專利名稱：含有胃促胰酶抑制劑作為有效成分的預(yù)防和治療皮炎的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胃促胰酶抑制劑的醫(yī)藥應(yīng)用，更具體地說，是涉及一種預(yù)防或治療皮炎的藥物，該藥物含胃促胰酶抑制劑作為有效成分。
背景技術(shù)：
炎性反應(yīng)由細(xì)菌、病毒和其它病原體以及由損傷、外源性物質(zhì)等引起。它們是免疫反應(yīng)，其中粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞排除病原體或受傷組織或外源性物質(zhì)。皮炎是一種皮膚的急性或慢性炎癥，具體而言，一個(gè)主要問題是近些年特應(yīng)性皮炎顯著增多。
特應(yīng)性皮炎是一種慢性疾病，其主要癥狀伴隨發(fā)癢的濕疹，同時(shí)觀察到癥狀加重或減輕交替發(fā)生的現(xiàn)象。在多數(shù)情況下，患者或其家族有蕁麻疹、變應(yīng)性鼻炎及支氣管哮喘和其它變應(yīng)性疾患的病史(變應(yīng)臨床免疫學(xué)雜志(J.Allergy Clin.Immunol.)104，S123，1999)。特應(yīng)性皮炎的癥狀多樣，其原因仍不清楚，據(jù)認(rèn)為該疾病主要由下列物質(zhì)引起多種天然物質(zhì)，包括蜱、毛發(fā)、羽毛、細(xì)菌和霉菌；或者食品，包括蛋類、牛奶；或者合成產(chǎn)品，包括化學(xué)纖維和清潔劑等。還有人指出由于干性皮膚導(dǎo)致的皮膚屏障功能障礙在特應(yīng)性皮炎中扮演著重要角色。
特應(yīng)性皮炎發(fā)生的機(jī)理尚不清楚。據(jù)認(rèn)為，與IgE和肥大細(xì)胞有關(guān)的I型變態(tài)反應(yīng)(直接變態(tài)反應(yīng))在特應(yīng)性皮炎中起著重要作用，因?yàn)樵摷膊∈菍?duì)一系列抗原的過敏反應(yīng)之一，患者或其家族有時(shí)也患有其它變應(yīng)性疾病，在許多情況下觀察到血清IgE水平升高。但是，抑制I型變態(tài)反應(yīng)的抗變應(yīng)性藥物對(duì)特應(yīng)性皮炎無效或不顯示治療作用，這表明I型反應(yīng)與該病的發(fā)病機(jī)理僅有部分關(guān)系。
另一方面，據(jù)報(bào)道，當(dāng)與變應(yīng)原接觸時(shí)，特應(yīng)性皮炎患者表現(xiàn)出雙相皮膚反應(yīng)(J.Allergy Clin.Immunol.101，222，1998)。例如，在對(duì)動(dòng)物皮內(nèi)給予抗原，如Ascalis提取物的情況下，觀察到了雙相皮膚反應(yīng)，所述動(dòng)物是對(duì)該相同抗原敏感的(免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)131，1096，1983)。第一個(gè)反應(yīng)，稱為早期反應(yīng)，在抗原誘發(fā)后1小時(shí)達(dá)到高峰。第二個(gè)反應(yīng)，即晚期反應(yīng)，在8-24小時(shí)后顯示最強(qiáng)反應(yīng)(Biol.Pharm.Bull.18，239，1995)。早期反應(yīng)可被組胺受體拮抗劑抑制，表明該反應(yīng)是由IgE和肥大細(xì)胞誘發(fā)的。相反，對(duì)晚期反應(yīng)的機(jī)制還不清楚，但其特征是皮膚中嗜酸性粒細(xì)胞的顯著浸潤(國際變應(yīng)免疫學(xué)通訊(Int.Arch.Allergy Immunol.)113，196，1997)，這是在特應(yīng)性皮炎患者中觀察到的典型組織學(xué)特征(美國科學(xué)院皮膚病學(xué)雜志(J.Am.Acad.Dermatol.)24，1101，1991)。另外，已知特應(yīng)性皮炎患者的嚴(yán)重性與血清ECP(嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白)水平和周圍嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量有關(guān)(藥物(Medicina)34，220，1997)。再者，在最近幾年，有人指出特應(yīng)性皮炎的臨床癥狀與被劃分為IV型變態(tài)反應(yīng)的接觸性皮炎非常相似(Medicina 34，220，1997)。這些發(fā)現(xiàn)提示我們IV型變態(tài)反應(yīng)可能與該疾病的發(fā)病機(jī)理有關(guān)。
一般認(rèn)為，作為IV型變態(tài)反應(yīng)代表的接觸性過敏反應(yīng)是由于對(duì)小鼠使用半抗原，如DNFB(二硝基氟苯)引起的，該小鼠是曾經(jīng)用DNFB半抗原致敏過的，但最近報(bào)道當(dāng)對(duì)皮膚重復(fù)使用此類半抗原時(shí)，除誘發(fā)IV型變態(tài)反應(yīng)外，還誘發(fā)I型變態(tài)反應(yīng)(皮膚病學(xué)研究雜志(J.Invest.Dermatol.)105，749，1995)。例如，通過重復(fù)應(yīng)用半抗原，血液IgE水升高，并且重復(fù)半抗原刺激時(shí)，反應(yīng)的時(shí)間過程移向I型變態(tài)反應(yīng)。在這類動(dòng)物模型中，對(duì)半抗原刺激的暫時(shí)性反應(yīng)和皮膚厚度基準(zhǔn)，半抗原刺激前的厚度都逐漸增加，這看起來似乎是慢性皮炎的特征。通過這些發(fā)現(xiàn)認(rèn)為，重復(fù)使用半抗原誘發(fā)的皮炎可作為特應(yīng)性皮炎的動(dòng)物模型(Anitex 10，23，1998)。
最近，據(jù)報(bào)道NC/Nga小鼠自發(fā)地發(fā)生了類似于特應(yīng)性皮炎的皮炎(國際免疫學(xué)(Int.Immunol.)9，461，1997)。以常規(guī)方式在沒有特定病原體的環(huán)境中喂養(yǎng)的NC/Nga小鼠在約七-八周齡后開始出現(xiàn)明顯的搔癢行為和紅斑，隨后出現(xiàn)皮膚出血、瘢痕和潰瘍。進(jìn)一步地說，它們表現(xiàn)出與人類特應(yīng)性皮炎的臨床觀察類似的癥狀，例如皮膚干燥或增厚。其它種系的小鼠，如BALB/c不患有類似的皮炎，即使將它們與NC/Nga小鼠共同室喂養(yǎng)的情況下，這提示我們認(rèn)為該種皮炎是NC/Nga小鼠所特有的(最新醫(yī)藥(Latest Medicine)，53，2848，1998)。此外，在沒有特定病原體(SPF)的環(huán)境下飼養(yǎng)這些小鼠時(shí)，絲毫沒有觀察到皮膚異常，這表明某些環(huán)境因素可能與這些小鼠皮炎的發(fā)作有關(guān)。當(dāng)對(duì)在SPF環(huán)境下飼養(yǎng)的NC/Nga小鼠重復(fù)涂以半抗原時(shí)，在致敏的開始階段僅產(chǎn)生所謂接觸性皮炎的延遲性過敏反應(yīng)，但隨著致敏作用增強(qiáng)，觀察到了類似特應(yīng)性皮炎的癥狀(CRJ Letters 11，1，1998)。因此，雖然對(duì)造成這些小鼠自發(fā)性皮炎的天然性刺激物尚不清楚，但十分清楚的是，與自然環(huán)境中某些種類的抗原重復(fù)接觸是一個(gè)重要因素。因此，作為由于與存在于空氣中的變應(yīng)原重復(fù)接觸引起的自發(fā)性特應(yīng)性皮炎模型，這些小鼠是非常有用的。
治療特應(yīng)性皮炎最有效的藥物是激素軟膏(J.Allergy Clin.Immunol.104，S123，1999)。但是，使用這類激素軟膏需要根據(jù)用藥部位和時(shí)間謹(jǐn)慎地選擇使用的藥物。如果使用方法不適當(dāng)，不會(huì)產(chǎn)生明顯效果或者癥狀反而加重了。另外，當(dāng)長期使用激素軟膏時(shí)，會(huì)出現(xiàn)副作用，如萎縮和酒糟鼻。還有，如果中途停用這類藥物，有時(shí)會(huì)觀察到反彈現(xiàn)象，即皮膚癥狀明顯加重。
除激素軟膏外，組胺拮抗劑和抗變應(yīng)性藥物也已用于治療特應(yīng)性皮炎。組胺拮抗劑可有效消除瘙癢，但不能治愈該病?？棺儜?yīng)性藥物，如曲尼司特、酮替芬、奧沙米特和氮卓斯汀對(duì)特應(yīng)性皮炎的癥狀沒有療效，即使有，作用也較弱。據(jù)認(rèn)為，這是由于這些藥物對(duì)I性變態(tài)反應(yīng)具有抑制作用，因而對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞或IC型變態(tài)反應(yīng)的作用幾乎沒有作用(日本藥理學(xué)雜志(Jap.J.Pharmacol.)63，73，1993，Jap.J.Pharmacol.51，93，1989)。最近，tacrolimus(一種免疫抑制劑)軟膏已被開發(fā)為治療特應(yīng)性皮炎的藥物(J.Allergy Clin.Immunol.104，S126，1999)，但不能避免由于這種藥物對(duì)免疫反應(yīng)抑制作用導(dǎo)致的各自副作用?？傊F(xiàn)有的藥物，無論在效力和副作用方面都很難說是十分令人滿意的，因此，仍需要開發(fā)更高效和安全的藥物。
