一種(3r,5r)-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯的生物制備方法
【專利摘要】本發(fā)明實(shí)施例提供了一種(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯的生物制備方法，屬于生物制藥領(lǐng)域。其制備方法為：在鹽酸三乙醇胺緩沖溶液中，以(5R)-6-氯-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯為原料，在重組酮還原酶及葡萄糖脫氫酶的復(fù)合酶、脫鹵酶、輔因子和葡萄糖作用下，用氰化試劑維持pH值在6～8，室溫下反應(yīng)得到(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯。本發(fā)明提供的制備方法以(5R)-6-氯-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯為原料，在重組酮還原酶及葡萄糖脫氫酶的復(fù)合酶、脫鹵酶的催化下，“一鍋法”完成還原反應(yīng)和氰基取代反應(yīng)得到產(chǎn)物，過程簡單且生產(chǎn)成本低。
【專利說明】—種(3R, 5R)-6-氰基-3, 5-二羥基己酸叔丁酯的生物制備
方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及阿伐他汀中間體(3R，5R)-6-氰基-3，5_二羥基己酸叔丁酯的生物制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]他汀類藥物通過抑制膽固醇合成途徑的HMG-CoA還原酶，降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平，對以膽固醇升高為主的高脂血癥有較好的療效，是目前臨床上應(yīng)用廣泛的血脂調(diào)節(jié)藥物。阿伐他汀(Atorvastatin)由于其具有起效快、降脂作用強(qiáng)、作用時間長等優(yōu)點(diǎn)，成為全新第三代、全合成、高純化、高選擇性的HMG-CoA還原酶抑制劑，是目前最有市場前景的他汀類藥物。而(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羥基己酸叔丁酯是阿伐他汀的最為重要的中間體，因而，開展對(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羥基己酸叔丁酯的合成改進(jìn)，對阿伐他汀制備方法的研究具有十分重要的作用。
[0003](3R, 5R)-6-氰基_3，5_ 二羥基己酸叔丁酯是合成阿伐他汀側(cè)鏈的重要的中間體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為:
【權(quán)利要求】
1.一種(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羥基己酸叔丁酯的生物制備方法，其特征在于，在鹽酸三乙醇胺緩沖溶液中，以(5R)-6-氯-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯為原料，在重組酮還原酶及葡萄糖脫氫酶的復(fù)合酶、脫鹵酶、輔因子和葡萄糖作用下，用氰化試劑維持PH值在6~8，室溫下反應(yīng)得到(31?，51?)-6-氰基-3，5-二羥基己酸叔丁酯；在起始時的反應(yīng)體系中，所述復(fù)合酶、脫鹵酶、輔因子、葡萄糖和(5R)-6-氯-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯的質(zhì)量比為0.01 ~0.02: 0.01 ~0.02:0.0005 ~0.002:1 ~2:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物制備方法，其特征在于，所述重組酮還原酶及葡萄糖脫氫酶的復(fù)合酶的制備方法為:將攜帶酮還原酶基因和葡萄糖脫氫酶基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含氨芐青霉素和卡拉霉素雙抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于35~40°C下?lián)u床活化8~12小時，將活化后得到的培養(yǎng)物接種到含氨芐青霉素和卡拉霉素雙抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于35~40°C下?lián)u床擴(kuò)大培養(yǎng)，至OD6tltl值達(dá)到0.8~I時，加入誘導(dǎo)劑，于35~40°C下繼續(xù)培養(yǎng)4~8小時，離心，收集沉淀物，加入鹽酸三乙醇胺緩沖液得懸浮液，將懸浮液置于冰水浴中超聲破壁10~20分鐘，再離心，將上清液預(yù)凍至溫度降至-15~-25°C，然后再冷凍干燥24~48小時，即得所述重組酮還原酶和葡萄糖脫氫酶的復(fù)合酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物制備方法，其特征在于，所述脫鹵酶的制備方法為:將攜帶脫鹵酶基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于35~40°C下?lián)u床活化8~12小時，將活化后得到的培養(yǎng)物接種到含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于35~40°C下?lián)u床擴(kuò)大培養(yǎng)，至OD6tltl值達(dá)到0.8~I時，加入誘導(dǎo)劑，于35~40°C下繼續(xù)培養(yǎng)4~8小時，離心，收集沉淀物，加入鹽酸三乙醇胺緩沖液得懸浮液，將懸浮液置于冰水浴中超聲破壁10~20分鐘，再離心，將上清液預(yù)凍至溫度降至-15~-25°C，然后再冷凍干燥24~48小時，即得所述狀脫鹵酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或者3所述的生物制備方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)劑為異丙基-β -D-硫代半乳糖苷。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的生物制備方法，其特征在于，所述鹽酸三乙醇胺緩沖液的濃度為0.05Μ~0.15Μ。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物制備方法，其特征在于，所述(5R)-6-氯-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯與鹽酸三乙醇胺緩沖溶液的質(zhì)量體積比為150-300mg/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物制備方法，其特征在于，所述輔因子為NAD/NADH或NADP/NADPHo
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物制備方法，其特征在于，所述氰化試劑為氰化鈉溶液或氰化鉀溶液，其質(zhì)量濃度為10~30%。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物制備方法，其特征在于，其制備方法具體為:在鹽酸三乙醇胺緩沖溶液中依次加入重組酮還原酶及葡萄糖脫氫酶的復(fù)合酶、脫齒酶、輔因子、葡萄糖和(5R) -6-氯-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯，攪拌均勻，用氰化鈉溶液或氰化鉀溶液維持pH值在6~8，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，反應(yīng)完成后加入乙酸乙酯進(jìn)行多次萃取，合并有機(jī)相并減壓蒸去溶劑，即得所述(3R，5R) -6-氰基-3，5- 二羥基己酸叔丁酯。
【文檔編號】C12P13/00GK103695486SQ201410001100
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月3日
【發(fā)明者】張龑, 熊進(jìn)軍, 葛石平 申請人:黃岡華陽藥業(yè)有限公司, 黃岡師范學(xué)院