基于AllGlo探針熒光定量PCR的血漿microRNA檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】基于AllGlo探針熒光定量PCR的血漿microRNA檢測試劑盒及其檢測方法，涉及microRNA。試劑盒設有盒體、隔板、miRNA提取試劑瓶、莖環逆轉錄試劑瓶、實時熒光定量PCR試劑瓶。在200μL血漿充分裂解后加入所述試劑盒中提供的工作濃度為5n?mol的血漿miRNA外源性參照，立即進行漩渦震蕩15s，其余步驟同常規方法；應用所述試劑盒提供的莖環逆轉錄試劑將miRNA逆轉錄為cDNA；應用所述試劑盒提供的實時熒光定量PCR試劑將cDNA進行實時熒光定量PCR擴增；綜合分析儀器給出的各項數據，設定合理的閾值和基線，進行分析。其特異性和敏感性高，可快速準確檢測樣本中miRNA的含量。
【專利說明】基于AIIG10探針熒光定量PCR的血漿m i croRNA檢測試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及microRNA，具體涉及一種基于AllGlo探針熒光定量PCR的血漿microRNA檢測試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002]MicroRNA (miRNA)是一類廣泛存在于真核細胞中的長約22個核苷酸的非編碼RNA分子，參與了在生物體中許多生理病理過程，通過調芐基因表達，在細胞增殖、凋亡、生長發育、細胞分化、代謝等過程中發揮重要作用。具體表現為miRNA在細胞核內經過形成最初的初級轉錄本pr1-miRNA到pre_miRNA,后轉運出細胞核,通過剪切形成成熟miRNA,通過與Ago蛋白等形成RISC (RNA誘導的沉默復合體)，部分抑制或降解靶mRNA序列，參與基因表達調控(Bartel DP.MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function [J].Cell, 2004，116(2):281-297.)。
[0003]由于miRNA在腫瘤的發生、發展、預后判斷以及許多其他疾病狀態下扮演著重要角色，精確檢測其表達情況對于研究miRNA的作用具有重大意義，目前檢測miRNA的方法主要有northern blot技術、實時熒光定量PCR技術、原位雜交技術、微陣列芯片技術等。其中northern blot技術是RNA檢測的早期手段之一，但其特異性和敏感性低，如果樣本RNA含量低或存在降解，可能檢測不到；原位雜交技術用于檢測組織和細胞水平miRNA的分布情況，同時對miRNA進行半定量檢測，其不足之處在于不能準確檢測到低表達的miRNA ;微陣列芯片技術是一種高通量的檢測技術，能同時檢測一種或多種樣本的大量的miRNA，但存在芯片制作費時、費力、標記成本高、檢測靈敏度與特異性低等問題。
[0004]實時熒光定量技術(RT-qPCR)是目前最普遍用于基因表達檢測的技術之一，具有簡便快速、敏感性高和特異性好等特點。目前用于檢測miRNA的實時熒光定量PCR方法包括RNA逆轉錄和下游的熒光定量PCR兩部分，其中逆轉錄根據反轉錄引物的不同分為兩種:同聚物加尾法和莖環逆轉錄法；熒光定量PCR的檢測分為染料法和探針法，其中目前檢測miRNA的探針多為Taqman-MGB探針(一種適合于擴增短片段的熒光探針)。由于成熟的miRNA具有片段短小的特點，要特異的檢測，探針法更有優勢，在敏感性和特異性上優于染料法。基于莖環結構的逆轉錄引物能特異識別，擴增成熟的miRNA序列，而miRNA的前體并未被擴增，Taqman-MGB探針檢測miRNA的缺點在于合成價格貴,不利于推廣。
[0005]目前AllGl0探針已經成功應用于檢測皰疹病毒、乙型肝炎病毒基因突變(Feng, Z.L.Yuj X.Y.Lu，Z.M.Gengj D.Y.Zhang, L.Chen, S.J.Rapid detection of thehepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo?probes[J].Clin Chim Acta,2011,412 (11-12): 1018-1021)、侵襲性曲霉菌病(Wuj D.S.Shenj J.Z.Zhou, X.Q.Shenj S.F.Wuj X.M.The establishment and evaluation of diagnostic accuracy of AlIGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke ZaZhij 2010，49 (2): 142-145)、K-ras基因突變、強直性脊柱炎等檢測。
【發明內容】

[0006]針對現有檢測血漿miRNA方法中使用的試劑盒和檢測方法存在的上述缺陷，本發明的第一個目的在于提供檢測三種血漿miRNA的特異引物。
[0007]本發明的第二個目在于提供基于AllGl0探針熒光定量PCR的血漿miRNA檢測試劑盒。
[0008]本發明的第三個目的在于提供一種基于AllGl0探針熒光定量PCR的三種血漿miRNA檢測方法。