另一方面，胃促胰酶是一種貯藏在肥大細(xì)胞顆粒中的絲氨酸蛋白酶，并廣泛地存在于各自組織，如皮膚、心臟、血管壁、小腸等中(免疫學(xué)和生物學(xué)中的肥大細(xì)胞蛋白酶(Mast cell protease in Immunolgy andBiology)；Caughey，G.H.，Ed；Marcel Dekker，Inc.；New York，1995))。很久以前曾報(bào)道胃促胰酶作用于大鼠腹膜肥大細(xì)胞并引起脫粒(J.Immunol.136，3812，1986)，胃促胰酶抑制劑抑制Ig-E介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫粒(國際生物化學(xué)(Biochem.Int.)10，863，1985)，還有人指出胃促胰酶與肥大細(xì)胞的功能有關(guān)。最近報(bào)道對(duì)小鼠和豚鼠施以人胃促胰酶引發(fā)包括嗜酸性粒細(xì)胞在內(nèi)的白細(xì)胞浸潤(英格蘭藥理學(xué)雜志(Br.J.Pharmacol.)125，1491，1998)，人胃促胰酶作用于IL-1β(白介素1β)并將其轉(zhuǎn)化為活化型IL-1β(J.Exp.Med.174，821，1991)，以及人胃促胰酶具有部分消化膜結(jié)合的干細(xì)胞因子(SCF)并將其轉(zhuǎn)化為可溶性SCF的功能(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94，9017，1997)等。這些發(fā)現(xiàn)表明胃促胰酶在變態(tài)反應(yīng)性疾病，如特應(yīng)性皮炎中可能具有某種作用。但是，還不能說通過這些研究就已經(jīng)闡明了胃促胰酶的病生理學(xué)作用。目前，為搞清胃促胰酶在各自疾病中的作用和胃促胰酶抑制劑作為藥物的可能性，正在積極地研究可抑制體內(nèi)胃促胰酶活性的物質(zhì)。
已經(jīng)報(bào)道了一些胃促胰酶抑制劑，例如低分子量胃促胰酶抑制劑，如教科書中給出的(蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitors)；Barrett等編；Elssevier Science B.V.；Amsterdam，196)；報(bào)道為肽類抑制劑的α-酮酸衍生物(WO 93-25574，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA，1995，92，6738)；α，α-二氟-β-酮酸衍生物(日本未審專利申請(qǐng)(公開)9-124691)；三肽抑制劑(WO 93-03625)；磷酸衍生物(Oleksyszyn等，生物化學(xué)(Biochemistry)30，485，1991)；肽類抑制劑，如三氟甲基酮衍生物(WO 96-33974，日本未審專利申請(qǐng)(公開)10-53579)和乙酰胺衍生物(日本未審專利申請(qǐng)(公開)10-7661，日本未審專利申請(qǐng)(公開)10-53579，日本未審專利申請(qǐng)(公開)11-246437，WO 99-41277，WO98-18794，WO96-39373)；非肽類抑制劑，如三嗪衍生物(日本未審專利申請(qǐng)(公開)8-208654和日本未審專利申請(qǐng)(公開)10-245384)；苯酚酯衍生物(日本未審專利申請(qǐng)(公開)10-87567)；頭孢烯衍生物(日本未審專利申請(qǐng)(公開)10-87493)；異噁唑衍生物(日本未審專利申請(qǐng)(公開)11-1479)；咪唑烷衍生物(WO96-04248)；乙內(nèi)酰脲衍生物(日本未審專利申請(qǐng)(公開)9-31061)；喹唑啉衍生物(WO97-11941)等，但仍沒有確立用抑制胃促胰酶活性為治療策略的令人滿意的藥物或治療方法。
發(fā)明公開本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)防或治療皮炎，如特應(yīng)性皮炎的無副作用的安全性藥物，所述皮炎表現(xiàn)出雙相皮膚反應(yīng)或是由于重復(fù)接觸抗原誘發(fā)的，所述藥物抑制該適應(yīng)癥的發(fā)展并改善患者的生活質(zhì)量。
本發(fā)明者通過深入研究，注意到特應(yīng)性皮炎表現(xiàn)出雙相皮膚反應(yīng)并且晚期反應(yīng)在該適應(yīng)癥中起重要作用的事實(shí)。結(jié)果，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)胃促胰酶抑制劑可用于緩解皮炎的雙相皮膚反應(yīng)的晚期反應(yīng)，且甚至可有效對(duì)抗由于重復(fù)接觸抗原引起的皮炎，因此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供一種預(yù)防或治療表現(xiàn)出雙相皮膚反應(yīng)的皮炎的藥物，它含有胃促胰酶抑制劑作為有效成分。
本發(fā)明還提供一種緩解表現(xiàn)出雙相皮膚反應(yīng)的皮膚的晚期反應(yīng)的藥物，它含有胃促胰酶作為有效成分。
本發(fā)明還提供一種預(yù)防或治療的由于重復(fù)接觸抗原誘發(fā)的皮炎的藥物，它含有胃促胰酶作為有效成分。
本發(fā)明提供一種預(yù)防或治療表現(xiàn)出雙相皮膚反應(yīng)的皮炎的藥物組合物，它含有緩解晚期反應(yīng)量的胃促胰酶作為有效成分和可藥用賦形劑。
附圖的簡要說明附

圖1是實(shí)施例2中蛔蟲屬誘導(dǎo)的小鼠雙相皮膚反應(yīng)的皮膚反應(yīng)-時(shí)間過程圖。
附圖2A、2B和2C表示實(shí)施例3中胃促胰酶抑制劑(附圖2A)和對(duì)照藥物潑尼松龍(附圖2B)和苯海拉明(附圖2C)對(duì)蛔蟲屬(Ascaris)引發(fā)的雙相皮膚反應(yīng)的作用的圖。
附圖3A和3B表示實(shí)施例4中當(dāng)對(duì)小鼠皮內(nèi)施以人胃促胰酶(附圖3A)或組胺(附圖3B)時(shí)的皮膚反應(yīng)-時(shí)間過程圖。
附圖4A和4B表示實(shí)施例4中當(dāng)對(duì)小鼠皮內(nèi)施以人胃促胰酶時(shí)皮膚反應(yīng)的胃促胰酶劑量-依賴性圖(附圖4A，施用胃促胰酶后1小時(shí)；附圖4B，施用胃促胰酶后16小時(shí))。
附圖5表示實(shí)施例5中加熱處理對(duì)人胃促胰酶對(duì)誘發(fā)皮炎的作用的影響的圖。
附圖6A-6E表示實(shí)施例6中由皮內(nèi)注射人胃促胰酶誘發(fā)的皮炎的組織學(xué)分析照片，其中附圖6A是正常小鼠；附圖6B是由蛔蟲提取物誘發(fā)的皮炎(1小時(shí)后)；附圖6C是由蛔蟲提取物誘發(fā)的皮炎(24小時(shí)后)；附圖6D是由人胃促胰酶誘發(fā)的皮炎(1小時(shí)后)；附圖6E是由人胃促胰酶誘發(fā)的皮炎(24小時(shí)后)。
附圖7A和7B表示實(shí)施例7中對(duì)缺乏肥大細(xì)胞的小鼠皮內(nèi)施用人胃促胰酶時(shí)的皮膚反應(yīng)圖(附圖7A，1小時(shí)后的反應(yīng)；附圖7B，16小時(shí)后的反應(yīng))。
附圖8A表示實(shí)施例8中人胃促胰酶對(duì)人多形核白細(xì)胞(PMN)遷移的體外影響的濃度依賴性的圖。附圖8B是表示實(shí)施例8中胃促胰酶抑制劑對(duì)胃促胰酶誘發(fā)的PMN遷移的影響圖。
附圖9表示實(shí)施例9中通過重復(fù)應(yīng)用半抗原誘發(fā)的皮炎中的耳的厚度增加的時(shí)間過程圖。
附圖10表示實(shí)施例9中通過重復(fù)應(yīng)用半抗原誘發(fā)的皮炎中的耳中胃促胰酶樣活性的變化圖。
附圖11A-11D表示實(shí)施例10中胃促胰酶抑制劑對(duì)通過重復(fù)應(yīng)用半抗原誘發(fā)的皮炎的作用(附圖11A是對(duì)照藥物潑尼松龍；附圖11B-附圖11D分別是化合物35、化合物34和化合物18)。
附圖12表示實(shí)施例11中胃促胰酶抑制劑對(duì)通過重復(fù)應(yīng)用半抗原誘發(fā)的皮炎中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量增多的影響作用圖。
附圖13表示實(shí)施例12中胃促胰酶抑制劑對(duì)通過重復(fù)應(yīng)用半抗原誘發(fā)的皮炎中肥大細(xì)胞數(shù)量增多的影響作用圖。
附圖14A、14B和14C分別表示實(shí)施例12中胃促胰酶抑制劑對(duì)通過重復(fù)應(yīng)用半抗原誘發(fā)的皮炎中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量增多的影響的照片。
附圖15表示實(shí)施例13中當(dāng)給小鼠重復(fù)皮內(nèi)注射人胃促胰酶時(shí)，皮膚厚度變化的時(shí)間過程圖。
附圖16表示實(shí)施例4中當(dāng)給小鼠重復(fù)皮內(nèi)注射人胃促胰酶時(shí)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量增多的時(shí)間過程圖。
附圖17表示實(shí)施例15中當(dāng)給小鼠重復(fù)皮內(nèi)注射人胃促胰酶時(shí)組胺含量變化的時(shí)間過程圖。
附圖18A和18B是實(shí)施例16中當(dāng)給小鼠重復(fù)皮內(nèi)注射人胃促胰酶時(shí)的SCF表達(dá)的免疫組織分析的代表性照片(附圖18A是正常皮膚；附圖18B是注射了胃促胰酶的)。
