來源于四膜蟲的TpyArsM蛋白及其編碼基因和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種來源于四膜蟲的TpyArsM蛋白及其編碼基因和應用。本發明提供的蛋白質為如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；（b）將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質。本發明提供的TpyarsM基因具有以下優點：（1）對無機砷的脅迫響應靈敏；（2）在四膜蟲細胞內行使的功能是將強毒性的無機砷轉化為低毒性的有機砷；（3）具有高效轉化無機砷的功能；（4）能將水體中的無機砷控制在食物鏈底端；（5）不污染環境。
【專利說明】來源于四膜蟲的TpyArsM蛋白及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種來源于四膜蟲的TpyArsM蛋白及其編碼基因和應用。
【背景技術】
[0002]砷在自然界中廣泛存在，其中以五價砷(五氧化二砷)和三價砷(三氧化二砷，俗稱砒霜)為主的無機砷最為常見。已有研究表明，人類活動(如礦物挖掘和工業生產等過程)產生的無機砷會通過地表徑流方式進入水體，隨即通過胞飲和吞食在藻類、浮游動物等低等水生生物體內累積，經過食物鏈和食物網的運輸，無機砷最后在高等生物體內蓄積，對野生動物、甚至人類造成嚴重的危害(包括皮膚癌、肺癌、自發流產、胃穿孔、烏腳病、兒童神經系統發育受損等)，慢性砷中毒已經成為危害人類健康的世界性問題。 [0003]五價砷(As (V))進入生物體后會首先被砷酸鹽還原酶和/或谷胱甘肽還原成三價砷(As (III))，盡管后者具有更加強烈的毒性，但卻是許多生物體中砷被代謝解毒的主要作用對象。強毒性的三價無機砷(As (III))在體內可被甲基轉移酶進一步催化后轉化為低毒性的有機砷，依次為單甲基砷(monomethylarsenate, MMA)、二甲基亞砷酸(dimethylarsenate, DMA)、三甲基亞砷酸(trimethylarsenite, TMA)以及三甲基砷酸酯(trimethylarsenate, TMAO)等有機砷產物,這是生物體內砷的解毒途徑之一。
[0004]目前海水中的砷濃度穩定在0.5-2 μ g/L，淡水中的砷濃度依人類活動情況而定。但在部分地區，砷已嚴重危害人類健康，如孟加拉三角洲和中國分別有約3.6億和2億人口受到飲用水中砷含量超標的危害，此外，中國南方及部分東南亞地區以水稻為主食的人們還在食用砷富集的大米。所以，環境中的砷對人類健康存在嚴重的威脅，而采取一定的技術手段將環境中的砷進行高效轉化，對于保護生態環境和保障人類健康具有非常重要的意義。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種來源于四膜蟲的TpyArsM蛋白及其編碼基因和應用。
[0006]本發明提供的一種蛋白質，來源于梨形四膜蟲，命名為TpyArsM蛋白，為如下(a)或(b):(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白質。
[0007]為了使(a)中的蛋白質便于純化，可在由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。
[0008]表1標簽的序列
[0009]
標簽殘基序列
Poly-Arg5-6 (通常為 5 個) RRRRR
【權利要求】
1.一種蛋白質，為如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白質的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因為如下I)或2)或3)或4)的DNA分子: 1)編碼區如序列表中序列2自5’末端第1407-2360位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表的序列2所不的DNA分子； 3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子; 4)與I)或2)限定的D NA序列具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述基因的表達盒、重組載體、轉基因細胞系或重組菌。
5.權利要求1所述蛋白質在參與將四膜蟲中的砷轉化過程中的應用。
6.一種培育對砷的耐逆性降低的轉基因四膜蟲的方法，包括如下步驟:抑制四膜蟲中權利要求2或3所述基因的表達，得到對砷的耐逆性降低的轉基因四膜蟲。
7.一種培育砷轉化能力降低或喪失的轉基因四膜蟲的方法，包括如下步驟:抑制四膜蟲中權利要求2或3所述基因的表達，得到砷轉化能力降低或喪失的轉基因四膜蟲。
8.—種DNA分子，自上游至下游依次包括同源臂甲和同源臂乙；所述同源臂甲如序列表的序列3自5’末端第9-1401位核苷酸所示，所述同源臂乙如序列表的序列3自5’末端第3466-4827位核苷酸所示。
9.一種培育對砷的耐逆性增加的轉基因四膜蟲的方法，包括如下步驟:在四膜蟲中過表達權利要求2或3所述基因，得到對砷的耐逆性增強的轉基因四膜蟲。
10.一種培育砷轉化能力增加的轉基因四膜蟲的方法，包括如下步驟:在四膜蟲中過表達權利要求2或3所述基因，得到砷轉化能力增強的轉基因四膜蟲。
【文檔編號】C12N1/15GK103739695SQ201410001904
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月2日 優先權日:2014年1月2日
【發明者】繆煒, 朱永官, 袁冬霞, 葉軍, 熊杰, 暢悅 申請人:中國科學院水生生物研究所, 中國科學院城市環境研究所