一種來源于釀酒酵母的冷休克蛋白基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明將一種來源于釀酒酵母的冷休克蛋白基因TIR2轉入植物并使得這種轉基因植物能夠具備增加植物抗寒性的作用。所述冷休克蛋白基因TIR2含756個堿基，編碼的氨基酸251個；所述基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO?1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?NO?2所示。本發明中來源于釀酒酵母的冷休克蛋白基因采用人工方法合成，轉基因植物具備較高的抗寒性。
【專利說明】一種來源于釀酒酵母的冷休克蛋白基因及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于作物遺傳育種領域，具體涉及一種來源于釀酒酵母的冷休克蛋白基因的序列，利用農桿菌將該基因轉化到植物中，使植物抗凍能力得到提高。
【背景技術】
[0002]植物對環境變遷及不良環境有足夠的適應性和抵抗能力，這種抗逆性既受系統進化的遺傳基因型所控制，又受系統發育中生理生態因素所制約。逆境會誘導植物表達大量的特異蛋白，不同的逆境誘導表達的蛋白不完全相同，既有交叉又有差別，而同一種逆境在同一種植物的不同部位所誘導表達的蛋白也不完全相同，在不同的植物物種中這些蛋白的合成差別就更大(Kasuga et al., Nature Biotechnol.，1999，17:287-291)。因此有很多的蛋白參與了植物對非生物逆境的反應，它們協同作用來調整植物生理代謝的變化，從而提高植物對非生物逆境的適應性，可見植物對非生物逆境的抵抗是體內的系統反應，并不是由一個兩個功能基因就能完成的(Urrutia et al., Biochem.Biophy.Acta., 1992,1121 =199-206)。逆境脅迫導致植物體內產生多方面的變化:如抗逆基因的表達，新蛋白質的合成，代謝的轉變，抗逆境物質的積累，氣孔的關閉，光合作用的降低等(Smirnoff, Curr.0pin.Biotech.， 1998,9:214-219)。
[0003]人們就逆境對植物影響的認識和研究，首先是從表觀生理指標一般性描述開始，其次研究植物在各種逆境下產生的生理生化、生態變化和生理調節機制，最后發展到分子水平，進一步探討植物對不同逆境的感應、信號傳導、基因表達與調控、蛋白質組裝和細胞膜功能獲得。為更深入了解植物對不同逆境響應的分子機理和研究人工調控的生物技術等方面展示出良好前景。
[0004]溫度作為重要的環境因子之一，限制植物的分布、生長和產量(Viswanathan etal., Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol Sc1.,2002,357(1423):877-886)。在研究中人們發現植物在長期的進化中發展·了許多對溫度逆境的適應能力。但目前對植物這種冷適應的機理還不是十分清楚，因此探索植物抗寒性的遺傳機理不僅在基礎理論上具有重要意義，在解決生產實際問題上也具有廣泛的應用價值。
[0005]本項發明利用PTDS法合成了來源于釀酒酵母的冷休克蛋白TIR2基因，將該基因轉化擬南芥，進而提高了轉基因擬南芥的抗凍能力，該類基因對于培育植物抗低溫的植物品種非常重要，具有重要的理論意義和現實意義。

【發明內容】

[0006]本發明所要解決的技術問題在于將一種來源于釀酒酵母的冷休克蛋白TIR2基因轉入植物體內，并對該轉基因植物進行功能驗證，以證明它具有提高植物的抗凍性的功能。
[0007]一種來源于釀酒酵母的冷休克蛋白TIR2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
[0008]所述來源于釀酒酵母的冷休克蛋白TIR2基因長756bp，編碼的氨基酸251個。[0009]所述來源于釀酒酵母的冷休克蛋白TIR2基因通過農桿菌介導轉入擬南芥，應用于植物抗凍性。
[0010]所述來源于短桿菌的丙烯酰胺降解酶基因采用人工方法合成，具體包括以下步驟:
