一種四重rt-pcr同時檢測多種大蒜病毒的方法及其引物組合的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種四重RT-PCR同時檢測多（10）種大蒜病毒的方法及其引物組合。具體采用四對引物，一次RT-PCR同時檢測大蒜主要病毒洋蔥黃矮病毒(OYDV),韭蔥黃條病毒(LYSV)，蔥潛隱病毒(SLV)以及青蔥X病毒屬病毒（Allexivirus，包括GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X和ShV-X）等多種大蒜病毒。因此，本發明一次檢測的病毒種類增多，檢測效率極大提高，檢測的成本極大降低。
【專利說明】—種四重RT-PCR同時檢測多種大蒜病毒的方法及其引物組合
【技術領域】
[0001]本發明屬于作物病毒檢測【技術領域】，具體涉及一種同時檢測多種大蒜病毒的方法及其引物組合。
【背景技術】
[0002]大蒜(Allium sativum L.)屬于百合科蔥屬植物,為無性繁殖作物。大蒜具有較高的營養價值，獨特的風味，是消費者喜食的調味品，在全世界廣泛種植，全球種植面積約為110萬hm2，總產約為1400萬t。隨著對大蒜藥用價值的研究和應用的深入，大蒜已經備受國際醫學界與消費者的青睞。現代醫學研究證明大蒜和天然大蒜制劑有非常好的防病治病功效，大蒜具有抗菌消炎、防癌抗癌，改善肝臟機能障礙，抗衰老、提高機體免疫力，降血脂、降血壓、防動脈硬化及血栓形成等功能。
[0003]大蒜的病毒病廣泛分布于世界各地，導致其產量減少和品質的降低。由于大蒜通過鱗莖進行無性繁殖，病毒在鱗莖里積累，癥狀越來越嚴重。大蒜能感染多種病毒，而且存在多種病毒的復合感染。常見的病毒有馬鈴薯病毒屬的洋蔥黃矮病毒(Onion yellowdwarf virus, OYDV)、韭蔥黃條病毒(Leek yellow stripe virus ，LYSV)和蔥黃條紋病毒(Shallot yellow stripe virus, SYSV)，香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)的大蒜普通潛隱病毒(Garlic common latent virus, GCLV),大蒜潛隱病毒(Garlic latent virus,GLV)和蔥潛隱病毒(Shallot latent virus, SLV),青蔥 X 病毒屬病毒(Allexivirus)的GarV-A、GarV-B、Ga;rV-C、Ga;rV-D、Ga;rV-E、GarV-X 和蔥病毒 X(shallot virus x , ShV-X)。Tsuneyoshi (Tsuneyoshi T, Matsumi T., Natsuaki K.Τ., Sumi S., 1998.Nucleotidesequence analysis of virus isolates indicates the presence of three potyvirusspecies in Allium plants.Archives of Virology 143:97-113.)證明 GLV 和 SLV 為同一種病毒；我國大蒜收獲面積為64萬hm2,產量為1050萬噸，占全球75%,但是我國脫毒大蒜種植面積較少，農民多進行留種，病毒感染嚴重；我國大蒜常見的病毒有洋蔥黃矮病毒(OYDV)，韭蔥黃條病毒(LYSV)，蔥潛隱病毒(SLV)和青蔥X病毒屬病毒(包括GarV_A、GarV-B, GarV-C, GarV-D, GarV-E, GarV-X和ShV-X)，而且普遍存在多種病毒復合侵染的現象，嚴重影響了大蒜的品質和產量。
[0004] 應用大蒜莖尖脫毒技術培育脫毒大蒜的研究很早就開始進行，并且都取得了一定的進展(海燕，康明輝，何寧，等.2006.大蒜莖尖脫毒及組織培養研究[J].河南農業科學，11:97-98 ;李昌華，李小川，趙美華，等.1 995.大蒜莖尖脫毒技術及組織培養研究[J].華北農學報，10 (3):20-25;于德才，李學湛，呂典秋，等.2005.大蒜莖尖脫毒及快繁研究[J].北方園藝，6:84-85 ;曲英華，高樹英明.2003.低溫處理對大蒜莖尖離體培養芽形成及生長的影響[J].中國農業大學學報，8 (4):24-26;許蕊.三種大蒜病毒的RT-PCR及多重RT-PCR檢測研究.碩士學位論文.甘肅農業大學，2012.)。在培育脫毒大蒜的過程中，需要對莖尖繁殖的大蒜進行病毒檢測，以確定病毒是否脫除。