附圖19是實(shí)施例17中人胃促胰酶在體外對(duì)人角化細(xì)胞中SCF表達(dá)的影響圖。
附圖20A和20B表示實(shí)施例18中胃促胰酶抑制劑對(duì)NC/Nga小鼠的臨床皮膚評(píng)分的影響圖。附圖20A是在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)；附圖20B是開始施用胃促胰酶后35天。
附圖21表示實(shí)施例18中胃促胰酶抑制劑對(duì)NC/Nga小鼠的組織學(xué)評(píng)分的影響圖。
附圖22A和22B表示實(shí)施例18中胃促胰酶抑制劑對(duì)NC/Nga小鼠中皮膚肥大細(xì)胞數(shù)量的影響圖。
附圖23A和23B表示實(shí)施例18中胃促胰酶抑制劑對(duì)NC/Nga小鼠中皮膚嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量的影響圖。圖23A，耳；圖23B，背部。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式通過本領(lǐng)域普通專業(yè)人員可使用的方法，選擇能夠表現(xiàn)出抑制胃促胰酶活性作用的物質(zhì)作為本發(fā)明的胃促胰酶抑制劑。作為選擇方法，可提及例如后面描述的實(shí)施例1的方法。以此方式獲得的化合物包括以前已經(jīng)報(bào)道作為胃促胰酶抑制劑的已知化合物，例如低分子量胃促胰酶抑制劑，如教科書中給出的(蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitors)；Barrett等編；Elssevier Science B.V.；Amsterdam，196)；報(bào)道為肽類抑制劑的α-酮酸衍生物(WO 93-25574，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，6738)；α，α-二氟-β-酮酸衍生物(日本未審專利申請(qǐng)(公開)9-124691)；三肽抑制劑(WO 93-03625)；磷酸衍生物(Oleksyszyn等，Biochemistry 30，485，1991)；肽樣抑制劑，如三氟甲基酮衍生物(WO96-33974，日本未審專利申請(qǐng)(公開)10-53579)和乙酰胺衍生物(日本未審專利申請(qǐng)(公開)10-7661，日本未審專利申請(qǐng)(公開)10-53579，日本未審專利申請(qǐng)(公開)11-246437，WO 99-41277，WO98-18794，WO96-39373)；非肽類抑制劑，如三嗪衍生物(日本未審專利申請(qǐng)(公開)8-208654和日本未審專利申請(qǐng)(公開)10-245384)；苯酚酯衍生物(日本未審專利申請(qǐng)(公開)10-87567)；頭孢烯衍生物(日本未審專利申請(qǐng)(公開)10-87493)；異噁唑衍生物(日本未審專利申請(qǐng)(公開)11-1479)；咪唑烷衍生物(WO96-04248)；乙內(nèi)酰脲衍生物(日本未審專利申請(qǐng)(公開)9-31061)；喹唑啉衍生物(WO97-11941)等，但是作為優(yōu)選胃促胰酶抑制劑的代表性實(shí)例，可提及下式(I)化合物及其可藥用鹽。 其中，A環(huán)表示芳基；R1表示羥基、氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)烷基氨基、可被羧酸基取代的C7-C10低級(jí)芳烷基氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)脂肪酸酰化的氨基、可被羧酸基取代的芳環(huán)羧酸?；陌被?、可被羧酸基取代的雜芳環(huán)羧酸?；陌被?、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)鏈烷磺酸磺酰化的氨基、可被羧酸基取代的芳環(huán)磺酸磺酰化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環(huán)磺酸磺?；陌被?、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)烷基或者可被羧酸基取代的C2-C4鏈烯基；R2和R3可以相同或不同，并且表示氫原子、未取代的或取代的C1-C4低級(jí)烷基、鹵原子、羥基、C1-C4低級(jí)烷氧基、氨基、未取代的或取代的C1-C4低級(jí)烷基氨基、未取代的或取代的C7-C10芳烷基氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)脂肪酸?；陌被⒖杀霍人峄〈姆辑h(huán)羧酸?；陌被?、可被羧酸基取代的雜芳環(huán)羧酸酰化的氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)鏈烷磺酸磺?；陌被⒖杀霍人峄〈姆辑h(huán)磺酸磺?；陌被⒖杀霍人峄〈碾s芳環(huán)磺酸磺?；陌被?，或者羧酸基，或者當(dāng)A環(huán)是苯環(huán)時(shí)，R1和R2可與該取代的苯環(huán)一起形成可被羧酸取代的稠合雜環(huán)，其中環(huán)中的碳原子可形成羰基并且R3定義如上；并且X表示氫原子、C1-C4低級(jí)烷基、C1-C4低級(jí)烷氧基、鹵原子、羥基、氨基或硝基。
在通式(I)中，A環(huán)表示的芳基的優(yōu)選實(shí)例是苯環(huán)和萘環(huán)。
R1表示的可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)烷基氨基和可被羧酸基取代的C7-C12低級(jí)芳烷基氨基的優(yōu)選實(shí)例是甲氨基、乙氨基、丙氨基、丁氨基、羧甲基氨基、羧乙基氨基、羧丙基氨基、羧丁基氨基、芐氨基、苯乙氨基、苯丙基氨基、苯丁基氨基、羧基芐氨基、羧基苯乙氨基、羧基苯丙基氨基、羧基苯丁基氨基等。
R1表示的可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)脂肪酸酰化的氨基、可被羧酸基取代的芳環(huán)羧酸酰化的氨基和可被羧酸基取代的雜芳環(huán)羧酸酰化的氨基的優(yōu)選實(shí)例是甲酰氨基、乙酰氨基、丙酰氨基、丁酰氨基、苯甲酰氨基、萘甲酰氨基、吡啶甲酰氨基、吡咯甲酰氨基、羧基乙酰氨基、羧基丙酰氨基、羧基丁酰氨基、羧基苯甲酰氨基、羧基萘甲酰氨基、羧基吡啶甲酰氨基、羧基吡咯甲酰氨基等。
R1表示的可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)鏈烷磺酸磺?；陌被?、可被羧酸基取代的芳環(huán)磺酸磺?；陌被涂杀霍人峄〈碾s芳環(huán)磺酸磺?；陌被膬?yōu)選實(shí)例是甲磺酰氨基、乙磺酰氨基、丙磺酰氨基、丁磺酰氨基、苯磺酰氨基、萘磺酰氨基、吡啶磺酰氨基、吡咯磺酰氨基、羧基甲磺酰氨基、羧基乙磺酰氨基、羧基丙磺酰氨基、羧基丁磺酰氨基、羧基苯磺酰氨基、羧基萘磺酰氨基、羧基吡啶磺酰氨基、羧基吡咯磺酰氨基等。
R1表示的可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)烷基的優(yōu)選實(shí)例是乙酸基、丙酸基、丁酸基、戊酸基等。
R1表示的可被羧酸基取代的C2-C4鏈烯基的優(yōu)選實(shí)例是丙烯酸基、巴豆酸基等。
R2或R3表示的未取代的或取代的C1-C4低級(jí)烷基的優(yōu)選實(shí)例是直鏈烷基，如甲基、乙基、正丙基和正丁基；以及支鏈烷基，如異丙基、仲丁基和叔丁基。
C1-C4低級(jí)烷基的取代基的優(yōu)選實(shí)例是羧酸基；鹵原子，如氟原子和氯原子；C1-C4低級(jí)烷氧基；氨基；甲氨基；二甲氨基、羧甲基氨基、羧乙基氨基等。
R2或R3表示的鹵原子的優(yōu)選實(shí)例是氟原子、氯原子、溴原子和碘原子。
R2或R3表示的C1-C4低級(jí)烷氧基的優(yōu)選實(shí)例是直鏈烷氧基，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基和正丁氧基；以及支鏈烷氧基，如異丙氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。
R2或R3表示的未取代的或取代的C1-C4低級(jí)烷基氨基的優(yōu)選實(shí)例是甲氨基、乙氨基、丙氨基、丁氨基等。
C1-C4低級(jí)烷基氨基的取代基的優(yōu)選實(shí)例是羧酸基；鹵原子，如氟原子和氯原子；C1-C4低級(jí)烷氧基等。
R2或R3表示的未取代的或取代的C7-C12低級(jí)芳烷基氨基的優(yōu)選實(shí)例是芐氨基、苯乙氨基、苯丙基氨基、苯丁基氨基等。
芳烷基氨基的取代基的優(yōu)選實(shí)例是羧酸基；鹵原子，如氟原子和氯原子；C1-C4低級(jí)烷氧基等。
R2或R3表示的可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)脂肪酸酰化的氨基、可被羧酸基取代的芳環(huán)羧酸?；陌被涂杀霍人峄〈碾s芳環(huán)羧酸?；陌被膬?yōu)選實(shí)例是甲酰氨基、乙酰氨基、丙酰氨基、丁酰氨基、苯甲酰氨基、萘甲酰氨基、吡啶甲酰氨基、吡咯甲酰氨基、羧基乙酰氨基、羧基丙酰氨基、羧基丁酰氨基、羧基苯甲酰氨基、羧基萘甲酰氨基、羧基吡啶甲酰氨基、羧基吡咯甲酰氨基等。
