一種具有抗氧化活性的合浦珠母貝肉抗氧化肽序列及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有抗氧化活性的合浦珠母貝肉抗氧化肽序列，其特征是：其氨基酸序列如SEQ?ID?No：1所示。還公開了上述具有抗氧化活性的合浦珠母貝肉抗氧化肽序列在制備具有抗氧化活性作用的食品、保健食品、化妝品、藥物或飼料中的應用。本發明首次確認從合浦珠母貝肉中提取到抗氧化肽的結構序列，并通過合成同一序列肽，進一步證明該序列的肽確實是具有抗氧化活性，從而為其在食品行業及日化行業的應用奠定基礎，當天然原料提取效率低，工藝復雜，成本高時，也可通過人工合成的方式得到該抗氧化肽，并應用于產業。
【專利說明】一種具有抗氧化活性的合浦珠母貝肉抗氧化肽序列及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于多肽【技術領域】，涉及一種具有抗氧化活性的合浦珠母貝肉抗氧化肽序列及其應用。
【背景技術】
[0002]珍珠貝的種類很多，有珍珠貝、大珍珠貝、合浦珠母貝、企鵝珍珠貝等，其中以合浦珠母貝最普通，是世界上生產養殖珍珠的主要貝種。我國海南、廣東、廣西等省合浦珠母貝資源豐富，是南海主要的近海養殖“南珠”的母貝，每年采珠后珠母貝肉達幾千噸，由于其風味問題而較少用于冷鮮食品。珍珠具有抗氧化，防衰老美白的功效，也有學者發現合浦珠母貝肉含有豐富的優質蛋白和不飽和脂肪酸，其不同酶的酶解液具有降血壓、解離鎘金屬離子、抗疲勞和抗氧化等作用。與在市面上用于食品、藥品以及化妝品和飼料的工業合成的添加劑相比，其安全性和效用都很高，使之成為當前國際的熱門研究課題。
[0003]抗氧化肽具有延緩機體衰老的功能活性，不僅能夠清除體內的自由基，減輕自由基對機體的損傷，而且能夠防止紫外線引起的線粒體的損傷和自由基誘導的脂質過氧化，抗氧化肽還能夠為抗氧化酶提供氫和螯合金屬離子。天然抗氧化劑在醫藥、化妝品、保健品和食品與飼料添加劑等方面應用前景廣闊，篩選具有強抗氧化活性的天然資源已成為食品科學、生物學、醫學等研究的新趨勢。而從合浦珠母貝肉中獲得具有抗氧化活性的抗氧化肽序列，對其今后的開發應用具有廣泛的意義。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在于提供一種具有抗氧化活性的合浦珠母貝肉抗氧化肽序列，該序列具有抗氧化功能。
·[0005]本發明的目的還在于提供上述具有抗氧化活性的合浦珠母貝肉抗氧化肽序列在制備具有抗氧化活性作用的食品、保健食品、化妝品、藥物或飼料中的應用。
[0006]本發明的第一個目的是通過如下技術手段來實現的:一種具有抗氧化活性的合浦珠母貝肉抗氧化肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID No:l所示。
[0007]本發明可以通過微波輔助酶解法制備獲得該具有抗氧化活性的合浦珠母貝肉抗氧化肽序列，具體的制備過程如下:選取合浦珠母貝貝肉，采用微波輔助Alcalase2.4L蛋白酶酶解提取，得酶解液，將酶解液經脫鹽和分離純化處理，收集分子量在800~1200Da之間的分離液，得到的肽液即為具有抗氧化活性的合浦珠母貝肉抗氧化肽序列。
[0008]其中微波輔助Alcalase2.4L蛋白酶酶解提取時，微波溫度優選為55~62°C，微波功率優選為280~300W，微波時間優選為15~20min，加酶量優選為在Ig合浦珠母貝貝肉中加入4500~5500u的Alcalase2.4L蛋白酶，微波處理后繼續在55~62°C下再水浴1.2 ~2h。
[0009]較佳的條件為微波溫度為58°C，微波功率300W，微波時間為17min，加酶量為在Ig合浦珠母貝貝肉中加入5000u的Alcalase2.4L蛋白酶，微波處理后繼續在58°C下再水浴1.5h。
[0010]酶解液脫鹽處理時優選采用C18柱。也可以用其他脫鹽方式，此步驟的目的是脫除酶解液中的鹽。
[0011]酶解液分離純化處理時優選采用交聯葡聚糖Sephadex G_25層析柱進行分離純化。
[0012]經過RP-HPLC、MALD1-TOF-TOF 二級質譜分析和氨基酸組成分析發現，本發明制備獲得的上述肽液中所含的主肽段分子量為1039.56Da，分析該肽的序列為=Gly-Ala-Gly-Leu-Pro—Gly—Lys—Arg-Glu—Argο [0013]因此，本發明 申請人:又嘗試性的采用人工方式合成上述序列的具有抗氧化活性的合浦珠母貝肉抗氧化肽序列，經還原力、DPPH自由基、OH自由基以及超氧陰離子清除能力分析發現，該人工合成的合浦珠母貝肉抗氧化肽序列也具有抗氧化性，因此，在從天然原料合浦珠母貝肉中提取效率較低，提取成本較高等的情況下，可以采用人工合成該合浦珠母貝肉抗氧化肽序列，從而可以在工業上大規模應用。
