一株海旋菌及κ-卡拉膠酶的制備方法
【專利摘要】本發明涉及一株海旋菌（Thalassospirasp.）fjfst-332，已于2013年12月25日在中國典型培養物保藏中心登記保藏，其保藏號為CCTCCM2013706，以及用該菌株發酵制備κ-卡拉膠酶的方法。本發明以該菌株作為菌種，采用碳源、氮源、無機鹽組成的發酵培養基，在優化后的培養條件下，κ-卡拉膠酶的活力達到80.6U/ml。發酵液通過硫酸銨鹽析，離心收集沉淀，后進行透析，取透析液過離子交換柱及凝膠柱，冷凍干燥即可獲得κ-卡拉膠酶干粉。
【專利說明】—株海旋菌及K-卡拉膠酶的制備【技術領域】
[0001]本發明屬于生物化工領域，涉及一株海旋菌及K -卡拉膠酶的制備方法。
【背景技術】
[0002]卡拉膠是由1，3-β -D-吡喃半乳糖和1，4- a -D-吡喃半乳糖作為基本骨架，交替連接而成的硫酸線性多糖，主要存在于紅藻綱中的麒麟菜屬、角叉菜屬、杉藻屬和沙菜屬等的細胞壁中。根據其二糖單元上所含的硫酸基團的數量和內醚環的有無，可將卡拉膠分為κ -、1-、Y -、λ -、ξ -、ω -和V -卡拉膠等類型，工業生產和使用的主要為κ -卡拉膠、1-卡拉膠和λ -卡拉膠3種。
[0003]卡拉膠是一種海藻硫酸半乳勻多糖，通過化學或生物手段降解和修飾后，獲得的半乳低聚糖硫酸醋及其衍生物具有多種生物活性如抗病毒、抗腫瘤、抗凝血等，對人體的細胞免疫和體液免疫功能也具有顯著的增強作用。研究顯示，卡拉膠及其低聚糖的生物學活性與分子量大小和硫酸根含量密切相關，一般認為，多糖分子量在5000-60000范圍具有明顯的生物活性，因此經降解后得到的卡拉膠低聚糖硫酸酷有可能成為新型海洋藥物的重要來源。
[0004]卡拉膠酶主要來源于假單胞菌Aewt/offlmas、卩遼纖維菌弧菌Vibrio、別單胞菌等。目前利用卡拉膠制備半乳低聚糖硫酸醋的方法主要依賴于化學法。由于化學降解方法存在反應條件不易控制、降解產率低、目的產物不易分離等無法克服的缺點，而酶解法可以最大程度地保護反應底物的活性基團不會在降解過程中受到破壞，從而為藥源開發奠定了良好的基礎。因此，通過從海藻物質或海洋生物中篩選可以產生卡拉膠酶的細菌成為了國內外的科技工作者的主要方向。
[0005]用微生物法獲得卡拉膠酶的研究已經有30余年的研究歷史，但迄今為止，僅有為數不多的幾種微生物被發現具有生物法制備卡拉膠酶的功能，包Pseudomonascarrageenovora (MeLean M W et.Journal of Biotechnology, 1979) > Cytophaga sp.1k一 C783 (Sarwar G et.Journal of Biotechnology, 7987) > Delesseria sanguines(Potin P et.Biotechnology and BioengineeringPseudoalteromonascarrageenovora (Miehel G et.Journal of Fermentation and Bioengineering, 1999) >Pseudoal teromonas porphyrae (劉光嘉,等海洋微生物多糖水解酶的基因克隆和高效表達，2012)等。因此篩選新的微生物菌種進行酶解法降解卡拉膠成為研究者的新任務。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一株能高效降解K -卡拉膠的菌株并用其制備K -卡拉膠酶的方法。 [0007]本發明的技術方案:一株篩選自卡拉膠加工廠廢石膏的細菌，可用于生產K-卡拉膠降解酶，其命名為海旋菌sp.)f jfst-332,已于2013年12月25日在中國典型培養物保藏中心登記保藏，其保藏號為CCTCC M 2013706，保藏地址為武漢大學。[0008]微生物菌株的篩選及鑒定:
本發明從卡拉膠加工廠取卡拉膠廢渣進行卡拉膠降解菌的篩選。將卡拉膠廢渣用海水(3%海鹽配置)浸泡2d，取上清液加入富集培養基中5°C，160r/min搖床培養3d后，重復操作3次，取0.1ml富集培養也涂布初篩分離培養基28°C倒置培養48h，挑取周圍形成明顯透明圈和凹坑的菌落劃線初篩培養基，培養48h后，挑取單菌落移接傳代培養基斜面，獲得卡拉膠降解菌純培養。純種接到發酵培養液種32°C，160r/min培養2d后檢測培養液中κ -卡拉膠酶的活力，最終篩選出目標菌株Β-332對其進行生理生化鑒定和16s rDNA序列分析，確定其為海旋菌sp.),擬命名為海旋菌sp.)fjfst_332。
[0009]用所述的海旋菌sp.) f jfst-332生產K-卡拉膠酶的方法步驟包括如下: ①將海旋菌sp.) fjfst-332接種到產酶培養基中，250ml三角瓶裝30ml產酶培養基，按常規方法滅菌、冷卻并接種菌落，32°C、160r/min搖床培養24h后，取Iml培養液再次接種產酶培養基，32°C、160r/min搖床培養56h，發酵液離心(5000r/min, IOmin)去除沉淀,取上清液；
②用250ml三角瓶裝20ml只含質量分數為0.5% κ -卡拉膠底物的培養基，按常規方法滅菌、冷卻并接種Iml上清發酵酶液，于32°C反應lh，得到含κ -卡拉膠酶的發酵液；
③將發酵培養基經過4°C，8000-10000g冷凍離心10-20min之后，取上清液；
④將上清液加入質量分數為60%-80%的飽和硫酸銨，加入后繼續攪拌lh，放置冰箱沉降過夜，4°C，8000-10000g離心20-40min取沉淀；
⑤沉淀置于蒸餾水中透析48h，冷凍干燥后得到粗酶粉，_20°C保存；
⑥粗酶用0.02mo/L pH7.5的Tris-HCI緩沖液溶解，濾紙過濾除去不溶性雜質，經陰離子交換色譜 Q-sepharose Fast Flow 分離，用含有 0.1~0.6mol/L NaCI 的 0.05mol/LpH7.2的Tris-HCI緩沖液進行連續梯度洗脫，流速為1.2ml/min,于280nm檢測洗脫液中的蛋白質含量，分布收集洗脫液，4.5ml/管，測定峰位的酶活；
⑦將試管中有活性的部分合并進行冷凍干燥，即成κ-卡拉膠酶半成品；
⑧將Sephcryl S-100 凝膠過濾層析柱(Φ 1.6cm*80cm)用緩沖液(0.02mol/L,pH7.5的Tris-HCl)平衡后，秤取κ -卡拉膠酶半成品0.05g溶于4mL平衡緩沖液中，6000g低溫離心20min后取上清液上層析柱。用緩沖液(0.02mol/L,pH7.5的Tris-HCl)進行洗脫，控制流速為0.lml/min，洗脫液經紫外檢測并分部收集，4ml/管，分別測定出峰部分試管的酶活，將有活力的部分合并，經充分透析脫鹽后，超濾膜濃縮，對濃縮液冷凍干燥，得到κ -卡拉膠酶成品。
[0010]所述產酶培養基:氯化鈉15g、K -卡拉膠2g、酵母膏lg、無機鹽母液100ml、水900ml、pH7.5，其中無機鹽母液=NaNO3 20g、MgS04.7H20 5g,K2HPO4 IOgXaCl2 lg、蒸餾水 1L。
[0011]步驟②所述培養基:K -卡拉膠5g，蒸餾水1000ml，pH7.5。
[0012]用該方法生產的κ -卡拉膠酶的檢測方法:
取步驟③得到含有κ -卡拉膠酶的發酵液上清液lmL，加入20mL的卡拉膠底物(其中含有0.5%卡拉膠)，置于32°C酶解lh，后加入1.0mLDNS,沸水浴5min。冷卻至室溫后，用蒸餾水補齊刻度，使用分光光度計在540nm下進行檢測。IU定義為Imin產生Iug卡拉膠寡糖的值。[0013]本發明的有益效果:
①新篩選出一株能高效生產κ -卡拉膠酶的菌株，分類命名為海旋菌(Thalassospira sp.) fjfst—332。
[0014]②本發明以該菌作為菌種，以常見碳源，氮源，無機鹽組成的發酵培養基，可以在48-60h內達到最大酶產量，酶活為80.6U/ml。
【具體實施方式】
[0015]以下是說明本發明的具體實施例，但本發明并不限于此。
[0016]實施例1