[0011 ] I)冷休克蛋白TIR2的人工合成
[0012]依照PTDS(PCR-basedtwo-step DNA synthesis,PTDS)方法進行源自短桿菌的丙烯酰胺降解酶基因進行化學合成，在保持TIR2基因的氨基酸序列不變的基礎上，設計引物合成了冷休克蛋白TIR2基因。
[0013]2)TIR2農桿菌雙元載體的構建
[0014]TIR2基因植物雙元載體在pcAMBIA-1301載體的基礎上構建而成，在pCAMBIA-1301載體的多克隆位點處插入兩端附加了煙草的染色質附著SAR序列的外源基因的表達單兀，這有利于轉基因的穩定遺傳；在外源基因的表達單兀內，我們在目的基因的兩側導入了 BamHI和Sacl酶切位點，便于外源基因的插入，外源基因的表達由雙CAMV355啟動子+TMV omega leader sequence 控制
[0015]3)電擊法轉化農桿菌
[0016]參照MicroPulser? Electroporation Apparatus Operating Instructions andApplication Guide (BIO-RAD公司)制備農桿菌GV3101感受態.并且將構建好的農桿菌雙元載體經電擊法轉入到農桿菌中。
[0017]4)農桿菌介導轉化擬南芥
[0018]利用蘸花法將構建好的農桿菌`轉入擬南芥體內.首先將擬南芥的花苔浸入滲透液中，輕輕攪動約3~5秒后取出，全部轉化完畢后，托盤中加入PNS營養液，以黑色塑料袋套盆封口，保持濕潤環境，置于22°C培養室，低光強度下生長24小時，即可正常培養。生長約兩個月后，收集種子，4 V冰箱貯存待用。
[0019]5)擬南芥轉化植株種子的篩選
[0020]將得到的種子進行篩選，包括⑶S組織化學染色分析和轉基因陽性植株的PCR檢測得到轉入TIR2基因的擬南芥。
[0021]6)轉基因擬南芥抗凍性驗證
[0022]將轉化植物自交純合3代，獲得純合轉化株，收取種子。播種后，在22°C生長兩個星期。然后將野生型和轉基因培養皿小苗用于低溫抗性實驗。將野生型和轉基因培養皿小苗在4°C冰箱下培養48小時，然后放到_20°C冷凍30min，然后再放回4°C冰箱放置過夜恢復，第二天再放回培養室恢復培養。結果表明，野生型和轉基因擬南芥培養皿小苗的存活率有很大的差異。
[0023]本發明實現的有益.效果
[0024]本發明采用PTDS法合成了來源于釀酒酵母的冷休克蛋白TIR2基因，為了進一步分析該基因在低溫逆境中的作用與功能，我們比較了轉TIR2基因的擬南芥植株和野生型擬南芥植株對低溫脅迫的耐受性。結果表明，野生型和轉TIR2基因擬南芥植株在存活率上有很大的差異，轉基因植株比野生型擬南芥有明顯的抗凍能力，這也表明TIR2的轉入提高了擬南芥植株的抗低溫的能力。【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1是用于擬南芥轉化的植物表達載體示意圖。
[0026]圖2是獲得的轉TIR2基因擬南芥的GUS染色圖。
[0027]圖3是轉TIR2基因擬南芥與野生型擬南芥的抗凍表型圖。
【具體實施方式】
[0028]以下結合附圖詳細描述本發明的技術方案。應當說明的是，所述實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍中。
[0029]本發明所用的試驗材料及其來源包括:
[0030]野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana)生態型擬南芥Columbia, 23°C人工氣候室培養，16h光照培養。
[0031]克隆載體pMD-18-Simple T、各類限制性內切酶、Taq聚合酶、連接酶、dNTP、10XPCR buffer和DNA marker購自寶生物工程大連有限公司。所有的化學試劑都從美國西格瑪化學公司和上海國藥化學試劑購買。ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA測序試劑盒購自美國應用系統公司。
[0032]本發明所用的試劑若未明確指明，則均購自西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)。