[0014]本發明人工合成合浦珠母貝肉抗氧化肽序列采用Fmoc固相合成法，合成原理為先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價鍵的結構同一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以此結合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經過脫去氨基保護基并同過量的活化羧基組分反應，接長肽鏈；重復(縮合一洗滌一去保護一中和及洗滌一下一輪縮合)操作，達到所要合成的肽鏈長度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經過純化等處理，即得所要的多肽。
[0015]本發明人工合成合浦珠母貝肉抗氧化肽序列Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg中采用的樹脂為王樹脂，反應過程為選取氨基酸原料，在縮合劑、堿試劑以及DMF反應溶劑作用下，進行反應，反應過程中，采用樹脂和Kaiser試劑進行產物的純度檢測至反應完全，獲得高純度的Gly-Ala產品，然后把Gly-Ala產品溶于切割試劑中進行切割，獲得Gly-Ala的粗品；根據要合成多肽的序列，依次合成下一個氨基酸，重復反應步驟、純度檢測和切割操作等過程，即合成得合浦珠母貝肉抗氧化肽序列Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg0
[0016]本發明具有如下優點:
[0017](I)本發明從合浦珠母貝貝肉中提取的合浦珠母貝肉抗氧化肽序列以及人工合成的合浦珠母貝肉抗氧化肽序列，經還原力、DPPH自由基、OH自由基以及超氧陰離子清除能力分析發現:對DPPH以及OH自由基的清除能力，合成肽的IC5tl值約為天然提取肽的3~4倍，兩者的還原力以及對02_清除率的IC5tl值相近，與Vc、BHT等比較從表1可見，除了還原力外，清除DPPH、OH自由基的清除能力和(V的IC5tl的能力均比Ne、BHT高；
[0018](2)本發明首次確認從合浦珠母貝肉中提取到抗氧化肽的結構序列，并通過合成同一序列肽，進一步證明該序列的肽確實是具有抗氧化活性，從而為其在食品行業及日化行業的應用奠定基礎，當天然原料提取效率低，工藝復雜，成本高時，也可通過人工合成的方式得到該抗氧化肽，并應用于產業。
【專利附圖】

【附圖說明】[0019]圖1是實施例1中合浦珠母貝肉分離到的肽液的液相分析圖；
[0020]圖2是實施例1中合浦珠母貝肉分離到的肽液的MALD1-T0F-T0F —級質譜圖；
[0021]圖3是實施例1中合浦珠母貝肉分離到的肽液的紅外光譜圖；
[0022]圖4是實施例2中人工合成合浦珠母貝肉抗氧化肽序列的液相分析圖；
[0023]圖5是實施例2中人工合成合浦珠母貝肉抗氧化肽序列的ESI質譜圖。
【具體實施方式】
[0024]實施例1
[0025]本實施例提供的具有抗氧化活性的合浦珠母貝肉抗氧化肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，其通過從合浦珠母貝貝肉中提取獲得，具體提取過程如下:
[0026]選用微波輔助Alcalase2.4L蛋白酶酶解合浦珠母貝貝肉,微波溫度為58°C、微波功率300W，微波時間17 min，加酶量為5000u/g (Ig合浦珠母貝貝肉中加入Alcalase2.4L蛋白酶5000u)，微波處理后繼續在58°C下再水浴1.5h ;離心分離，得到酶解液，用C18柱對酶解液進行脫鹽處理，脫鹽后的酶解液經S^hadex G-25進行分離純化，收集分子量約在800~1200Da分離液，即得到具有抗氧化活性的抗氧化肽。
[0027]將合浦珠母貝肉分離到的肽液，經RP-HPLC和MALD1-T0F-T0F 二級質譜分析，具體結果見圖1-2中所示，結果表明制備到的肽液中所含的主肽段分子量為1039.56Da，分析該肽的序列為:Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg,經紅外吸收光譜分析,如圖3中所示，其酰胺I區和酰胺II區域也有較強的α螺旋構型吸收帶。
[0028]實施例2
[0029]本實施例提供的具有抗氧化活性的合浦珠母貝肉抗氧化肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，其通過人工合成，人工合成合浦珠母貝肉抗氧化肽序列采用Fmoc固相合成法，合成原理為先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價鍵的結構同一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以此結合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經過脫去氨基保護基并同過量的活化羧基組分反應，接長肽鏈；重復(縮合一洗滌一去保護一中和及洗滌一下一輪縮合)操作，達到所要合成的肽鏈長度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經過純化等處理，即得所要的多肽。
