一種共固定化亞硝化細菌-反硝化細菌的方法
【專利摘要】一種共固定化亞硝化細菌-反硝化細菌的方法，屬于共固定化細胞的方法。該方法包括步驟：（1）以海藻酸鈉和氯化鈣先對反硝化細菌進行包埋；（2）將步驟（1）中制得的固定化小球再與亞硝化細菌和海藻酸鈉混合，滴入氯化鈣中進行第二次包埋；（3）將步驟（2）中制得的共固定化亞硝化-反硝化細菌接種于含有氨氮的培養基中培養，可用于氨氮的降解。優點：1、首次實現了亞硝化細菌、反硝化細菌在同一載體中的共固定化培養；2、制備共固定化小球方法簡便，操作程序易于控制，制成的共固定化小球易于保存和再利用；3、通過亞硝化細菌、反硝化細菌共固定化培養，具有比傳統未固定化菌種或固定化單一菌種脫氮效率高、易與水體分離、可重復利用。
【專利說明】一種共固定化亞硝化細菌-反硝化細菌的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種共固定化細胞的方法，具體涉及一種共固定化亞硝化細菌-反硝化細菌的方法。
【背景技術】
[0002]近年來，許多大型企業、工廠大量地排放沒有經過處理的工業污水，比如焦化廢水、煤加壓氣化廢水、氮肥廢水等，導致含氮化合物的急劇增加，從而造成了嚴重的氮污染現象，造成水體的富營養化以及水體生態系統紊亂等一系列環境問題，如影響水中的魚類以及一些水生生物的氧傳遞，造成它們的血液結合氧能力降低，致使魚類及一些水生生物死亡，嚴重時甚至會破壞生態平衡。因此，氮污染問題的解決刻不容緩。
[0003]目前共固定化細胞技術在亞硝化細菌和反硝化細菌中的應用尚有待于進一步研究。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是要提供一種共固定化亞硝化細菌-反硝化細菌的方法，通過共固定化細胞脫氮，與傳統脫氮技術相比，具有快速、高效、可重復利用的特點。
[0005]本發明的目的是這樣實現的:以亞硝化細菌、反硝化細菌液體培養的菌種為共固定化對象，采用固定 化細胞技術，以海藻酸鈉和氯化鈣先對反硝化細菌進行包埋，將包埋后的固定化小球再與亞硝化細菌和海藻酸鈉混合，滴入氯化鈣中進行第二次包埋，形成共固定化亞硝化-反硝化細菌，可用于氨氮的降解。
[0006]具體步驟如下:
(I)菌種活化、液體培養:選用的菌種為亞硝化細菌和反硝化細菌兩大類的亞硝化單胞菌Ni trosomonas sp.和好氧假單胞菌Pseudomonassp.,經常規方法活化后,采用含有氨氮的液體培養基培養亞硝化細菌，采用含有硝態氮的液體培養基培養反硝化細菌；
(2 )第一次包埋:選取在液體培養基中長勢較好的反硝化細菌，沉淀，棄上清液，加入海藻酸鈉混勻，終濃度在40-45g/L。用5號注射器吸取混合液滴入19-21g/L的0&(:12溶液中，成小球，4°C冰箱固定6h，小球用去離子水沖洗2-3遍；
(3)第二次包埋:選取在液體培養基中長勢較好的亞硝化細菌，沉淀，棄上清液，加入海藻酸鈉混勻，終濃度在40-45g/L，加入步驟(2)中的固定化小球，混合后用直徑
0.5cm-0.7cm的玻璃吸管，吸取混有菌液的固定化小球，滴入19_21g/L的CaCl2溶液中，成小球，4°C冰箱固定4-6h，小球用去離子水沖洗2-3遍；
(4)配制模擬污水液體培養基:模擬污水液體培養基中氨氮含量為200-250mg/L,加入碳酸鈣作為碳源，250mL搖瓶中加入100mL-160mL模擬污水液體培養基:按照接種量為2個/mL液體培養基，加入共固定化小球，28°C _30°C，110-140r/min搖床培養48h-60h進行亞硝化反應階段；
(5)補加有機碳源:加入4-6g/L檸檬酸鈉作為有機碳源，26°C-28°C,130-160r/min搖床培養24h-48h進行反硝化反應階段；
(6)按照國家環境保護總局《水和廢水監測分析方法》測定亞硝酸鹽氮、氨氮、硝酸鹽氮的含量。
[0007]有益效果，由于采用了上述方案:固定化細胞技術在廢水處理領域中具有巨大的優越性和發展潛力。借助于兩種或兩種以上的微生物在同一環境中的相互作用來實現。這樣混合菌中的一些菌種能提供重要的降解酶，而其它菌種能提供表面活性劑或生長因子，使它們的生理特性可以相互補充。將不同細胞同時固定于同一載體內形成共固定化系統，綜合了混合發酵和固定化技術的優點。系統穩定，可將幾種不同功能的細胞和細胞器在同一系統內進行協同作用。由于亞硝化細菌的產物可作為反硝化細菌的底物，亞硝化和反硝化兩階段可在同一反應器中完成，實現短程硝化-反硝化，提高生物脫氮的效率。具體以下優點:
(1)本發明首次實現了亞硝化細菌、反硝化細菌在同一載體中的共固定化培養；
(2)制備共固定化小球方法簡便，操作程序易于控制，制成的共固定化小球易于保存和再利用；
(3)通過亞硝化細菌、反硝化細菌共固定化培養，具有比傳統未固定化菌種或固定化單一菌種脫氮效率高、易與水體分離、可重復利用等優點。
【具體實施方式】
[0008]下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明:
1、菌種:菌種為亞硝化細菌和反硝化細菌。
[0009]亞硝化細菌(Λ?sp.)、反硝化細菌)為在中國科學院外購的菌種，經上海生工生物公司測序鑒定后，為亞硝化細菌大類的亞硝化單胞菌Ni trosomonas sp.和反硝化細菌大類的好氧假單胞菌Pseudomonassp.:現由徐州工程學院食品微生物學實驗室保藏。
[0010]2、培養基
亞硝化細菌液體培養基:4g/L (NH4)2SO4Ug/L K2HPO4、0.5g/L MgS04、2g/L NaCl、0.4g/L FeSO4, 5g/L CaCO3 混勻溶解，pH 8.0-8.2 ；
反硝化細菌液體培養:2g/LKN03，0.2g/LMgS04, lg/LK2HP04, lg/LKH2P04, 5g/L 檸檬酸鈉，pH 7.2-7.6 ；
模擬污水液體培養基:0.65g/L NH4Cl，5g/L檸檬酸鈉(后加)，0.2g/L K2HPO4,0.lg/LMgSO4,0.08g/L FeSO4, 2g/L CaCO3 混勻溶解，pH 7.5，NH3-N 濃度為 206 mg/L。
[0011]實施例1:以 亞硝化細菌、反硝化細菌液體培養的菌種為共固定化對象，采用固定化細胞技術，以海藻酸鈉和氯化鈣先對反硝化細菌進行包埋，將包埋后的固定化小球再與亞硝化細菌和海藻酸鈉混合，滴入氯化鈣中進行第二次包埋，形成共固定化亞硝化-反硝化細菌，可用于氨氮的降解。
[0012]具體步驟如下:
(1)菌種活化、液體培養:選用的菌種為亞硝化細菌和反硝化細菌兩大類的亞硝化單胞菌Ni trosomonas sp.和好氧假單胞菌Pseudomonassp.,經常規方法活化后,采用含有氨氮的液體培養基培養亞硝化細菌，采用含有硝態氮的液體培養基培養反硝化細菌；(2 )第一次包埋:選取在液體培養基中長勢較好的反硝化細菌，沉淀，棄上清液，加入海藻酸鈉混勻，終濃度在40-45g/L。用5號注射器吸取混合液滴入19-21g/L的0&(:12溶液中，成小球，4°C冰箱固定6h，小球用去離子水沖洗2-3遍；
(3)第二次包埋:選取在液體培養基中長勢較好的亞硝化細菌，沉淀，棄上清液，加入海藻酸鈉混勻，終濃度在40-45g/L，加入步驟(2)中的固定化小球，混合后用直徑
0.5cm-0.7cm的玻璃吸管，吸取混有菌液的固定化小球，滴入19_21g/L的CaCl2溶液中，成小球，4°C冰箱固定4-6h，小球用去離子水沖洗2-3遍；
(4)配制模擬污水液體培養基:模擬污水液體培養基中氨氮含量為200-250mg/L,加入碳酸鈣作為碳源，250mL搖瓶中加入100mL-160mL模擬污水液體培養基:按照接種量為2個/mL液體培養基，加入共固定化小球，28°C _30°C，110-140r/min搖床培養48h-60h進行亞硝化反應階段；
(5)補加有機碳源:加入4-6g/L檸檬酸鈉作為有機碳源，26°C-28°C,130-160r/min搖床培養24h-48h進行反硝化反應階段；
(6)按照國家環境保護總局《水和廢水監測分析方法》測定亞硝酸鹽氮、氨氮、硝酸鹽氮的含量。
[0013]實施例2:共固定化亞硝化-反硝化細菌
1、共固定化工藝