R2或R3表示的可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)鏈烷磺酸磺?；陌被⒖杀霍人峄〈姆辑h(huán)磺酸磺?；陌被涂杀霍人峄〈碾s芳環(huán)磺酸磺酰化的氨基的優(yōu)選實(shí)例是甲磺酰氨基、乙磺酰氨基、丙磺酰氨基、苯磺酰氨基、萘磺酰氨基、吡啶磺酰氨基、吡咯磺酰氨基、羧基甲磺酰氨基、羧基乙磺酰氨基、羧基丙磺酰氨基、羧基苯磺酰氨基、羧基萘磺酰氨基、羧基吡啶磺酰氨基、羧基吡咯磺酰氨基等。
當(dāng)A環(huán)是苯環(huán)時(shí)，R1和R2與該取代的苯環(huán)一起形成的可被羧酸基取代的稠合雜環(huán)(其中環(huán)中的碳原子可形成羰基)的優(yōu)選實(shí)例是四氫喹啉環(huán)和苯并噁嗪環(huán)，如四氫喹啉、苯并噁嗪、喹喔啉、苯并二噁烷、羧基四氫喹啉、羧基苯并噁嗪、羧基喹喔啉、羧基苯并二噁烷等。
X表示的C1-C4低級(jí)烷基的優(yōu)選實(shí)例是直鏈烷基，如甲基、乙基、正丙基和正丁基；以及支鏈烷基，如異丙基、仲丁基和叔丁基。
X表示的C1-C4低級(jí)烷氧基的優(yōu)選實(shí)例是直鏈烷基，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基和正丁氧基；以及支鏈烷基，如異丙氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。
X表示的鹵原子的優(yōu)選實(shí)例是氟原子、氯原子、溴原子和碘原子。
此外，可藥用的實(shí)例是酸鹽，如鹽酸鹽、甲磺酸鹽和三氟乙酸鹽；及堿金屬鹽，如鈉鹽和鉀鹽。
優(yōu)選的胃促胰酶抑制劑的其它代表性實(shí)例是式(II)的喹唑啉衍生物及其可藥用鹽 其中，其中B環(huán)表示苯環(huán)、吡啶環(huán)、吡咯環(huán)或吡唑環(huán)，m表示0、1或2，Y表示羥基、硝基、氯原子、可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷基、可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷氧基或C7-C12芳烷氧基，或者Y表示與所示被所述Y取代的苯環(huán)一起形成萘環(huán)或喹啉環(huán)，R5和R6可以相同或不同，并且表示氫原子、鹵原子、可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷基、硝基、氰基、吡唑基、四唑基、可被C1-C4低級(jí)烷基或烯丙基酯化的羧基或者可被一個(gè)或多個(gè)選自下列的取代基取代的C1-C4低級(jí)烷氧基鹵原子、嗎啉代、苯基哌嗪基和可被C1-C4低級(jí)烷基或烯丙基酯化的羧基；或者當(dāng)B環(huán)表示苯環(huán)時(shí)，R5和R6代表與所示被所述R5和R6取代的苯環(huán)一起形成萘環(huán)或喹啉環(huán)的基團(tuán)，并且Z表示氫原子、可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷基，C2-C5鏈烯基，未取代的或取代的芳烷基，未取代的或取代的芳香雜環(huán)烷基，可被C1-C4低級(jí)烷基或烯丙基酯化的羧甲基，被伯胺、仲胺或環(huán)狀胺酰胺化的甲酰甲基，未取代的或取代芳甲酰甲基，或者未取代的或取代的芳烷氧基甲基。
在通式(II)中，Y表示的鹵原子的優(yōu)選實(shí)例氟、氯、溴或碘。Y表示的可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷基的實(shí)例是直鏈烷基，如甲基、乙基、正丙基和正丁基，及支鏈烷基，如異丙基、仲丁基和叔丁基，而Y表示的可被鹵原子取代C1-C4低級(jí)烷基的鹵原子的實(shí)例是氟、氯、溴和碘。Y表示的可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷氧基的實(shí)例是直鏈烷氧基，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基和正丁氧基，及支鏈烷氧基，如異丙氧基、仲丁氧基和叔丁氧基，而Y表示的可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷氧基的鹵原子的實(shí)例是氟、氯、溴和碘。Y表示的C7-C12的芳烷氧基的實(shí)例是芐氧基、苯基乙氧基、苯基丙氧基和萘基乙氧基等，優(yōu)選芐氧基。
R5和R6表示的鹵原子的優(yōu)選實(shí)例是氟、氯、溴或碘。R5和R6表示的可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷基的實(shí)例是直鏈烷基，如甲基、乙基、正丙基和正丁基，及支鏈烷基，如異丙基、仲丁基和叔丁基，而可被鹵原子取代C1-C4低級(jí)烷基的鹵原子的實(shí)例是氟、氯、溴或碘。R5和R6表示的可被C1-C4低級(jí)烷基或烯丙基酯化的羧基的C1-C4低級(jí)烷基的優(yōu)選實(shí)例是直鏈烷基，如甲基、乙基、正丙基和正丁基，及支鏈烷基，如異丙基、仲丁基和叔丁基。R5或R6的可被一個(gè)或多個(gè)取代基取代的C1-C4低級(jí)烷氧基的實(shí)例是直鏈烷氧基，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基和正丁氧基，及支鏈烷氧基，如異丙氧基、仲丁氧基和叔丁氧基，所述取代基選自鹵原子、嗎啉代、苯基哌嗪基和可被C1-C4低級(jí)烷基或烯丙基酯化的羧基。所示作為上述取代基的鹵原子的實(shí)例是氟、氯、溴或碘，并且可被C1-C4低級(jí)烷基或烯丙基酯化的羧基的C1-C4低級(jí)烷基的優(yōu)選實(shí)例是甲基、乙基、正丙基，正丁基，和其它直鏈烷基及異丙基、仲丁基和叔丁基，和其它支鏈烷基。
Z表示的可被鹵素取代的C1-C4低級(jí)烷基中的烷基的實(shí)例是直鏈烷基，如甲基、乙基、正丙基和正丁基，及支鏈烷基，如異丙基、仲丁基和叔丁基，而可被鹵原子取代C1-C4低級(jí)烷基的鹵原子的實(shí)例是氟、氯、溴或碘。Z表示的C2-C5鏈烯基的實(shí)例是烯丙基、丙烯基、異丙烯基、丁烯基等。
Z所示的未取代的或取代的芳烷基中的芳烷基的實(shí)例C7-C12芳烷基，優(yōu)選芐基、苯乙基、苯丙基或萘乙基。未取代的或取代的芳烷基的取代基的優(yōu)選實(shí)例是可被C1-C4低級(jí)烷基或烯丙基酯化的羧基、氰基、硝基、被伯胺酰胺化的(amidized)羰基、可被羧酸或氨基酸酰胺化的胺基和可被低級(jí)烷氧羰基取代的胍基?？杀籆1-C4低級(jí)烷基或烯丙基酯化的羧基中的低級(jí)烷基的實(shí)例是直鏈烷基，如甲基、乙基、正丙基和正丁基，以及支鏈烷基，如異丙基、仲丁基和叔丁基。被伯胺酰胺化的羰基中的伯胺的實(shí)例是C1-C4低級(jí)烷胺或者可被羧基取代的那些，例如優(yōu)選甲胺、乙胺、異丙基胺和羧基甲胺；具有單環(huán)或多環(huán)芳烴基的胺，例如苯胺和萘胺；具有芳雜環(huán)基的胺，如氨基吡啶、氨基吡咯等。可被羧酸或氨基酸酰胺化的氨基中的羧酸實(shí)例優(yōu)選是C2-C5脂族一元羧酸或脂族二元羧酸，如新戊酸、琥珀酸，而氨基酸的實(shí)例是其中羧基可被酯化或者其中的氨基可被酰胺化的氨基酸，例如L-天冬氨酸、α-O-叔丁基-N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸等?？杀坏图?jí)烷氧羰基取代的胍基的實(shí)例優(yōu)選是可被C2-C5低級(jí)烷氧羰基取代的的胍基，例如胍基和2，3-二-叔丁氧羰基胍基。
Z表示的未取代的或取代的芳雜環(huán)烷基中的芳雜環(huán)烷基實(shí)例是噻吩烷基，如2-噻吩基和2-噻吩乙基；呋喃烷基，如2-呋喃甲基和2-呋喃乙基；吡啶烷基，如2-吡啶甲基、3-吡啶甲基、4-吡啶甲基和4-吡啶乙基；嘧啶烷基，如5-嘧啶甲基；吡嗪烷基，如2-吡嗪甲基；噠嗪烷基，如3-噠嗪甲基；四唑烷基，如5-四唑烷基；異噻唑烷基，如4-異噻唑甲基和5-異噻唑甲基；噻唑烷基，如5-噻唑甲基；噁唑烷基，如5-噁唑甲基；和異噁唑烷基，如4-異噁唑甲基和5-異噁唑甲基。未取代的或取代的雜環(huán)烷基中的取代基的優(yōu)選實(shí)例是C1-C4低級(jí)烷基，如甲基和乙基；以及C1-C4羧基低級(jí)烷基，如羧甲基和羧乙基。
Z表示的可被C1-C4低級(jí)烷基或烯丙基酯化的羧甲基中的低級(jí)烷基的實(shí)例是直鏈烷基，如甲基、乙基、正丙基和正丁基，以及支鏈烷基，如異丙基、仲丁基和叔丁基。
Z表示的可被伯胺或仲胺或環(huán)狀胺酰胺化的甲酰甲基中的伯胺的實(shí)例是C1-C4低級(jí)烷胺或者可被羧基取代的那些，例如優(yōu)選甲胺、乙胺、異丙基胺和羧基甲胺；具有單環(huán)飽和烴基的胺，如環(huán)己胺；具有單環(huán)或多環(huán)芳烴基的胺，例如苯胺、芐胺和萘胺；和具有芳雜環(huán)基的胺，如氨基吡啶、氨甲基吡啶、氨基吡咯、氨基嘧啶、氨基吲哚和氨基喹啉，其中具有芳烴基和芳雜環(huán)基的胺在其環(huán)上可帶有一個(gè)或多個(gè)取代基，如1)羥基，2)-OPO(OH)2，3)氨基，4)氧代，5)鹵原子，6)羧基，該羧基可被C1-C4低級(jí)烷基，如甲基、乙基、異丙基和叔丁基；或者烯丙基酯化，7)直鏈或支鏈的C1-C4低級(jí)烷氧基，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基和正丁氧基，這些基團(tuán)可被羧基取代，所述羧基可被C1-C4低級(jí)烷基，如甲基、乙基、異丙基和叔丁基或者丙烯基酯化，8)直鏈或支鏈的C1-C4低級(jí)烷基，例如甲基、乙基、正丙基、正丁基、異丙基、仲丁基和叔丁基，它們可被取代。