[0009]所述三種血衆miRNA 分別是指 hsa-miR-504、hsa_miR-133b、cel-miR-39 ;其中hsa-miR-504 與 hsa_miR-133b 為人源性 miRNA, cel-miR-39 為線蟲來源的 miRNA,作為一種外源性參照miRNA，從血漿提取開始加入血漿中，作用在于能夠從提取miRNA開始監測整個實時熒光定量PCR的全過程。
[0010]所述檢測三種血漿miRNA的特異引物包括三種血漿miRNA特異性逆轉錄引物和三種血漿miRNA特異性正向引物；
[0011]所述三種血衆miRNA特異性逆轉錄引物由hsa-miR-504的特異性逆轉錄引物、hsa-miR-133b的特異性逆轉錄引物和cel-miR-39的特異性逆轉錄引物組成；
[0012]所述hsa-miR-504的特異性逆轉錄引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.1 5 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACGATAGAGT-3 ;；
[0013]所述hsa-miR-133b的特異性逆轉錄引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.2 5 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTAGCTGGT-3 ;；
`[0014]所述cel-miR-39的特異性逆轉錄引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.3 5 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCAAGCTGA-3 ;。
[0015]所述三種血衆miRNA特異性正向引物由hsa-miR-504的特異性正向引物、hsa-miR-133b的特異性正向引物和cel-miR-39的特異性正向引物組成；
[0016]所述hsa-miR-504的特異性正向引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.45 ; -GCTGGTTAAGACCCTGGT-3 ;；
[0017]所述hsa-miR_133b的特異性正向引物核苷酸序列為SEQ ID N0.55 ; -TAGCGTCTTTGGTCCCCT-3 ;；
[0018]所述cel-miR-39的特異性正向引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.65 ; -CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3 ;。
[0019]所述三種血漿miRNA特異性AllGlo探針由hsa-miR-504的特異性AllGlo探針、hsa-miR-133b的特異性AllGlo探針和cel-miR-39的特異性AllGlo探針組成；
[0020]所述hsa-miR-504的特異性AllGlo探針的核苷酸序列為SEQ ID N0.7MAR-CTGGATACGACGATAGAGTGC-MAR ；
[0021]所述hsa-miR-133b的特異性AllGlo探針的核苷酸序列為SEQ ID N0.8JUP-CTGGATACGACTAGCTGGTTGA-JUP ；
[0022]所述cel-miR-39的特異性AllGlo探針的核苷酸序列為SEQ ID N0.9NEP-TGCACTGGATACGACCAAGCT-NEP。
[0023]所述三種血漿miRNA的通用引物序列的核苷酸序列為SEQ IDN0.105 ' -CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3 '。
[0024]所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的血漿microRNA檢測試劑盒設有盒體、隔板、miRNA提取試劑瓶、莖環逆轉錄試劑瓶、實時熒光定量PCR試劑瓶；隔板設在盒體內，miRNA提取試劑瓶、莖環逆轉錄試劑瓶、實時熒光定量PCR試劑瓶插在隔板上，miRNA提取試劑瓶內裝有miRNA提取試劑，莖環逆轉錄試劑瓶內裝有莖環逆轉錄試劑，實時熒光定量PCR試劑瓶內裝有實時熒光定量PCR試劑。
[0025]所述miRNA提取試劑包括血衆miRNA外源性參照,所述血衆miRNA外源性參照是指人工合成的cel-miR-39的模擬物(人工合成的cel-miR-39的模擬物作為一種外源性加入的參照，其工作濃度為5n mol，作用在于能夠監測從提取microRNA到后面實時熒光定量PCR全過程的反應效率)。
[0026]所述莖環逆轉錄試劑包括以下組份:200單位/ μ L的MMLV酶、IOm mol dNTP混合液、5XRT 緩沖液(5XRT 緩沖液由 250m mol Tris-HCl, 375m mol KCl, 15m mol MgCl2, 50mmoIDTT組成)、40單位/ μ L的RNA酶抑制劑、10m mol的MgCl2、I μ mol的特異的miRNA的逆轉錄引物、miRNA標準品(這里的miRNA標準品是指人工合成的miRNA，濃度為lOOnmol)。