取自卡拉膠加工廠的卡拉膠廢渣進行卡拉膠降解菌的篩選。將卡拉膠廢渣用海水(3%海鹽配置)浸泡2d，取上清液加入富集培養基中5°C，160r/min搖床培養3d后，重復操作3次，取0.1ml富集培養也涂布初篩分離培養基28°C倒置培養48h，挑取周圍形成明顯透明圈和凹坑的菌落劃線初篩培養基，培養48h后，挑取單菌落移接傳代培養基斜面，獲得卡拉膠降解菌純培養。純種接到發酵培養液種32°C，160r/min培養2d后檢測培養液中κ -卡拉膠酶的活力，最終篩選出目標菌株Β-332。
[0017]實施例2
經形態學和生理生化特性研究，Β-332菌株的特征如下:
菌落形態:菌落呈現圓形，表面凹陷、粘連，邊緣整齊。
[0018]細胞形態:此為革蘭氏陰性菌，形態為桿狀。
[0019]生理生化特征:為需氧菌，分解葡萄糖，乳糖及蔗糖，能液化明膠。
[0020]對該菌株的16S rRNA基因進行PCR擴增與序列測定，發現其16S rRNA的基因部分片斷長度為1487bp，經過NCBI和核糖體數據庫進行比對，鑒定為海旋菌
sp.),擬命名為海旋菌sp.) f jfst-332,菌株的16S rRNA序列具體可見序列表。
[0021]實施例3
①將海旋菌sp.) fjfst-332接種到產酶培養基中，250ml三角瓶裝30ml產酶培養基，按常規方法滅菌、冷卻并接種菌落，32°C、160r/min搖床培養24h后，取Iml培養液再次接種產酶培養基，32°C、160r/min搖床培養56h。發酵液離心(5000r/min, IOmin)去除沉淀,取上清液。所述產酶培養基:氯化鈉15g、κ -卡拉膠2g、酵母膏lg、無機鹽母液100ml、水900ml、ρΗ7.5。
[0022]②[無機鹽母液:NaNO320g、MgS04.7H20 5g、K2HP04 IOgXaCl2 lg;蒸餾水 1L]。
[0023]③用250ml三角瓶裝20ml只含質量分數為0.5% κ -卡拉膠底物的培養基，按常規方法滅菌、冷卻并接種Iml上清發酵酶液。于32°C反應lh，得到含κ-卡拉膠酶的發酵液并測其酶活。所述培養基:κ -卡拉膠5g，蒸餾水1000ml，pH7.5。
[0024]該實施例所得的瓊膠酶的活力為80.6U/mL。
[0025]實施例4
①.將海旋菌sp) fjfst-332接種到產酶培養基中，250ml三角瓶裝30ml產酶培養基，按常規方法滅菌、冷卻并接種菌落，32°C、160r/min搖床培養24h后，取Iml培養液再次接種產酶培養基，32°C、160r/min搖床培養56h，發酵液離心(5000r/min, IOmin)去除沉淀,取上清液。所述產酶培養基:氯化鈉15g、κ -卡拉膠2g、酵母膏lg、無機鹽母液100ml、水900ml、ρΗ7.5。
[0026]無機鹽母液=NaNO320g、MgSO4.7H20 5g、K2HPO4 10g、CaCl2 lg、蒸餾水 1L。
[0027]②.用250ml三角瓶裝20ml只含質量分數為0.5% κ -卡拉膠底物的培養基，按常規方法滅菌、冷卻并接種Iml上清發酵酶液，于32°C反應lh，得到含κ -卡拉膠酶的發酵液，所述培養基:κ -卡拉膠5g，蒸餾水1000ml，pH7.5。
[0028]③.將發酵培養基經過4°C，8000_10000g冷凍離心10_20min之后，取上清液。
[0029]④.將上清液加入質量分數為60%_80%的飽和硫酸銨，加入后繼續攪拌lh，放置冰箱沉降過夜，40C，8000-10000g離心20-40min取沉淀；
⑤.沉淀置于蒸餾水中透析48h，冷凍干燥后得到粗酶粉，_20°C保存；
⑥.粗酶用0.02mo/L pH7.5的Tris-HCI緩沖液溶解，濾紙過濾除去不溶性雜質，經陰離子交換色譜 Q_sepharose Fast Flow 分離，用含有 0.1~0.6mol/L NaCI 的 0.05mol/LpH7.2的Tris-HCI緩沖液進行連續梯度洗脫，流速為1.2ml/min,于280nm檢測洗脫液中的蛋白質含量，分布收集洗脫液，4.5ml/管，測定峰位的酶活；
⑦.將試管中有活性的部分合并進行冷凍干燥，即成κ-卡拉膠酶半成品。