[0030]本發明人工合成合浦珠母貝肉抗氧化肽序列Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg中米用的樹脂為王樹脂，反應過程為先選取兩種氨基酸，在縮合劑、堿試劑以及DMF反應溶劑作用下，進行反應，反應過程中，采用樹脂和Kaiser試劑進行產物的純度檢測至反應完全，獲得高純度的Gly-Ala產品，然后把Gly-Ala產品溶于切割試劑中進行切割，獲得Gly-Ala的粗品；根據要合成多肽的序列，依次合成下一個氨基酸，重復反應步驟、純度檢測和切割操作等過程，即合成得合浦珠母貝肉抗氧化肽序列Gly-Ala-Gly-Leu-PiO-Gly-Lys-Arg-Glu-Argο
[0031]各物質的用量以及具體的制備過程如下:
[0032]首先，根據合成的肽及其量，選擇樹脂用王樹1.Sg。
[0033]王樹脂的清洗過程為:用6mL/g的DMF泡10分鐘左右，然后抽干，再加質量濃度為20%的六氫吡啶和DMF溶液6mL/g，在室溫下放在搖床上或氮氣鼓動，振蕩5分鐘左右，再抽干，再加質量濃度為20%的六氫吡啶和DMF溶液5~8mL/g，在室溫下放在搖床上或氮氣鼓動，振蕩15分鐘，之后用無水甲醇洗3次，二氯甲烷洗3次。
[0034]反應:根據多肽的序列加Fmoc保護氨基酸及縮合劑，其中K可通過樹脂的重量及取代度計算:
[0035]K=樹脂取代度X樹脂的重量X (2~5)
[0036]Fmoc保護氨基酸的量=分子量XK/1000
[0037]HOBT 的量=0.135 X K
[0038]Collidine 的量=0.124X2K/0.8
[0039]將計算好的氨基酸、Fmoc縮合劑(H0BT/DIC)以及堿試劑(堿試劑作用是堿性條件，容易活化，形成酰胺鍵的試劑)，加入到接肽瓶，8mL/g的DMF為反應體系，氮氣鼓吹30min,再抽干清洗。
[0040]純度檢測:取20粒王 樹脂放在試管里，加ImLKaiser試劑，100°C加熱5分鐘，樹脂的顏色如果無色表明反應完全，如果有藍色，淡紫色則說明反應不完全，就需要重復反應，直到Kaiser Test顏色無色或接近無色。
[0041]切割:配制切割試劑為三氟乙酸冰:對甲苯酚:乙二硫醇=92.5:2.5:2.5:2.5(V/V)，然后按照10mL/g把多肽樹脂加到溶液中，密封好在室溫振蕩3小時，過濾，用TFA (三氟乙酸)洗，濾液中加無水乙醚，析出沉淀，固體再用乙醚洗若干次，然后抽干，得到多肽的粗
品O
[0042]根據要合成多肽的序列，依次合成下一個氨基酸，重復反應步驟、純度檢測以及切割試劑切割等操作過程，即合成得合浦珠母貝肉抗氧化肽序列Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg0
[0043]最后，合成的合浦珠母貝肉抗氧化肽序列的液相分析圖見圖4中所示，ESI質譜圖見圖5中所示，從圖4和圖5可見，此高純度合成肽的主要離子峰質荷比為1040.33，該粗品的主要分子量為1039.33Da，符合需要合成序列的分子量，固相合成成功。
[0044]實施例3
[0045]合浦珠母貝肉抗氧化肽序列的應用，以還原力、DPPH自由基、OH自由基以及超氧陰離子清除能力的IC50值為抗氧化指標，分析實施例1中從合浦珠母貝肉中分離制備到抗氧化肽序列(Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg)和實施例2中人工合成該序列肽((Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg))的這些指標,結果如下表 I 中所示:
[0046]表1實施例1和實施例2中合浦珠母貝肉抗氧化肽序列和對照Vc以及BHT的抗
[0047]氧化能力分析
[0048]
【權利要求】
1.一種具有抗氧化活性的合浦珠母貝肉抗氧化肽序列，其特征是:其氨基酸序列如SEQ ID No:1 所示。
2.權利要求1所述的具有抗氧化活性的合浦珠母貝肉抗氧化肽序列在制備具有抗氧化活性作用的食品、保健食品 、化 妝品、藥物或飼料中的應用。
【文檔編號】A23L1/305GK103739693SQ201410040473
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月27日 優先權日:2014年1月27日
【發明者】吳燕燕, 李來好, 楊賢慶, 王晶, 胡曉, 趙永強, 林婉玲, 楊少玲 申請人:中國水產科學研究院南海水產研究所