[0027]所述實時熒光定量PCR試劑包括以下組份:10 X Taq緩沖液(10 X Taq緩沖液包括100mmolTris-HCl,500m mol KCDUOm mol 的 MgCl2、5 單位 / μ L 的 Taq 聚合酶、IOmMdNTP混合液、100ml無核酶水、10 μ mol特異正向引物、10 μ mol通用反向引物和AllGlo探針。
[0028]所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的血漿microRNA檢測方法，包括以下步驟: [0029]1.在200 μ L血漿充分裂解后加入所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的血漿miRNA檢測試劑盒中提供的工作濃度為5n mol的血漿miRNA外源性參照，立即進行漩渦震蕩15s，其余步驟同常規方法；
[0030]2.應用所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的血漿miRNA檢測試劑盒提供的莖環逆轉錄試劑將miRNA逆轉錄為cDNA ；
[0031]3.應用所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的血漿miRNA檢測試劑盒提供的實時熒光定量PCR試劑將cDNA進行實時熒光定量PCR擴增；
[0032]4.綜合分析儀器給出的各項數據，設定合理的閾值(Threshold)和基線(Baseline),進行結果分析。
[0033]所述AllGlo 探針可米用美國 AlleLogic Biosciences Corporation 公司的突光定量探針，它擁有普通Taqman, Taqman-MGB及分子信標(molecular beacon)探針所有優點，去掉了目前這幾種探針的最大弊端，它打破了傳統Taqman —端報告基團一端淬滅基團的限制，利用了美國AlleLogic Biosciences Corporation公司研制的幾種常見波長的特制熒光染料，標記在寡核苷酸上面互為報告基團和粹滅基團，而且上面含有特殊的可以提高Tm值(退火溫度)的化學基團，提高探針特異性，雜交特異性大大提高，在雜交水解之后兩端標記的染料又全部變為報告基團，提高熒光增量。
[0034]所述AllGl0探針具有以下優勢:①提高Tm值(可達10°C以上)，探針更短可以達到15~16個堿基，可以適用A，T含量比較高的序列設計探針；②加大了多重熒光定量的選擇，因為每種染料即是報告基團又是淬滅基團，打破傳統Taqman探針因波長原因標記選擇困難，不受淬滅基團波長限制；③大大提高信噪比，無背景信號，空間距離近，更好的淬滅效果；④成本較低，價格僅相當于Taqman-MGB探針的一半，具有MGB探針所有優勢。[0035]本發明采用了 AllGl0探針技術，設計了三種特異正向引物和特異探針和通用反向引物，三種探針兩端只需分別標記三種特殊熒光基團(MAR、JUP,NEP),能夠同時檢測三種miRNA,并對該技術反應條件進行優化，建立了一種基于AllGl0探針技術聯合實時熒光定量PCR技術同時檢測三種血漿miRNA的方法，應用前景廣闊。
[0036]本發明采用了 AllGl0探針技術，建立了能檢測miRNA的實時熒光定量PCR的方法，與Taqman-MGB探針法相比，線性范圍均能達到7個數量級。本發明建立的實時熒光定量PCR靈敏度最低可達10拷貝/yL，最高可達IO7拷貝/yL。
[0037]本發明的有益效果如下:
[0038]本發明提供了一種檢測miRNA基于AllGlo探針RT-qPCR的檢測方法和試劑盒，其特異性和敏感性高，可快速準確檢測樣本中miRNA的含量，與現有技術相比具有以下優勢: [0039]1.與northern blot，miRNA芯片相比，AllGlo探針檢測的特異性和敏感性均要高，價格比microRNA芯片要便宜；
[0040]2.與taqman-MGB探針相比，AllGl0探針采用相同的熒光基團，互為報告基團和淬滅基團，一方面釋放的熒光信號更強，另一方面本底信號更低；而且合成程序簡單，價格僅相當于taqman-MGB的一半。
[0041]3.本發明建立了基于AllGlo探針的RT-qPCR檢測miRNA方法，適合于做為芯片篩選miRNA的的后期臨床樣本驗證，以及研究miRNA在不同領域的差異性表達等，推動了miRNA在相關疾病的深入研究。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1為本發明實施例基于AllGl0探針熒光定量PCR的血漿microRNA檢測試劑盒的結構組成示意圖。
[0043]圖2為AllGlo探針實時熒光定量PCR檢測三種標準品混合液中hsa_miR-133b(人源性miR-133b)的擴增曲線圖。
[0044]圖3為AllGlo探針實時熒光定量PCR檢測三種標準品混合液中hsa_miR-133b(人源性miR-133b)的標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0045]實施例1
[0046]參見圖1，本發明所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的血漿microRNA檢測試劑盒實施例設有盒體1、隔板2、miRNA提取試劑瓶3、莖環逆轉錄試劑瓶4、實時熒光定量PCR試劑瓶5 ;隔板2設在盒體I內，miRNA提取試劑瓶3、莖環逆轉錄試劑瓶4、實時熒光定量PCR試劑瓶5插在隔板2上，miRNA提取試劑瓶3內裝有miRNA提取試劑，莖環逆轉錄試劑瓶4內裝有莖環逆轉錄試劑，實時熒光定量PCR試劑瓶5內裝有實時熒光定量PCR試劑。