[0030]⑧.將Sephcryl S-100 凝膠過濾層析柱(Φ 1.6cm*80cm)用緩沖液(0.02mol/L,pH7.5的Tris-HCl)平衡后，秤取κ -卡拉膠酶半成品0.05g溶于4mL平衡緩沖液中，6000g低溫離心20min后取上清液上層析柱。用緩沖液(0.02mol/L, pH7.5的Tris-HCl)進行洗脫，控制流速為0.lml/min。洗脫液經紫外檢測并分部收集(4ml/管)，分別測定出峰部分試管的酶活，將有活力的部分合并，經充分透析脫鹽后，超濾膜濃縮，對濃縮液冷凍干燥，得到κ -卡拉膠酶成品。
【權利要求】
1.一株海旋菌，其特征在于:所述菌株為海旋菌sp.) f jfst-332,已于2013年12月25日在中國典型培養物保藏中心登記保藏，其保藏號為CCTCC M 2013706。
2.根據權利要求1所述的一株海旋菌，其特征在于:所述海旋菌sp.)f jfst-332 的 16S rRNA 序列如 SEQ ID N0.1 所示。
3.一株如權利要求1所述的一株海旋菌的用途，其特征在于:用于制備K-卡拉膠酶。
4.一株如權利要求1所述的一株海旋菌用于制備K -卡拉膠酶的方法,其特征在于:包括如下步驟: ①.將海旋菌sp)fjfst-332接種到產酶培養基中，250ml三角瓶裝30ml產酶培養基，按常規方法滅菌、冷卻并接種菌落，32°C、160r/min搖床培養24h后，取Iml培養液再次接種產酶培養基，32°C、160r/min搖床培養56h，發酵液5000r/min離心，IOmin去除沉淀,取上清液； ②.用250ml三角瓶裝20ml只含質量分數為0.5% κ -卡拉膠底物的培養基，按常規方法滅菌、冷卻并接種1ml上清發酵酶液，于32°C反應lh，得到含κ-卡拉膠酶的發酵液，所述培養基:κ -卡拉膠5g，蒸餾水1000ml, PH7.5 ； ③.將發酵培養基經過4°C，8000-10000g冷凍離心10-20min之后，取上清液； ④.將上清液加入質量分數為60%-80%的飽和硫酸銨，加入后繼續攪拌lh，放置冰箱沉降過夜,40C，8000-10000g 離心 20-40min 取沉淀； ⑤.沉淀置于蒸餾水中透析48h，冷凍干燥后得到粗酶粉，_20°C保存； ⑥.粗酶用0.02mo/L pH7.5的Tris-HCI緩沖液溶解，濾紙過濾除去不溶性雜質，經陰離子交換色譜 Q-sepharose Fast Flow 分離，用含有 0.1~0.6mol/L NaCI 的 0.05mol/LpH7.2的Tris-HCI緩沖液進行連續梯度洗脫，流速為1.2ml/min,于280nm檢測洗脫液中的蛋白質含量，分布收集洗脫液，4.5ml/管，測定峰位的酶活； ⑦.將試管中有活性的部分合并進行冷凍干燥，即成κ-卡拉膠酶半成品； ⑧.將S印hcrylS-100凝膠過濾層析柱用0.02mol/L,pH7.5的Tris-HCl緩沖液平衡后，秤取κ -卡拉膠酶半成品0.05g溶于4mL平衡緩沖液中，6000g低溫離心20min后取上清液上層析柱，用0.02mol/L,pH7.5的Tris-HCl緩沖液進行洗脫，控制流速為0.lml/min,洗脫液經紫外檢測并分部收集，4ml/管，分別測定出峰部分試管的酶活，將有活力的部分合并，經充分透析脫鹽后，超濾膜濃縮，對濃縮液冷凍干燥，得到κ -卡拉膠酶成品。
5.根據權利要求4所述的一株綠膿桿菌用于制備κ-卡拉膠酶的方法，其特征在于:所述產酶培養基:氯化鈉15g、κ -卡拉膠2g、酵母膏lg、無機鹽母液100ml、水900ml、ρΗ7.5，其中無機鹽母液=NaNO3 20g、MgSO4.7H20 5g、K2HPO4 10g、CaCl2 lg、蒸餾水 IL0
6.根據權利要求4所述的一株綠膿桿菌用于制備κ-卡拉膠酶的方法，其特征在于:步驟②所述培養基:κ -卡拉膠5g，蒸餾水1000ml，pH7.5。
【文檔編號】C12N1/20GK103898013SQ201410093130
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月14日 優先權日:2014年3月14日
【發明者】張龍濤, 郭娟娟, 曾紹校, 鄭寶東, 張怡, 曾誠, 黃旭輝 申請人:福建農林大學