上述8)的可被取代的C1-C4低級(jí)烷基的取代基的優(yōu)選實(shí)例是a)羧基，該羧基可被C1-C4低級(jí)烷基，如甲基、乙基、異丙基和叔丁基，或者烯丙基酯化，b)哌啶基(piperadinyl)，該基團(tuán)可被羧基N-取代，該羧基可被C1-C4低級(jí)烷基，如甲基、乙基、異丙基和叔丁基或者烯丙基酯化，c)嗎啉代，和d)可被羧酸或氨基酸酰胺化的氨基。
上述d)的可被羧酸或氨基酸酰胺化的氨基的羧酸的實(shí)例優(yōu)選是C2-C5脂族一或二元羧酸，如新戊酸和琥珀酸，而氨基酸的實(shí)例是其中羧基可被酯化或者其中的氨基可被酰胺化的氨基酸，例如L-天冬氨酸、α-O-叔丁基-N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸和β-O-叔丁基-N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸。具有芳雜環(huán)基的胺可在其環(huán)上包含氮原子，其可被C1-C4低級(jí)烷基，如甲基和乙基取代，或者被可被酯化的羧基低級(jí)烷基，如羧甲基和叔丁氧甲酰甲基取代。
Z表示的可被伯胺、仲胺或環(huán)狀胺酰胺化的甲酰甲基(carbonylmethyl)中的仲胺的實(shí)例是二低級(jí)烷基胺，如二甲胺和二乙胺。Z表示的可被伯胺、仲胺或環(huán)狀胺酰胺化的甲酰甲基中的環(huán)狀胺的實(shí)例是吡咯烷和哌啶。
Z表示的未取代的或取代的芳甲酰甲基中的芳甲酰甲基實(shí)例是苯甲酰甲基和萘甲酰甲基，取代基的優(yōu)選實(shí)例是羥基；硝基；鹵原子，如氟、氯、溴和碘；直鏈或支鏈C1-C4低級(jí)烷基，該烷基可被鹵原子取代，如甲基、乙基、正丙基、正丁基、異丙基、仲丁基和叔丁基；直鏈或支鏈C1-C4低級(jí)烷氧基，該烷氧基可被鹵原子取代，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、正丁氧基、異丙氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。
Z表示的未取代的或取代的芳烷氧基甲基中的芳烷氧基甲基的實(shí)例優(yōu)選是C8-C13芳烷氧基甲基，例如芐氧甲基、苯乙氧基甲基和萘乙氧基甲基，而取代基的優(yōu)選實(shí)例是羥基；硝基；鹵原子，如氟、氯、溴和碘；直鏈或支鏈C1-C4低級(jí)烷基，該烷基可被鹵原子取代，如甲基、乙基、正丙基、正丁基、異丙基、仲丁基和叔丁基；直鏈或支鏈C1-C4低級(jí)烷氧基，該烷氧基可被鹵原子取代，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、正丁氧基、異丙氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。
此外，可藥用鹽的實(shí)例是酸鹽，如氯酸鹽和硝酸鹽以及堿金屬鹽，如鈉鹽和鉀鹽。
本發(fā)明的式(I)的喹唑啉衍生物可，例如通過下列(A)和(B)的合成方法合成。
合成方法(A)采用，例如JP-A-6-199839中描述的方法，使式(I-1)的化合物 其中A環(huán)定義如上并且R1’、R2’和R3’分別表示R1、R2和R3，它們可被保護(hù)基保護(hù)，R1、R2和R3定義如上與式(I-2)的鄰氨基苯甲酸衍生物反應(yīng) 其中X’表示X，該基團(tuán)可被保護(hù)基保護(hù)，并且X定義如上獲得式(I-3)的磺酰脲衍生物 其中A、R1’、R2’、R3’和X’定義如上，然后使用縮合試劑，例如1，1’-羰基二咪唑(下文稱之為CDI)，獲得喹唑啉環(huán)，如果需要，將脫去R1、R2、R3和X的保護(hù)基。
在該反應(yīng)中，當(dāng)R1、R2或R3表示含羥基、氨基或羧基的基團(tuán)時(shí)，R1、R2或R3可任選地用保護(hù)基保護(hù)，所述保護(hù)基是，例如芐氧羰基、叔丁氧羰基、芐基、烯丙基、叔丁基等。當(dāng)X表示羥基或氨基時(shí)，X可任選地用保護(hù)基保護(hù)，所述保護(hù)基是，例如芐氧羰基、叔丁氧羰基、芐基、烯丙基、叔丁基等。
用于該反應(yīng)的式(I-1)化合物包括市售的或已知化合物或者可采用已知方法合成的化合物。例如，可使用按照歐洲專利說明書0269141中描述的合成方法，用氯磺酰異氰酸酯，由相應(yīng)的磺酰胺衍生物合成的化合物。例如，可使用3-烯丙氧羰基-甲基苯磺酰基異氰酸酯、4-烯丙氧羰基-甲基苯磺?；惽杷狨ズ?-烯丙氧基苯磺酰基異氰酸酯等。
用于該反應(yīng)的式(I-2)的鄰苯甲酸衍生物可使用市售的或已知化合物或者通過已知方法合成的化合物。例如，可使用4-氯鄰氨基苯甲酸、4-甲氧基鄰氨基苯甲酸、5-氯鄰氨基苯甲酸、4-羥基鄰氨基苯甲酸等。
由式(I-3)的磺酰脲衍生物獲得喹唑啉環(huán)的反應(yīng)可在質(zhì)子惰性的溶劑中于-50-50℃，優(yōu)選在-20℃-室溫下進(jìn)行，溶劑是，例如醚類溶劑，如四氫呋喃和二噁烷；含鹵原子的溶劑，如二氯甲烷；或者二甲基甲酰胺等。此外，對(duì)于該環(huán)合反應(yīng)，可使用常規(guī)的縮合試劑，包括，例如CDI、二環(huán)己基碳二亞胺及類似的碳二亞胺化合物；混合酸酐等。脫保護(hù)反應(yīng)可用常規(guī)方法進(jìn)行，如用酸或堿水解，還原或氧化等。
合成方法(B)使其中A環(huán)、R1’、R2’和R3’定義如上的式(I-4)化合物 與式(I-5)的鄰氨基苯甲酸衍生物縮合 其中X’定義如上，Ph表示苯基，并且R4表示羧基的保護(hù)基，羧基是可通過水解或氫解被釋放出的特定基團(tuán)，例如甲基、乙基或芐基使用，例如1，8-二氮雜雙環(huán)[5，4，0]-7-十一碳烯(下文稱之為DBU)形成式(I-6)的磺酰脲衍生物 其中A環(huán)、R1’、R2’、R3’、R4’和X定義如上，然后用堿水解或氫解得到式(I-3)的相應(yīng)羧酸，再得到喹唑啉環(huán)并任選地以與合成方法(A)中相同的方法，脫去R1、R2、R3和X的保護(hù)基。在該反應(yīng)中，當(dāng)R1、R2、R3表示含羥基、氨基或羧基的基團(tuán)時(shí)，R1、R2或R3可任選地用保護(hù)基，例如芐氧羰基、叔丁氧羰基、芐基、烯丙基、叔丁基等保護(hù)。當(dāng)X表示羥基或氨基時(shí)，X可任選地用保護(hù)基，例如芐氧羰基、叔丁氧羰基、芐基、烯丙基、叔丁基等保護(hù)。
作為用于該反應(yīng)的式(I-4)化合物，可使用市售的或已知化合物或者通過已知方法合成的化合物。例如，可使用3-羥基苯磺酰胺，2-氨基苯磺酰胺，3-氨基苯磺酰胺，4-氨基苯磺酰胺，(±)-2-(4-氨基磺酰基苯基)丁酸，3-芐氧羰基氨基-4-氯苯磺酰胺，4-芐氧羰基氨基-3-氯苯磺酰胺，4-氨基-3，5-二氯苯磺酰胺，3-芐氧羰基氨基-4-甲基苯磺酰胺，4-叔丁氧羰基-3-羥基苯磺酰胺，3-芐氧羰基氨基-4-叔丁氧羰基苯磺酰胺，4-叔丁氧羰基-3-羥基苯磺酰胺，3-叔丁氧羰基-4-羥基苯磺酰胺，3-乙酰胺-4-甲氧基苯磺酰胺，3-(3-氨基磺?；?苯基丙烯酸叔丁基酯，3-氨基-4-甲氧基苯磺酰胺，4-甲氧基-3-甲基磺酰氨基苯磺酰胺，3-羧基-4-羥基-2-萘磺酰胺，4-芐氧羰基氨基-3-叔丁氧羰基苯磺酰胺，(±)-3-叔丁氧羰基-2-氧代-1H，3H-喹啉-7-磺酰胺，(±)-2-叔丁氧羰基-3-氧代-1，4-苯并噁嗪-6-磺酰胺等。
作為用于該反應(yīng)的式(I-5)鄰氨基苯甲酸，可使用市售的或已知化合物或者通過已知方法合成的化合物。例如，可使用4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸乙酯，4-氯-2--N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸芐基酯，5-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸乙酯，5-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸芐基酯，4-甲氧基-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，4-甲氧基-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸乙酯，4-甲氧基-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸芐基酯，4-羥基-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，4-羥基-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸乙酯，4-羥基-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸芐基酯等。