[0033]本發明涉及分子生物學實驗，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》一書(J.薩姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科學出版社。)
[0034]實施例1
[0035]釀酒酵母TIR2基因的人工合成
[0036]根據Genbank登錄的釀酒酵母TIR2基因序列(Genbank N0.Z74918)，用以基因合成方法【Nucleic Acids Research, 2004, 32, e98],在不改變RhlA和RhlB亞基基因編碼的氨基酸序列的前提下，按以下原則進行合成基因編碼區的設計:(一)優化基因密碼子，提高基因翻譯效率。(二)消除基因內部的常用限制性內切酶的識別位點，便于表達盒構建。(三)消除逆向重復序列、莖環結構和轉錄終止信號，使基因內部的GC/AT均衡，提高RNA的穩定性。(四)使基因編碼蛋白符合N端原則(Tobias 1991)，以提高翻譯蛋白的穩定性。(五)設計提聞基因5’端的自由能，以提聞基因翻譯起始效率。
[0037]擴增條件為:94°C預熱Imin ;94°C，30s，50°C，30s，72°C，2min，使用的 Taq DNA 聚合酶為KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，共25個循環。
[0038]PCR結束后，I %瓊脂糖膠回收，取10 μ I直接與T/A克隆載體相連(大連寶生物公司)。4°C連接過夜，高效轉化DH5a感受態中。獲得陽性克隆。
[0039]實施例2
[0040]TIR2農桿菌雙元載體的構建
[0041]上述人工合成的TIR2基因的陽性克隆用引物SPl基因ORF經PCR擴增后頭尾分別加入Bam HI和Sac I切點，經Bam HI+Sac I雙酶切，回收DNA片段與相應酶切的載體相連，經酶切鑒定和測序后得到正確的雙元載體(見圖1)。
[0042]實施例3[0043]電擊法轉化農桿菌
[0044]I)制備農桿菌GV3101感受態，方法參照MicroPulser?ElectroporationApparatus Operating Instructions and Application Guide(BIO-RAD公司)((Raineri et al.，Bi0.Tech.，1990,8:33-38)。
[0045]2)取50 μ L GV3101感受態細胞，加入I μ L DNA,轉入0.2cm電擊杯轉化(400 Ω，
2.5KV，25 μ f)。加入ImL含有I %甘露醇的LB培養基恢復培養2小時(28°C，250rpm)。分別取10 μ L、100 μ L涂LB平板(利福平50 μ g/mL,慶大霉素50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/mL)。
[0046]3)挑取幾個克隆，堿法抽提農桿菌質粒，酶切鑒定，PCR檢測。
[0047]實施例4
[0048]農桿菌介導轉化擬南芥
[0049]A擬南芥的培養
[0050]I)擬南芥種子在4°C進行2-3天的春化處理，目的是有利于種子的一致萌發和花期的提前。
[0051]2)將蛭石、黑土、珍珠巖按9: 3: 0.5的比例拌勻，經高溫滅菌后裝于IOcm的塑料小盆，以營養液PNS浸 濕待用。
[0052]3)以牙簽將擬南芥種子點播于濕潤的基質上，保鮮膜封口。放置于22°C暗培養2-3天，待種子萌發后，揭開保鮮膜，置于22°C培養室中進行16小時光照培養。
[0053]4)擬南芥抽苔后及抽苔后兩周以及轉化后需再以PNS營養液浸濕一次。中途可視情況適當澆水。首次抽苔后需剪去初生苔，利于次生苔的生長，當次生苔長至2-lOcm(少數已經開花)可用于轉化(何玉科，鞏振輝，細跑生物學雜志，1991，13(3):97-101)。
[0054]B農桿菌的準備