目前常用的植物病毒檢測方法有生物學方法又叫指示植物法、血清學方法又叫酶聯免疫法、電子顯微鏡法、反轉錄聚合酶鏈式反應(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT- PCR)。生物學方法測定耗時長、工作量大、靈敏度較差，不同病毒侵染后也常常表現出相似癥狀，顯癥反應也會受到復合侵染的影響；血清學檢測方法在一定范圍內可能出現假陰性和假陽性的現象，且對于檢測樣本較小的試驗來說，試劑盒的成本較高；生物學方法和血清學方法的每一次檢測只能針對單種病毒，檢測效率低。電鏡法對于病毒科或屬以下的分類不能判定，且設備昂貴，樣本數量不宜過大。而RT-PCR因其特異性最強、靈敏度最高，已成為當前病原檢測的首選方法，并廣泛應用于植物病毒檢測。對于多種病毒復合侵染，可以通過多重RT-PCR方法同時檢測多種病毒，可在短時間內檢測大量樣本，提高了檢測效率，降低了檢測成本，而且檢測成本低，是其他檢測方法所不能比擬的。但是大蒜病毒單重RT-PCR檢測研究較多，但多重RT-PCR研究較少。Majumder等(Majumder S., BaranwalV.K.and Joshi S.2008.Simultaneous detection of onion yellow dwarf virus andshallot latent virus in infected leavers and cloves of garlic by duplex RT-PCR? Journal of Plant Pathology, 90 (2)，371-374)建立了一種雙重 RT-PCR 同時檢測OYDV和SLV 2種病毒。許蕊等通過2個雙重RT-PCR，檢測了大蒜潛隱病毒(GLV)、韭蔥黃條病毒(LYSV)、 洋蔥黃矮病毒(OYDV)。雖然 PARK 等(Park KS, Bae YJ, Jung EJ, KangSJ.2005.RT-PCR-based detection of six garlic viruses and their phylogeneticrelationships.Journal of microbiology and biotechnology.15 (5):1110-1114.)用一個多重RT-PCR檢測GarV-X、0YDV、大蒜螨傳播的絲狀病毒(Garlic mite-bornefilamentous virus, GarMbFV)、LYSV、大蒜花葉病毒(Garlic mosaic virus, GarMV,經序列比對實為LYSV)、GLV等6種病毒，由于擴增片段長度分別為661、693、723、768、825、921bp，片段大小太接近，凝膠電泳后成像時661、693、723、768bp四個片段重疊在一起，也因片段大小太接近，無法根據電泳圖中的條帶大小判斷是何種病毒，給病毒檢測帶來不便，只有檢測GarV-X、GarMbFV、GarMV (LYSV),GLV的四重RT-PCR比較清楚，可以根據其片段大小，分別為661、723、825和921bp ;GarMbFV只是一個暫名病毒，這種病毒不常見，可能屬于青蔥X病毒屬。因此，Park建立的方法只能同時檢測常見病毒中的GarV-X、LYSV和GLV等病毒，而已經發現的青蔥X病毒屬病毒有7種,加上OYDV、LYSY和SLV病毒，常見的病毒有近10種。對經莖尖繁殖的大量大蒜種進行病毒檢測，需要RT-PCR檢測技術具有檢測的病毒種類多、檢測步驟簡單、準確、經濟等特點，現有大蒜病毒RT-PCR檢測技術存在的檢測病毒種類較少，片段區分較難等問題，而且由于病毒種類太多，很難建立十重RT-PCR來檢測這10種病毒。

【發明內容】

[0005]為提高RT-PCR檢測效率，降低檢測成本，本發明根據Genbank發布的這些病毒全基因組或部分序列的保守序列，設計通用引物，旨在建立一個簡單、高效、靈敏的四重RT-PCR檢測技術，同時檢測國內發現的大蒜主要病毒洋蔥黃矮病毒(0YDV)，韭蔥黃條病毒(LYSV)，大蒜潛隱病毒(GLV)或蔥潛隱病毒(SLV)、GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E,GarV-X和ShV-X等10種病毒，為研究國內大蒜病毒病流行情況及脫毒大蒜種的病毒檢測提供技術支撐。[0006]因而，本發明所要解決的技術問題是:針對大蒜病毒種類較多、現有RT-PCR檢測方法的不足，建立一種高效的四重RT-PCR大蒜病毒檢測方法，同時檢測10種大蒜病毒。
