:IFN的不同濃度縱軸:IFN對H9N2的抑制率。
【具體實施方式】
[0044]下面結合附圖和具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0045]實施例1丹頂鶴IFN-α基因的部分序列的擴增
[0046]1、按照禽類血液基因組DNA的簡單快速提取方法，從丹頂鶴的血液中提取基因組DNA ；`
[0047]2、以丹頂鶴基因組DNA為模板，簡并引物AIF-TYla和AIF_TY2b為引物，PCR擴增IFN- α 基因，其中引物 AIF-TYla 的核苷酸序列為:5’-CASCRSYACRBCCASCASCTCSAGC-3’，弓丨物 AIF-TY2b 的核苷酸序列為:5’-AGGMGGACGRGKTCCCASGCGCAG-3’，其中 R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T, S=C/G, B=C/G/T ;反應體系和反應條件如下所示:
[0048]PCR反應體系:
[0049]
基因組DNALOpL
IOx PCR Buffer5.0pL
dNTP ( 2.5mM )4%L
AIF- TYla ( ΙΟμΜ)4.0pL
AIF- TY2b ( ΙΟμΜ)2.5μι
rTaq ( 5U/^iL )0.5μι,
ddH20補足至50pL
[0050]反應條件:94°C預變性8min ;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30個循環；72°C終延伸10min，4°C終止反應。PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠電泳的結果如圖1所示。[0051 ] 回收目的片段，將膠回收產物連入PMD19-T載體，16°C連接5h后，轉化到大腸桿菌DH5a感受態細胞中，37°C培養12h。
[0052]挑取單克隆菌落，經菌液PCR鑒定(AIF-TYla和AIF_TY2b為引物)陽性后送北京六合華大基因科技股份有限公司測序獲得部分(167bp)丹頂鶴IFN-α基因。[0053]實施例2丹頂鶴IFN- α基因的部分序列的擴增
[0054]1、以丹頂鶴基因組DNA為模板，簡并引物POAU和AIF_TY2b為引物，PCR擴增IFN- α基因，其中引物POAU的核苷酸序列為:5’ -CYRSYSCTCNYGCTCCTYCT-3’，引物AIF-TY2b 的核苷酸序列為:5’-AGGMGGACGRGKTCCCASGCGCAG-3’，其中 R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T, S=C/G, B=C/G/T, N=A/C/G/T ；
[0055]反應體系和反應條件如下所示:
[0056]PCR反應體系:
【權利要求】
1.丹頂鶴a干擾素(IFN-a)，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示或SEQID N0.5 所示。
2.編碼權利要求1所述的丹頂鶴a干擾素的核苷酸序列。
3.如權利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列為丹頂鶴a干擾素的全基因序列或其編碼區序列，其中，所述的丹頂鶴a干擾素的全基因序列如SEQ ID N0.1所示，所述的編碼區序列如SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.6所示。
4.一種表達載體,其特征在于含有權利要求2或3所述的核苷酸序列。
5.一種宿主細胞，其特征在于含有權利要求4所述的表達載體。
6.權利要求1所述的丹頂鶴a干擾素在制備抗病毒藥物中的應用。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述的病毒為水泡性口炎病毒或H9N2禽流感病毒。
8.一種抗水泡性口炎病毒的藥物組合物，其特征在于有效成分為權利要求1所述的丹頂鶴a干擾素。
9.一種抗H9N2禽流感病毒的藥物組合物，其特征在于有效成分為權利要求1所述的丹頂鶴a干 擾素。
【文檔編號】C12N15/21GK103804485SQ201410001296
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月2日 優先權日:2014年1月2日
【發明者】邢明偉 申請人:東北林業大學