本發明屬于污水處理領域，尤其涉及一種好氧反硝化菌及其應用。

背景技術：

污水處理廠中污水的主要污染物是懸浮顆粒物、有機物、磷和氮，前三者一般通過強化生化反應、化學絮凝沉淀等方法去除，效果較為顯著，但對總氮的去除較難達到一級A標準。主要原因是總氮的去除多數通過微生物的氨化、硝化和反硝化過程來實現，而傳統生物脫氮的污水處理系統中由于高效分解微生物的濃度較低，很難發揮污水處理的最大作用，處理效果不理想。

綜上所述，傳統生物脫氮的污水處理系統中由于高效分解微生物的濃度較低，很難發揮污水處理的最大作用，處理效果不理想。

技術實現要素：

本發明實施例的目的在于提供一種好氧反硝化菌及其應用，旨在解決傳統生物脫氮的污水處理系統中由于高效分解微生物的濃度較低，很難發揮污水處理的最大作用，處理效果不理想的問題。

本發明是這樣實現的，一種好氧反硝化菌的培養方法，所述好氧反硝化菌的培養方法包括以下步驟：

步驟一，從養豬場的污泥中提取出菌種；

步驟二，在實驗室中采用平板畫線法進行純化；

步驟三，純化6-8代，得到目標菌種。

進一步，所述純化采用了以下培養基：

氨化細菌分離培養基:NaCl 0.25g/L，蛋白胨5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，超純水1000mL，pH為7.2，在1×10⁵Pa滅菌20min；以2％(質量分數)的瓊脂糖做平板分離支持物；

硝化細菌分離培養基:檸檬酸鈉7.66g/L，CaCl₂·H₂O 0.03g/L，FeSO₄·7H₂O 0.03g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，硫酸銨1.0g/L，磷酸氫二鉀1.0g/L，NaCl 0.3g/L，pH7.2-7.4；瓊脂20g/L；；

反硝化細菌分離培養基；

DM基礎培養基，KH₂PO₄1.5g/L；MgSO₄·7H₂O 0.01g/L；Na₂HPO₄7.9g/L；微量元素溶液2ml；去離子水1000mL；pH7.0-7.5；檸檬酸鈉5.66g/L；NaNO₃0.8415g/L；

溴甲基酚藍培養基，KH₂PO₄1.5g/L；MgSO₄·7H₂O 0.01g/L；Na₂HPO₄7.9g/L；微量元素溶液2ml；去離子水1000mL；pH7.0-7.5；檸檬酸鈉5.66g/L；NaNO₃0.8415g/L；1mL BTB和2.5％瓊脂，蒸餾水溶解并調節pH 7.0-7.3。

進一步，所述微量元素溶液：乙二胺四乙酸50.0g，ZnSO₄2.2g，CaCl₂5.5g，MnCl₂·4H₂O5.06g，FeSO₄·7H₂O 5.0g，CuSO₄·5H₂O 1.57g，CoCl₂·6H₂O1.61g，溶解后用蒸餾水定容至1L，pH7.0。

本發明的另一目的在于提供一種由所述好氧反硝化菌的培養方法培養的好氧反硝化菌。

本發明的另一目的在于提供一種利用所述好氧反硝化菌的污水處理方法，所述污水處理方法通過高分子材料對好氧反硝化菌進行包被，形成穩定結構，投入污水中進行氮的降解。

本發明提供的好氧反硝化菌及其應用，采用選擇性培養基，通過對氮源的控制來達到篩選具有相應功能的細菌。分別以硫酸銨、硝酸鈉為唯一氮源來篩選具有硝化性能和反硝化性能的細菌。在整個脫氮流程中，通過銨根離子、硝酸根離子這些介于兩種不同脫氮作用之間的轉折離子的濃度，來初步判斷該菌株的氨化、硝化、反硝化能力，以及初步推斷出這些作用的速度與其限制因素。

附圖說明

圖1是本發明實施例提供的好氧反硝化菌的培養方法流程圖。

圖2是本發明實施例提供的D2菌在氨化培養基中生長曲線示意圖。

圖3是本發明實施例提供的D2菌在硝化培養基中生長曲線示意圖。

圖4是本發明實施例提供的D2菌在DM培養基中生長曲線示意圖。

圖5是本發明實施例提供的D2菌于氨化培養基中脫氮性能曲線示意圖。

圖6是本發明實施例提供的D2菌于硝化培養基中脫氮性能曲線示意圖。

圖7是本發明實施例提供的D2菌于DM培養基中脫氮性能曲線示意圖。

圖8是本發明實施例提供的菌株種屬情況圖。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

下面結合附圖對本發明的應用原理作詳細的描述。

如圖1所示，本發明實施例提供的好氧反硝化菌的培養方法包括以下步驟：

S101：從養豬場的污泥中提取出菌種；

S102：在實驗室中采用平板畫線法進行純化；

S103：純化6-8代，得到目標菌種。

在步驟S102中純化采用了以下培養基：

氨化細菌分離培養基:NaCl 0.25g/L，蛋白胨5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，超純水1000mL，pH為7.2，在1×10⁵Pa滅菌20min。以2％(質量分數)的瓊脂糖做平板分離支持物。

硝化細菌分離培養基:

檸檬酸鈉7.66g/L，CaCl₂·H₂O 0.03g/L，FeSO₄·7H₂O 0.03g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，硫酸銨1.0g/L，磷酸氫二鉀1.0g/L，NaCl 0.3g/L，pH7.2-7.4。瓊脂20g/L；硫酸銨為實驗中氨氮的來源。

反硝化細菌分離培養基:

DM基礎培養基

KH₂PO₄1.5g/L；MgSO₄·7H₂O 0.01g/L；Na₂HPO₄7.9g/L；微量元素溶液2ml；去離子水1000mL；pH7.0-7.5；檸檬酸鈉5.66g/L；NaNO₃0.8415g/L。

微量元素溶液配方：EDTA(乙二胺四乙酸)50.0g，ZnSO₄2.2g，CaCl₂5.5g，MnCl₂·4H₂O5.06g，FeSO₄·7H₂O 5.0g，CuSO₄·5H₂O 1.57g，CoCl₂·6H₂O1.61g，溶解后用蒸餾水定容至1L，pH7.0。

BTB(溴甲基酚藍)培養基

在DM培養基的基礎上添加1mL BTB(1％溶解于酒精)和2.5％瓊脂，蒸餾水溶解并調節pH 7.0-7.3。

本發明喪失了提供的好氧反硝化菌應用于污水處理，具體方法為：

通過高分子材料對菌種進行包被，形成穩定結構，投入污水中進行氮的降解。

下面結合具體實施例對本發明的應用效果作詳細的描述。

實施例1

本發明實施例以武夷山養豬場廢水池活性污泥為材料，采用好氧反硝化菌培養基，純化出7株好氧反硝化菌。

利用氨化、硝化培養基鑒定出菌種具有氨化、硝化性能。測定D2菌在氨化、硝化和DM培養基三種生長環境中的菌種生長動力學曲線和脫氮性能曲線，近一步分析該菌的脫氮性能，該菌在三種培養基中總氮脫除率為22.50％、66.85％、55.40％。初步確定，D2菌具有獨立完成整個脫氮流程的能力。

D2菌在氨化培養基中生長曲線見圖2。

根據曲線可以看出D2菌在氨化培養基中從OD600大約在0.2的時候開始進入對數期，約6h后進入穩定期。由此曲線可以初步判斷D2菌的氨化性能良好。

D2菌在硝化培養基中生長曲線見圖3。

根據曲線可以看出D2菌在硝化培養基中從OD600大約在0.2的時候開始進入對數期，約24h進入穩定期。由此曲線可以初步判斷D2菌的硝化性能不如氨化性能反應劇烈，需要更長的時間才能進入平穩期。

D2菌在DM培養基中生長曲線見圖4。

根據曲線可以看出D2菌在DM培養基中從OD600大約在0.2的時候開始進入對數期，約21h進入穩定期。由此曲線可以初步判斷D2菌的反硝化性能不如氨化性能反應劇烈，需要較長的時間才能進入平穩期。

D2菌于氨化培養基中脫氮性能曲線見圖5。

根據NH₄⁺含量基不變，結合生長曲線可以推測D2菌的氨化性能穩定，并且氨化轉化速度較快。但是，NO₃^-含量起伏變化很大，初步推測氨化培養基中D2菌的硝化、反硝化性能受到了不同程度的限制。由于該菌為異養菌，推測有可能是跟碳源不斷減少有關系。

D2菌于硝化培養基中脫氮性能曲線見圖6。

根據圖中NH₄⁺含量平穩遞減，結合生長曲線中NH₄⁺含量曲線可以推測D2菌的硝化作用轉化作用性能穩定。但是，NO₃^-含量起伏變化很大，初步推斷硝培養基中D2菌的反硝化性能受到了不同程度的限制。由于該菌為異養菌，推測有可能是跟碳源不斷減少有關系。

D2菌于DM培養基中脫氮性能曲線見圖7。

根據圖中NO₃^-含量平穩遞減，結合DM培養基中D2生長曲線可以推測D2菌的反硝化轉化作用性能穩定。NO₃^-含量起伏變化很大，可以初步斷定為是碳源不足引起的。

D2菌于氨化、硝化和DM培養基中總脫氮率

接種后從0h開始，每隔12h取樣一次，氨化培養基取樣至24h，硝化培養基和DM培養基培養至36h，然后測總氮含量，并計算出脫氮率，結果如表1所示。

表1 D2菌12h、24h、36h總氮降解率

依據菌株的EzBioCloud檢索結果7株菌均為pseudomonas koreensis。其中，D2的相似度最高，為99.28，長度為1248bp。將D2菌株與3株功能相似菌株(通過查閱文獻選擇的具有異養硝化好氧反硝化性能的不同種屬的三株菌：FJ387168、KU140418、FJ897172)、3株相似度最高菌株(在數據庫中選取相似度最高的三株菌：HG764746、AF468452、AM293565)的16S rDNA一起構建系統發育樹。采用Mega7.0軟件的鄰位連接(Neighbour Joining，NJ)法構建系統發育樹分析該菌遺傳學特征，確定菌株的種屬情況以及其在遺傳學上的進化地位，結果如圖8所示。從圖中可能看出，該菌被分到pseudomonas屬下的一個分支，此結果與同源性比對結果相一致，可以判定該菌屬于假單胞菌屬。

性能比對

某些微生物(如固氮菌、硫細菌、氫細菌等)能利用空氣中分子態的氮或利用無機氮化物如銨鹽、硝酸鹽合成有機物。多數細菌則必須供給蛋白胨、氨基酸等有機氮化物才能生長。本實驗采用選擇性培養基，通過對氮源的控制來達到篩選具有相應功能的細菌。分別以硫酸銨、硝酸鈉為唯一氮源來篩選具有硝化性能和反硝化性能的細菌。在整個脫氮流程中，通過銨根離子、硝酸根離子這些介于兩種不同脫氮作用之間的轉折離子的濃度，來初步判斷該菌株的氨化、硝化、反硝化能力，以及初步推斷出這些作用的速度與其限制因素。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。