獲得式(I-4)化合物和式(I-5)的鄰氨基苯甲酸衍生物縮合得到式(I-6)的磺酰脲衍生物的反應(yīng)可用質(zhì)子惰性溶劑在-50-50℃，優(yōu)選-20-室溫下進(jìn)行，所述溶劑是，例如醚類溶劑，如四氫呋喃或二噁烷；含鹵溶劑，如二氯甲烷；或者二甲基甲酰胺等。此外，作為該縮合反應(yīng)可使用的有機(jī)強(qiáng)堿，可使用例如DBU；無機(jī)堿是，例如碳酸鉀、碳酸鈉、氫氧化鉀和氫氧化鈉；或者金屬堿，如氫化鈉。
對(duì)于在堿水解或氫解由此得到的式(I-6)的磺酰脲衍生物獲得式(I-3)磺酰脲衍生物的反應(yīng)，可采用用于酯的常規(guī)水解條件和氫化條件。
注意到上述反應(yīng)可在被保護(hù)的官能團(tuán)不參與反應(yīng)的情況下進(jìn)行。依據(jù)保護(hù)基的類型，可通過化學(xué)還原或者其它常規(guī)脫保護(hù)反應(yīng)脫除保護(hù)。例如，當(dāng)保護(hù)基是叔丁基時(shí)或者叔丁氧羰基時(shí)，可使用三氟乙酸；當(dāng)保護(hù)基是烯丙基時(shí)，可使用鈀催化劑，如四(三苯基膦)鈀(O)。
其中R1表示被可被羧酸取代的C1-C4低級(jí)脂肪酸?；陌被?，被可被羧酸取代的芳環(huán)羧酸酰化的氨基，和被可被羧酸取代的雜芳環(huán)羧酸?；陌被氖?I)化合物可使用常規(guī)方法，由其中R1表示氨基的式(I)化合物通過用羧酸、酰氯、酸酐?；玫健?br> 其中R1表示被可被羧酸取代的C1-C4低級(jí)鏈烷磺酸磺?；陌被?，被可被羧酸取代的芳環(huán)磺酸磺?；陌被涂杀霍人崛〈碾s芳環(huán)磺酸磺酰化的氨基的式(I)化合物可采用常規(guī)方法，由其中R1表示氨基的式(I)化合物通過用磺酸或磺酰氯磺?；玫?。
本發(fā)明的式(II)化合物可通過上述類似的方法獲得，該方法在國際公開WO 97/11941中有詳細(xì)描述。
獲得的式(I)或(II)化合物可通過常規(guī)方法，如重結(jié)晶或柱色譜純化。
另外，如果需要，通過上述方法獲得的式(I)或(II)化合物可通過使其與各種類型的酸或堿反應(yīng)轉(zhuǎn)化為鹽?？捎糜趯⑹?I)或(II)化合物轉(zhuǎn)化為鹽的酸可提及，例如無機(jī)酸，如氫氯酸、氫溴酸、硝酸、硫酸或磷酸；以及有機(jī)酸，如甲磺酸、苯磺酸、對(duì)甲苯磺酸、三氟乙酸、檸檬酸、乳酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、乙酸、己二酸、棕櫚酸和鞣酸。
可用于將式(I)或(II)化合物轉(zhuǎn)化為鹽的堿可提及，例如氫氧化鈉、氫氧化鋰和氫氧化鉀。
式(I)或(II)化合物包括含不對(duì)稱中心的化合物。外消旋混合物可通過一種或多種方法分離為旋光活性單體。可使用，例如(1)使用旋光活性柱的方法(2)通過旋光活性酸或堿轉(zhuǎn)化為鹽，然后重結(jié)晶的方法(3)(1)和(2)的結(jié)合方法。
采用后面實(shí)施例3、8、10、11、12和18中解釋的方法，可評(píng)價(jià)這些混合物預(yù)防或緩解表現(xiàn)出雙相皮膚反應(yīng)的皮炎和由于與抗原重復(fù)接觸引發(fā)的皮炎的作用。
當(dāng)使用本發(fā)明的化合物作為預(yù)防或治療表現(xiàn)出雙相皮膚反應(yīng)的皮炎，作為緩解表現(xiàn)出雙相皮膚反應(yīng)的皮炎的晚期反應(yīng)的藥物，或者作為預(yù)防或治療由于與抗原重復(fù)接觸引發(fā)的皮炎的藥物時(shí)，可使用一種本發(fā)明化合物或者兩種或多種本發(fā)明化合物的混合物來制備適于按照常規(guī)方法給藥的制劑。例如口服制劑形式的實(shí)例包括膠囊、片劑、顆粒、細(xì)顆粒、糖漿、干糖漿和其它制劑；非口服制劑的實(shí)例包括注射劑和栓劑如直腸栓劑和陰道栓劑；經(jīng)鼻制劑是，例如噴霧劑和軟膏；及透皮制劑，如透皮吸收帶劑。
本發(fā)明化合物的臨床劑量可根據(jù)癥狀、嚴(yán)重程度、年齡、存在的并發(fā)癥等變化，以及根據(jù)制劑形式變化。在口服給藥的情況下，有效成分的成人劑量一般為1-1000mg天。在非口服給藥的情況下，施用1/10-1/2口服劑量的量足以。這些劑量范圍可根據(jù)患者的年齡、癥狀等進(jìn)行調(diào)整。
在本發(fā)明中，胃促胰酶抑制劑可不與其它活性成分混合而單獨(dú)給藥，但考慮到有關(guān)疾病、癥狀、并發(fā)癥等，也可施用含有其它有效成分的藥物制劑。此外，也可與其它有效成分聯(lián)合。對(duì)其它有效成分的用量沒有特別限制，但可考慮其單獨(dú)產(chǎn)生作用的最低量、產(chǎn)生的副作用等來確定。
在治療中，包括僅含胃促胰酶抑制劑作為活性成分的制劑和含有其它有效成分的制劑聯(lián)合治療的制劑形式和方法宜由醫(yī)師按照患者的年齡、癥狀等選擇。
本發(fā)明化合物的毒性較低。給5周齡雄性小鼠口服給藥后24小時(shí)時(shí)的急性毒性值LD50為1g/kg或更高。該值高于預(yù)期臨床劑量的50倍。因此，本發(fā)明化合物具有高安全性。
實(shí)施例通過下列非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但無需贅述，本發(fā)明的范圍不限于這些實(shí)施例。
在實(shí)施例2和實(shí)施例3中，用表現(xiàn)出雙相皮膚反應(yīng)的皮炎的小鼠模型通過顯示胃促胰酶抑制劑的抑制作用體現(xiàn)胃促胰酶抑制劑的有用性。另外，在實(shí)施例4至實(shí)施例6中，進(jìn)一步證明了胃促胰酶與表現(xiàn)出雙相皮膚反應(yīng)的皮炎有關(guān)的論點(diǎn)，給出了通過對(duì)小鼠耳部皮內(nèi)接種人胃促胰酶引發(fā)表現(xiàn)出雙相皮膚反應(yīng)的皮炎的事實(shí)。在實(shí)施例7和實(shí)施例8中，顯示了胃促胰酶在此類雙相皮膚反應(yīng)中的作用機(jī)制的分析結(jié)果。
另一方面，在實(shí)施例9至實(shí)施例12中，使用由重復(fù)使用半抗原引發(fā)的皮炎模型，并分析該模型和胃促胰酶抑制劑在該模型中的作用證明胃促胰酶抑制的有用性。另外，在實(shí)施例13至15中，由于可了解特應(yīng)性皮炎等患者因與抗原重復(fù)接觸導(dǎo)致肥大細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)脫粒反應(yīng)，分析對(duì)耳部重復(fù)施用人胃促胰酶引發(fā)的皮炎，由此研究皮膚的重復(fù)脫粒反應(yīng)作用。再者，在實(shí)施例16-17中，顯示了胃促胰酶對(duì)肥大細(xì)胞的主要細(xì)胞因子SCF表達(dá)的影響是胃促胰酶引發(fā)皮炎的機(jī)制之一。在實(shí)施例18中，用NC/Nga小鼠作為通過與抗原重復(fù)接觸引發(fā)的第二模型檢測(cè)胃促胰酶抑制劑對(duì)皮炎的作用。
制備實(shí)施例17-氯-3-(3-羥基苯磺?；?-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物1)的合成按照合成方法(B)，將938mg(5.42mmol)3-羥基苯磺酰胺溶于40ml四氫呋喃中，然后滴加892μl(5.96mmol)1，8-氮雜雙環(huán)[5.4.0]-7-十一碳烯(下文稱之為DBU)。將該反應(yīng)溶液在室溫?cái)嚢?5分鐘，然后加入1.66g(5.42mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯并將該混合物在室溫?cái)嚢柽^夜。將過量水到入該反應(yīng)溶液中，然后用鹽酸使該混合物呈酸性并用乙酸乙酯萃取。有機(jī)層用水和飽和鹽水洗滌，經(jīng)無水硫酸鎂干燥并濃縮。如此獲得的粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱色譜(0-5％甲醇/二氯甲烷)純化，得到1.32g(產(chǎn)率59％)的4-氯-2-{[(3-羥基苯磺酰氨基)羰基]氨基}苯甲酸甲酯。性質(zhì)無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)3.91(3H，s)，7.02(1H，m)，7.09(1H，m)，7.34(1H，t)，7.57(2H，m)，7.89(1H，d)，8.38(1H，d)，10.94(1H，s).接下來，將如此獲得的1.23g(3.2mmol)該化合物溶于20ml甲醇，然后滴加10ml 2N氫氧化鈉水溶液。將該反應(yīng)溶液在室溫下攪拌15分鐘，然后加入過量的水并用鹽酸使該混合物呈酸性。然后攪拌，產(chǎn)生結(jié)晶沉淀，然后過濾并干燥得到羧酸。將如此獲得的產(chǎn)物溶于50ml四氫呋喃中，在冰冷卻下加入434mg(2.68mmol)CDI并將該混合物攪拌30分鐘。該反應(yīng)溶液用乙酸乙酯稀釋，用水和飽和鹽水洗滌，經(jīng)無色硫酸鎂干燥，然后濃縮得到粗產(chǎn)物。該粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱色譜(乙酸乙酯∶正己烷＝1∶2)，得到230mg(2步產(chǎn)率為20％)標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)7.12(2H，s)，7.24(1H，d)，7.48(1H，t)，7.58(2H，s)，7.85(1H，d)，10.28(1H，s)，11.63(1H，s).