[0055]I)挑取農桿菌單菌接種于5mL LB液體培養基(利福平50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/mL)中，28°C，250rpm 培養 20 小時。(Rashid et al., 1996)
[0056]2)取ImL菌液轉接入20_30mL LB液體培養基(利福平50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/mL)中，28°C，250rpm 培養約 12 小時，測 0D600 ~1.5。
[0057]3)8000rpm，4°C，10min離心收集菌體，重懸于農桿菌轉化滲透液(5%蔗糖，
0.05% Silwet L-77)并稀釋至 0D600 ~0.8。
[0058]C擬南芥蘸花法轉化
[0059]I)將擬南芥的花苔浸入滲透液中，輕輕攪動約3~5秒后取出，全部轉化完畢后，托盤中加入PNS營養液，以黑色塑料袋套盆封口，保持濕潤環境，置于22°C培養室低光強度下生長24小時，即可正常培養。
[0060]2)初次轉化四天后，可再進行一次轉化，重復兩次，總共轉化三次，這樣可以在花發育的不同時期進行轉化，提高轉化效率。
[0061]3)生長約兩個月后，收集種子，4°C冰箱貯存待用。
[0062]實施例5
[0063]擬南芥轉化植株種子的篩選
[0064]I)稱25_30mg種子放入1.5mL離心管。
[0065]2)乙醇消毒Imin (不停搖晃振蕩)，8000rpm離心5秒,去上清。
[0066]3)加入ImL過濾后的漂白粉消毒15min (不停搖晃振蕩,充分消毒)，8000rpm離心5秒,去上清。
[0067]4)無菌水洗滌3-4次。
[0068]5)將種子均勻的播撒到1/2MS平板(Hyg 50 μ g/mL)上，ParafiIm膜封口，4°C冰箱放置兩天，220C，16小時光照培養6天。
[0069]6)將抗性植株移栽到盆中培養，苗稍大后，進行GUS活性檢測，選出陽性植株(Tl)繼續培養，并收集種子進行T2代和T3代篩選。
[0070]實施例6
[0071]轉基因陽性植株的檢測
[0072]按Jefferson (1978)的方法，將待測擬南芥葉片樣品與X-Gluc染色反應液(50mmol/L NaH2P04, ρΗ7.0 ;0.5m mol/L Κ4 [Fe (CN) 6]，0.1% Triton Χ-100，20% 甲醇，0.5mg/mL X-Gluc[X-glucuronide])于37°C保溫2-4小時后，用75%乙醇脫色觀察(見圖2)。
[0073]實施例7
[0074]釀酒酵母TIR2基因轉化植物后的抗凍分析 [0075](一 )試驗方法:
[0076]將轉化植物自交純合3代，獲得純合轉化株，收取種子。播種后，在22°C生長兩個星期。然后將野生型和轉基因培養皿小苗用于低溫抗性實驗。將野生型和轉基因培養皿小苗在4°C冰箱下培養48小時，然后放到_20°C冷凍30min，然后再放回4°C冰箱放置過夜恢復，第二天再放回培養室恢復培養。結果表明，野生型和轉基因擬南芥培養皿小苗的存活率有很大的差異。
[0077]( 二)試驗結果:
[0078]經過抗凍處理的轉基因與野生型擬南芥的表型差異如圖3所示。
【權利要求】
1.一種來源于釀酒酵母的冷休克蛋白基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO I所示。
2.根據權利要求1所述的來源于釀酒酵母的冷休克蛋白基因，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.權利要求1或2所述的來源于釀酒酵母的冷休克蛋白基因采用人工方法制備而成。
4.權利要求1或2所述的來源于釀酒酵母的冷休克蛋白基因采用農桿菌蘸花法轉化擬南芥。
5.權利要求1或2所述的來源于來源于釀酒酵母的冷休克蛋白基因植物抗寒性中的應用。
【文檔編號】C12N15/10GK103789326SQ201210440002
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年10月29日 優先權日:2012年10月29日
【發明者】周惠, 苗輝, 蔣海燕, 張楊, 蔣小輝 申請人:無錫柏歐美地生物科技有限公司