[0047]所述miRNA提取試劑包括血衆miRNA外源性參照,所述血衆miRNA外源性參照是指人工合成的cel-miR-39的模擬物(人工合成的cel-miR-39的模擬物做為一種外源性加入的參照，其工作濃度為5n mol，作用在于能夠監測從提取microRNA到后面實時熒光定量PCR全過程的反應效率)。
[0048]所述莖環逆轉錄試劑包括以下組份:200單位/ μ L的MMLV酶、IOm mol dNTP混合液、5XRT 緩沖液(5XRT 緩沖液由 250m mol Tris-HCl, 375m mol KCl, 15m mol MgCl2, 50mmoIDTT組成)、40單位/ μ L的RNA酶抑制劑、IOm mol的MgCl2、I μ mol的特異的miRNA的逆轉錄引物、miRNA標準品(這里的miRNA標準品是指人工合成的miRNA，濃度為lOOnmol)。
[0049]所述實時熒光定量PCR試劑包括以下組份:10XTaq緩沖液(10 X Taq緩沖液包括100mmolTris-HCl,500m mol KCDUOm mol 的 MgCl2、5 單位 / μ L 的 Taq 聚合酶、IOmMdNTP混合液、100ml無核酶水、10 μ mol特異正向引物、10 μ mol通用反向引物和AllGlo探針。
[0050]實施例2
[0051]本發明的具體操作步驟及反應體系如下:
[0052]1.提取 miRNA
[0053]采用天根生物科技有限公司的生產的miRNA提取試劑盒，按照操作說明書進行樣本(血漿)microRNA提取，其中200 μ L血漿在加入等體積裂解液靜置5min后加入外源性參照cel_mir395 μ L (工作濃度為5n mol),后按照說明書操作進行,最后用30 μ L的去核酶水溶解RNA，于核酸分光光度儀器Nano Drop2000上分別測定濃度和純度，取2~20ng的已提取的miRNA用于下游的逆轉錄，其余的miRNA均于_80°C凍存。
[0054]2.miRNA 的逆轉錄:
[0055]2.1將逆轉錄所需成分于室溫下溶解，震蕩混勻后置于冰上；
[0056]2.2配制逆轉錄反應混合液，按表1進行配制:
[0057]表1`
[0058]
【權利要求】
1.檢測三種血漿mi RNA的特異引物，其特征在于所述三種血漿m i RNA分別是指hsa-miR-504、hsa_miR-133b、cel-miR-39 ;其中 hsa-miR-504 與 hsa_miR-133b 為人源性miRNA, cel-miR-39為線蟲來源的miRNA，作為一種外源性參照miRNA，從血漿提取開始加入血漿中，作用在于能夠從提取miRNA開始監測整個實時熒光定量PCR的全過程； 所述檢測三種血漿miRNA的特異引物包括三種血漿miRNA特異性逆轉錄引物和三種血漿miRNA特異性正向引物； 所述三種血衆miRNA特異性逆轉錄引物由hsa-miR-504的特異性逆轉錄引物、hsa-miR-133b的特異性逆轉錄引物和cel-miR-39的特異性逆轉錄引物組成； 所述hsa-miR-504的特異性逆轉錄引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.1 5 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACGATAGAGT-3 ;； 所述hsa-miR-133b的特異性逆轉錄引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.2 5 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTAGCTGGT-3 ;； 所述cel-miR-39的特異性逆轉錄引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.3 5 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCAAGCTGA-3 ;； 所述三種血漿miRNA特異性正向引物由hsa-miR-504的特異性正向引物、hsa-miR-133b的特異性正向引物和cel-miR-39的特異性正向引物組成； 所述hsa-miR-504的特異性正向引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.45 ; -GCTGGTTAAGACCCTGGT-3 ;； 所述hsa-miR-1 33b的特異性正向引物核苷酸序列為SEQ ID N0.55 ; -TAGCGTCTTTGGTCCCCT-3 ;； 所述cel-miR-39的特異性正向引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.65 ; -CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3 ;。