選取在液體培養基中長勢較好的亞硝化細菌，沉淀，棄上清液，按照亞硝化細菌:海藻酸鈉=1:1 (w/v)的比例取一定量菌體，加入海藻酸鈉混勻，海藻酸鈉終濃度為40-45g/L，用5號注射器吸取混合液滴入到21g/L的CaCl2溶液中，成小球，粒徑約0.3cm，4°C冰箱固定4h。小球用去離子水沖洗2-3遍。選取在液體培養基中長勢較好的反硝化細菌，沉淀，棄上清液，按照每克菌體接入20個已固定好的亞硝化細菌小球，混勻，按照反硝化細菌:海藻酸鈉=1:1 (w/v)的比例加入海藻酸鈉混勻，海藻酸鈉終濃度為40-45g/L，用直徑約0.5cm的玻璃管吸取小球和混合液，滴入到21g/L的CaCl2溶液中，成共固定化小球，4°C冰箱固定4h0
[0014]2、脫氮工藝
按照接種量為2-3個/mL共固定化小球，加入到盛有140mL模擬污水液體培養基的250mL搖瓶中,pH 8.0, 30°C, 110-140r/min搖床培養。每4_6h測定氨氮、亞硝態氮、硝態氮含量，當亞硝態氮含量較高時，加入5g/L檸檬酸鈉，繼續測定氨氮、亞硝態氮、硝態氮含量。結果如下。
[0015]亞硝化反54h時氨氮含量已降至7.85 mg/L，氨氮去除率為96.19%，48h時亞硝態氮含量達到180.55 mg/L ;加入檸檬酸鈉后78h時亞硝態氮已降至8.25 mg/L，去除率為95.43%ο
[0016]結果表明，共固定化小球脫氮性能良好，反應速度較快。
[0017]3、重復使用工藝 當亞硝態氮含量由最大值降低到較低值時將舊的模擬污水液體培養基倒掉，重新加入新的模擬污水液體培養基，重新培養并且測定氨氮、亞硝酸鹽氮、硝態氮含量。結果如下。
[0018]隨著重復使用次數增加，共固定化小球的顏色開始變透明，小球直徑逐漸增大并破裂，數量逐漸減少。第四次更換培養基培養后，共固定化小球數量減少了 3/4，因此共固定化小球可重復使用3-4次。
[0019]4、低溫保存工藝
制備好的共固定化小球放在4°C冰箱保存7d后，加入模擬污水液體培養基培養，結果表明，低溫保存后共固定化小球脫氮和亞硝態氮去除性能未發生顯著變化。
[0020]以上結果表明:共固定化亞硝化-反硝化細菌制備方法簡單，脫氮效率高、可重復使用，易 于保存。
【權利要求】
1.一種共固定化亞硝化細菌-反硝化細菌的方法，其特征是:以亞硝化細菌、反硝化細菌液體培養的菌種為共固定化對象，采用固定化細胞技術，以海藻酸鈉和氯化鈣先對反硝化細菌進行包埋，將包埋后的固定化小球再與亞硝化細菌和海藻酸鈉混合，滴入氯化鈣中進行第二次包埋，形成共固定化亞硝化-反硝化細菌，可用于氨氮的降解； 具體步驟如下: (I)菌種活化、液體培養:選用的菌種為亞硝化細菌和反硝化細菌兩大類的亞硝化單胞菌Ni trosomonas sp.和好氧假單胞菌Pseudomonassp.,經常規方法活化后,采用含有氨氮的液體培養基培養亞硝化細菌，采用含有硝態氮的液體培養基培養反硝化細菌； (2 )第一次包埋:選取在液體培養基中長勢較好的反硝化細菌，沉淀，棄上清液，加入海藻酸鈉混勻，終濃度在40-45g/L ;用5號注射器吸取混合液滴入19-21g/L的CaCl2溶液中，成小球，4°C冰箱固定6h，小球用去離子水沖洗2-3遍； (3)第二次包埋:選取在液體培養基中長勢較好的亞硝化細菌，沉淀，棄上清液，加入海藻酸鈉混勻，終濃度在40-45g/L，加入步驟(2)中的固定化小球，混合后用直徑.0.5cm-0.7cm的玻璃吸管，吸取混有菌液的固定化小球，滴入19_21g/L的CaCl2溶液中，成小球，4°C冰箱固定4-6h，小球用去離子水沖洗2-3遍； (4)配制模擬污水液體培養基:模擬污水液體培養基中氨氮含量為200-250mg/L,加入碳酸鈣作為碳源，250mL搖瓶中加入100mL-160mL模擬污水液體培養基:按照接種量為2個/mL液體培養基，加入共固定化小球，28°C _30°C，110-140r/min搖床培養48h-60h進行亞硝化反應階段； (5)補加有機碳源:加入4-6g/L檸檬酸鈉作為有機碳源，26°C-28°C,130-160r/min搖床培養24h-48h進行反硝化反應階段； (6)按照國家環境保護總局《水和廢水監測分析方法》測定亞硝酸鹽氮、氨氮、硝酸鹽氮的含量。
【文檔編號】C12N11/04GK103805591SQ201410082371
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年3月7日 優先權日:2014年3月7日
【發明者】涂寶軍, 董玉瑋, 邊閣, 苗敬芝, 徐笑笑, 肖杰, 朱雯雯 申請人:徐州工程學院