制備實(shí)施例23-(2-氨基苯磺酰基)-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物2)的合成以與制備實(shí)施例1相同的方式處理2.7g(15.7mmol)2-氨基苯磺酰胺和4.8g(15.7mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，得到3.2g(3步產(chǎn)率為58％)的標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)6.46(2H，s)，6.65(1H，t)，6.81(1H，d)，7.12(1H，s)，7.23(1H，d)，7.34(1H，t)，7.76(1H，d)，7.86(1H，d).
制備實(shí)施例37-氯-3-(2-甲磺酰氨基苯磺?；?-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物3)的合成將22mg(0.06mmol)化合物2溶于200μl1吡啶，滴加1.6μl(0.15mmol)甲磺酰氯，然后將所得混合物在室溫?cái)嚢柽^夜。往該反應(yīng)溶液中加入過量水，該混合物用乙酸乙酯萃取。有機(jī)層用1N鹽酸水溶液和飽和鹽水洗滌，然后經(jīng)無水硫酸鎂干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物。該粗產(chǎn)物經(jīng)乙醚結(jié)晶，得到16mg(0.04mmol)標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)3.61(3H，s)，7.10(1H，d)，7.20(1H，d)，7.74(1H，d)，7.82-7.90(4H，m)，8.34(1H，d)，11.70(1H，s).
制備實(shí)施例43-(4-氨基苯磺?；?-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物4)的合成以與制備實(shí)施例1相同的方式處理2.7g(15.7mmol)4-氨基苯磺酰胺和4.8g(15.7mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，得到7.9g(產(chǎn)率94％)2-{[(4-氨基苯磺酰氨基)羰基]氨基}-4-氯苯甲酸甲酯。性質(zhì)無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)3.59(3H，s)，5.37(2H，s)，6.45(2H，d)，6.83(1H，dd)，7.41(2H，d)，7.81(1H，d)，8.66(1H，d)，9.64(1H，s).
然后，以相同方式，由所得的7.9g(14.8mmol)磺酰脲產(chǎn)物，獲得4.3g(2步產(chǎn)率83％)的標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)6.39(2H，s)，6.63(2H，d)，7.09(1H，s)，7.22(1H，d)，7.76(2H，d)，7.83(1H，d)，11.51(1H，s).
制備實(shí)施例53-(3-羧甲基-苯磺?；?-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物5)的合成按照合成方法(A)，將3.27g(11.6mmol)3-烯丙氧羰基甲基苯磺酰基異氰酸酯溶于100ml無水THF中，然后加入1.98g(11.5mmol)4-氯鄰氨基苯甲酸并將該混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)。該反應(yīng)溶液用冰水冷卻后，加入1.87g(11.5mmol)CDI并將所得混合物在并冷卻下攪拌30分鐘。將過量水加到反應(yīng)溶液中，然后用乙酸乙酯萃取該混合物。將有機(jī)層洗滌，干燥并用少量乙酸乙酯使其結(jié)晶，得到2.0g(產(chǎn)率40％)3-(3-烯丙基氧羰基-苯磺酰基)-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮。如此獲得的烯丙基產(chǎn)物溶于100ml甲酸-THF(1∶9)混合物中，加入700mg三苯基膦。使反應(yīng)器避光并保持在氮?dú)夥障?，然加?00mg四(三苯基膦)鈀(O)并將所得混合物在室溫避光條件下攪拌過夜。將反應(yīng)溶液真空濃縮，所得固體用二氯甲烷洗滌，得到1.47g(產(chǎn)率81％)標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)3.76(2H，s)，7.13(1H，s)，7.24(1H，d)，7.61-7.69(2H，m)，7.86(1H，d)，8.05(2H，s)，12.50(1H，br).
制備實(shí)施例63-(4-羧甲基-苯磺酰基)-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物6)的合成以與實(shí)施例5相同的方式處理1.10g(3.95mmol)4-烯丙氧羰基甲基-苯磺?；惽杷狨ズ?78mg(3.95mmol)4-氯鄰氨基苯甲酸，獲得657mg(產(chǎn)率38％)3-(4-烯丙氧羰基苯磺?；?-7-氯-2，4-(1H，3H)-喹唑啉二酮。以相同方式處理538mg(1.24mmol)該化合物，得到342mg(產(chǎn)率70％)的標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)3.75(2H，s)，7.13(1H，s)，7.23(1H，d)，7.61-7.69(2H，m)，7.86(1H，d)，8.05(2H，s)，12.07(2H，br).
制備實(shí)施例7(±)-2-{4-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉-3-基)磺酰基]苯基}丁酸(化合物7)的合成以與制備實(shí)施例1相同的方式處理1.02g(3.41mmol)(±)-2-(4-氨基磺?；交?丁酸叔丁基酯和1.04g(3.41mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，得到1.46g(產(chǎn)率84％)1-[({4-[1-(叔丁氧羰基)丙基]苯磺酰氨基}羰基)氨基]-4-氯苯甲酸甲酯。性質(zhì)無色非晶形物，PMR(δppm，CDCl3)0.89(3H，t)，1.38(9H，s)，1.69-1.76(1H，m)，2.03-2.10(1H，m)，3.42(1H，t)，3.94(3H，s)，7.04(1H，d)，7.47(2H，d)，7.93(1H，d)，8.01(2H，d)，8.45(1H，br)，11.04(1H，br).
接下來，用4.3ml(8.6mmol)2N氫氧化鈉水溶液類似地形成1.43g羧酸，再用463mg(2.86mmol)CDI得到970mg(2步產(chǎn)率71％)(±)-2-{4-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉-3-基)磺?；鵠苯}丁酸叔丁基酯。
將如此獲得的叔丁基酯溶于5ml二氯甲烷中，然后加入5ml三氟乙酸并將所得混合物在室溫?cái)嚢?0分鐘。將該反應(yīng)溶液真空濃縮并將所得粗產(chǎn)物用少量乙醚洗滌，得到820mg(產(chǎn)率96％)的標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)0.84(3H，t)，1.67-1.75(1H，m)，1.98-2.05(1H，m)，3.62(1H，t)，7.11(1H，s)，7.24(1H，d)，7.61(2H，d)，7.86(1H，d)，8.13(2H，d)，11.62(1H，s).
制備實(shí)施例83-(3-氨基-4-氯苯磺?；?-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物8)的合成以與制備實(shí)施例1相同的方式處理1.0g(2.93mmol)3-芐氧羰基氨基-4-氯苯磺酰胺和1.18g(2.93mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸芐基酯，得到1.43g(產(chǎn)率78％)2-{[(3-芐氧羰基氨基-4-氯苯磺酰氨基)羰基]氨基}-4-氯苯甲酸芐基酯。性質(zhì)無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)5.19(2H，s)，5.36(2H，s)，7.21(1H，dd)，7.34-7.48(10H，m)，7.72-7.76(2H，m)，7.97(1H，d)，8.25(1H，d)，8.30(1H，d)，9.53(1H，s)，10.30(1H，s).