2.三種血漿miRNA特異性AllGlo探針，其特征在于所述三種血漿miRNA分別是指hsa-miR-504、hsa_miR-133b、cel-miR-39 ;其中 hsa-miR-504 與 hsa_miR-133b 為人源性miRNA, cel-miR-39為線蟲來源的miRNA，作為一種外源性參照miRNA，從血漿提取開始加入血漿中，作用在于能夠從提取miRNA開始監測整個實時熒光定量PCR的全過程； 所述三種血漿miRNA特異性AllGlo探針由hsa-miR-504的特異性AllGlo探針、hsa-miR-133b的特異性AllGlo探針和cel-miR-39的特異性AllGlo探針組成； 所述hsa-miR-504的特異性AllGlo探針的核苷酸序列為SEQ ID N0.7MAR-CTGGATACGACGATAGAGTGC-MAR ； 所述hsa-miR-133b的特異性AllGlo探針的核苷酸序列為SEQ ID N0.8JUP-CTGGATACGACTAGCTGGTTGA-JUP ； 所述cel-miR-39的特異性AllGlo探針的核苷酸序列為SEQ ID N0.9NEP-TGCACTGGATACGACCAAGCT-NEP ； 所述三種血漿miRNA的通用引物序列的核苷酸序列為SEQ ID N0.105 ; -CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3 ;。
3.基于AlIGlo探針熒光定量PCR的血漿microRNA檢測試劑盒，其特征在于設有盒體、隔板、miRNA提取試劑瓶、莖環逆轉錄試劑瓶、實時熒光定量PCR試劑瓶；隔板設在盒體內，miRNA提取試劑瓶、莖環逆轉錄試劑瓶、實時熒光定量PCR試劑瓶插在隔板上，miRNA提取試劑瓶內裝有miRNA提取試劑，莖環逆轉錄試劑瓶內裝有莖環逆轉錄試劑，實時熒光定量PCR試劑瓶內裝有實時熒光定量PCR試劑。
4.如權利要求3所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的血漿microRNA檢測試劑盒，其特征在于所述miRNA提取試劑包括血衆miRNA外源性參照,所述血衆miRNA外源性參照是指人工合成的cel-miR-39的模擬物，人工合成的cel-miR-39的模擬物作為一種外源性加入的參照，其工作濃度為5n mol，作用在于能夠監測從提取microRNA到后面實時熒光定量PCR全過程的反應效率。
5.如權利要求3所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的血漿microRNA檢測試劑盒，其特征在于所述莖環逆轉錄試劑包括以下組份:200單位/ μ L的MMLV酶、1Om mol dNTP混合液、5 X RT緩沖液、40單位/ μ L的RNA酶抑制劑、1Om mol的MgCl2U μ mol的特異的miRNA的逆轉錄引物、miRNA標準品，濃度為IOOn mol ;所述5XRT緩沖液由250m molTris-HCl，375m mol KCl, 15m mol MgCl2, 50m mol DTT 組成。
6.如權利要求3所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的血漿microRNA檢測試劑盒，其特征在于所述實時熒光定量PCR試劑包括以下組份:10XTaq緩沖液、10m mol的MgCl2、5單位/ μ L的Taq聚合酶、IOmMdNTP混合液、100ml無核酶水、10 μ mol特異正向引物、10 μ mol通用反向引物和AllGlo探針；所述10XTaq緩沖液包括100m molTris-HCl, 500mmol KC1。
7.基于AllGlo探針熒光定量PCR的血漿microRNA檢測方法，其特征在于包括以下步驟: 1)在200μ L血漿充分裂解后加入所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的血漿miRNA檢測試劑盒中提供的工作濃度為5n mol的血漿miRNA外源性參照，立即進行漩渦震蕩15s，其余步驟同常規方法； 2)應用所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的血漿miRNA檢測試劑盒提供的莖環逆轉錄試劑將miRNA逆轉錄為cDNA ； 3)應用所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的血漿miRNA檢測試劑盒提供的實時熒光定量PCR試劑將cDNA進行實時熒光定量PCR擴增； 4)綜合分析儀器給出的各項數據，設定合理的閾值和基線，進行結果分析。
8.如權利要求7所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的血漿microRNA檢測方法，其特征在于所述AllGlo探針采用美國AlleLogic Biosciences Corporation公司的突光定量探針。
【文檔編號】C12N15/11GK103773878SQ201410041147
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月28日 優先權日:2014年1月28日
【發明者】張忠英, 唐晶 申請人:廈門大學附屬中山醫院