[0007]為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是:一種四重RT-PCR檢測多種大蒜病毒的方法，針對我國大蒜主要病毒的基因組保守序列設計4對通用引物，并建立四重RT-PCR反應體系和程序，同時檢測大蒜主要病毒洋蔥黃矮病毒(OYDV)，韭蔥黃條病毒(LYSV)，蔥潛隱病毒(SLV)以及青蔥X病毒屬病毒包括GarV-A、GarV-B, GarV-C, GarV-D,GarV-E> GarV-X和ShV-X等10種大蒜病毒。
[0008]根據Genbank發布的這些病毒全基因組或部分序列的保守序列，并根據四重RT-PCR產物大小不同的要求，設計了四對引物具體請見表1和SEQ ID N0.1至SEQ IDN0.8,其中引物對allexivirus-?和allexivirus-?為檢測青蔥X病毒屬病毒GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X和ShV-X等7種病毒的通用引物(圖1)，片段大小均在180bp左右。
[0009]表1四重RT-PCR檢測大蒜病毒的引物及其檢測的病毒
【權利要求】
1.一種四重RT-PCR同時檢測多種大蒜病毒的方法，其特征在于，其步驟包括: 1)取大蒜葉片，提取其RNA； 2)以步驟I)得到的RNA為模板，通過反轉錄，得到cDNA； 3)以步驟2)得到的cDNA為模板，用四對引物對其進行PCR擴增； 4)PCR產物凝膠電泳，根據目的片段大小及陽性對照，判斷病毒感染情況； 其中，所述引物如下: 青蔥X病毒屬病毒的引物為:正向引物如SEQ ID N0.1所示；反向引物如SEQ ID N0.2所示； 檢測洋蔥黃矮病毒的引物為:正向引物如SEQ ID N0.3所示；反向引物如SEQ ID N0.4所示； 檢測韭蔥黃條病毒的引物為:正向引物如SEQ ID N0.5所示；反向引物如SEQ ID N0.6所示； 檢測大蒜潛隱病毒和蔥潛隱病毒的引物為:正向引物如SEQ ID N0.7所示；反向引物如 SEQ ID N0.8 所示。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:四重PCR檢測的反應體系，按50μ I計:2Χ PCR mix 25 μ 1、模板(cDNA)4 μ 1、四對引物的正向引物和反向引物各2 μ 1、超純水補至所需體積。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于四重PCR檢測的PCR程序:92°C2min預變性后，40 個循環參數為，92°C 30s，42.5-45.6°C退火 30s，72°C lmin，最后 72°C IOmin0
4.按照權利要求1至3任一項所述的方法，其可以同時檢測國內發現的大蒜主要病毒洋蔥黃矮病毒(OYDV)，韭蔥黃條病毒(LYSV)，蔥潛隱病毒(SLV)、GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X 和 ShV-X。
5.一種用于四重RT-PCR同時檢測多種大蒜病毒的引物對組合，其特征在于:其由四對引物組合而成，所述引物分別如下: 青蔥X病毒屬病毒的引物為:正向引物如SEQ ID N0.1所示；反向引物如SEQ ID N0.2所示； 檢測洋蔥黃矮病毒的引物為:正向引物如SEQ ID N0.3所示；反向引物如SEQ ID N0.4所示； 檢測韭蔥黃條病毒的引物為:正向引物如SEQ ID N0.5所示；反向引物如SEQ ID N0.6所示； 檢測大蒜潛隱病毒和蔥潛隱病毒的引物為:正向引物如SEQ ID N0.7所示；反向引物如 SEQ ID N0.8 所示。
6.按照權利要求5所述的引物對組合，其可以用于同時檢測國內發現的大蒜主要病毒洋蔥黃矮病毒(OYDV)、韭蔥黃條病毒(LYSV)、蔥潛隱病毒(SLV)、GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X 和 ShV-X。
7.—種檢測青蔥X病毒屬病毒的引物對，其特征在于:正向引物如SEQ ID N0.1所示；反向引物如SEQ ID N0.2所示。
【文檔編號】C12N15/11GK103911461SQ201410092027
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月13日 優先權日:2014年3月13日
【發明者】胡新喜, 熊興耀, 雷艷, 汪沛, 何長征, 宋勇, 湯琳菲 申請人:湖南農業大學