將1.38g(2.20mmol)該化合物溶于50ml THF中，然后加入200mg鈀-碳(10％)并將該混合物在氫氣流下攪拌2小時(shí)。將反應(yīng)混合物濾過硅藻土以除去鈀-碳，然后真空濃縮濾液，得到羧酸。將如此獲得的產(chǎn)物懸浮于50ml THF中，然后在冰冷卻下加入356mg(2.20mmol)CDI并以與制備實(shí)施例1相同的方式處理該所得混合物，獲得560mg(2步產(chǎn)率66％)的標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)6.00(2H，s)，7.12(1H，s)，7.26(2H，t)，7.48(1H，d)，7.66(1H，s)，7.86(1H，d)，11.76(1H，br).
制備實(shí)施例93-(4-氨基-3，5-二氯苯磺?；?-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物9)的合成以與制備實(shí)施例1相同的方式處理1.06g(4.40mmol)4-氨基-3，5-二氯苯磺酰胺和1.34g(4.40mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，得到905mg(產(chǎn)率44％)2-{[(4-氨基-3，5-二氯苯磺酰氨基)羰基]氨基}-4-氯苯甲酸甲酯。性質(zhì)無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)3.87(3H，s)，6.59(2H，br)，7.22(1H，dd)，7.72(2H，s)，7.93(1H，d)，8.24(1H，d)，10.17(1H，s).
然后，以相同方式處理905mg(2.0mmol)所得磺酰脲產(chǎn)物，得到660mg(2步產(chǎn)率82％)的標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)6.80(2H，s)，7.12(1H，s)，7.24(1H，d)，7.86(1H，d)，7.92(2H，s)，11.63(1H，br).
制備實(shí)施例103-(3-氨基-4-甲基苯磺?；?-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物10)的合成以與制備實(shí)施例8相同的方式處理960mg(3.00mmol)3-芐氧羰基氨基-4-甲基苯磺酰胺和1.14g(3.00mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸芐基酯，得到1.14g(產(chǎn)率62％)2-{[(3-芐氧羰基氨基-4-甲基苯磺酰氨基)羰基]氨基}-4-氯苯甲酸芐基酯。性質(zhì)無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)2.30(3H，s)，5.17(2H，s)，5.36(2H，s)，7.20(1H，dd)，7.33-7.48(11H，m)，7.63(1H，d)，7.97(1H，d)，8.11(1H，s)，8.25(1H，s)，9.27(1H，s)，10.30(1H，s)，12.20(1H，br).然后，以相同方式處理1.14g(1.87mmol)所得磺酰脲產(chǎn)物，得到190mg(2步產(chǎn)率27％)的標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)2.12(3H，s)，5.47(2H，s)，7.12(1H，s)，7.16-7.25(3H，m)，7.38(1H，s)，7.85(1H，d)，11.58(1H，s).
制備實(shí)施例113-[(3-羧甲基氨基苯基)磺?；鵠-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物11)的合成以與制備實(shí)施例7相同的方式處理1.62g(5.65mmol)3-叔丁氧羰基甲氨基苯磺酰胺和1.73g(5.65mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，得到209mg(4步產(chǎn)率9％)標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)3.86(2H，s)，6.88(1H，s)，7.12(1H，s)，7.24(1H，d)，7.30-7.38(3H，m)，7.86(1H，d)，11.61(1H，br).
制備實(shí)施例123-(3-氨基苯磺?；?-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物12)的合成以與制備實(shí)施例7相同的方式處理3.5g(12.9mmol)3-叔丁氧羰基氨基苯磺酰胺和3.9g(12.8mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，得到2.2g(4步產(chǎn)率49％)標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)5.72(2H，s)，6.87(1H，d)，7.12(1H，s)，7.23-7.27(2H，m)，7.33(1H，s)，7.86(1H，d)，11.61(1H，s).
制備實(shí)施例132-{3-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺酰基]苯氨基羰基}丙酸(化合物13)的合成將100mg(0.28mmol)化合物12溶于5ml THF中，加入100mg(1.0mmol)琥珀酸酐并將所得混合物加熱回流3小時(shí)。將反應(yīng)溶液真空濃縮，如此獲得的粗產(chǎn)物用乙酸乙酯-乙醚結(jié)晶，得到120mg(產(chǎn)率96％)標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)187-188℃，PMR(δppm，DMSO-d6)2.54(2H，d)，2.59(2H，d)，7.12(1H，s)，7.24(1H，d)，7.59(1H，t)，7.80(1H，d)，7.86(1H，d)，7.96(1H，d)，8.41(1H，s)，10.40(1H，s)，11.63(1H，br)，12.10(1H，br).
制備實(shí)施例143-{3-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺?；鵠苯基}丙烯酸(化合物14)的合成以與制備實(shí)施例7相同的方式處理1.54g(5.44mmol)3-(3-氨基磺?；?苯基丙烯酸叔丁基酯和1.66g(5.44mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，得到2.18g(產(chǎn)率81％)2-({[3-(3-叔丁氧基-3-氧代-1-丙烯基)苯磺酰氨基]羰基}氨基)-4-氯苯甲酸甲酯。性質(zhì)無色非晶形物，PMR(δppm，CDCl3)1.53(9H，s)，3.95(3H，s)，6.46(1H，d)，7.05(1H，d)，7.55(1H，m)，7.57(1H，d)，7.72(1H，m)，7.93(1H，m)，8.04(1H，m)，8.27(1H，s)，8.46(1H，d)，11.05(1H，br).
然后，以相同方式處理2.18g(4.4mmol)所得磺酰脲產(chǎn)物，得到698mg(3步產(chǎn)率37％)標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)6.65(1H，d)，7.12(1H，s)，7.25(1H，d)，7.69(1H，d)，7.72(1H，t)，7.87(1H，d)，8.12(2H，q)，8.37(1H，s)，11.64(1H，s).
制備實(shí)施例154-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺?；鵠水楊酸(化合物15)的合成以與制備實(shí)施例7相同的方式處理1.0g(3.66mmol)4-叔丁氧羰基-3-羥基苯磺酰胺和1.12g(3.66mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，得到1.79g(產(chǎn)率100％)2-{[(4-叔丁氧羰基-3-羥基苯磺酰氨基)羰基]氨基}-4-氯苯甲酸甲酯。性質(zhì)無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)1.57(9H，s)，3.87(3H，s)，7.14(1H，d)，7.40-7.45(2H，m)，7.85(1H，d)，7.92(1H，d)，8.32(1H，d)，10.13(1H，s)，10.82(1H，s).
然后，以相同方式處理1.78g(3.66mmol)所得磺酰脲產(chǎn)物，得到370mg(3步產(chǎn)率25％)的標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)7.13(1H，s)，7.26(1H，d)，7.69(1H，d)，7.87(1H，d)，8.01(1H，d)，11.67(1H，s).
制備實(shí)施例164-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺?；鵠水楊酸一鈉鹽(化合物16)的合成將50mg(0.13mmol)化合物15懸浮于約1ml THF中，然后滴加126μl 1N氫氧化鈉水溶液。證實(shí)該溶液達(dá)到均勻后，加入30ml水并將該混合物凍干，定量地得到52mg非晶形標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色非晶形物，PMR(δppm，CD3OD)7.11(1H，s)，7.19(1H，d)，7.58(1H，d)，7.63(1H，s)，7.92(1H，d)，8.03(1H，d).
制備實(shí)施例174-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺?；鵠鄰氨基苯甲酸(化合物17)的合成以與制備實(shí)施例8相同的方式處理2.84g(6.9mmol)3-苯氧羰基氨基-4-叔丁氧羰基苯磺酰胺和2.67g(6.99mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸芐基酯，得到3.74g(產(chǎn)率77％)2-{[(3-苯氧羰基氨基-4-叔丁氧羰基苯磺酰氨基)羰基]氨基}-4-氯苯甲酸芐基酯。性質(zhì)無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)1.54(9H，s)，5.19(2H，s)，5.34(2H，s)，7.05(1H，m)，7.34-7.58(10H，m)，7.60(1H，d)，7.90(1H，d)，7.98(1H，d)，8.50(1H，br)，8.62(1H，s)，10.00(1H，br)，10.41(1H，s).
然后，以相同方式處理3.74g(5.39mmol)所得磺酰脲，得到690mg(2步產(chǎn)率30％)的4-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺?；鵠鄰氨基苯甲酸叔丁基酯，然后進(jìn)行類似的脫丁基反應(yīng)，得到503mg(產(chǎn)率84％)標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)7.14(1H，s)，7.18(1H，d)，7.25(1H，d)，7.59(1H，s)，7.87(1H，d)，7.89(1H，d)，11.62(1H，s).
制備實(shí)施例184-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺?；鵠鄰氨基苯甲酸一鈉鹽(化合物18)的合成將50mg(0.13mmol)化合物17懸浮于約1ml THF中，然后滴加126μl 1N氫氧化鈉水溶液。證實(shí)該溶液達(dá)到均勻后，加入30ml水并將該混合物凍干，定量地得到52mg非晶形標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)7.11-7.22(3H，m)，7.37(1H，s)，7.83(1H，d)，7.91(1H，d).
制備實(shí)施例193-(4-羥基苯磺?；?-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物19)的合成以與制備實(shí)施例5相同的方式處理1.50g(7.03mmol)4-烯丙氧基苯磺?；惽杷狨ズ?.2g(7.03mmol)4-氯鄰氨基苯甲酸，得到1.5g(53％)3-(4-烯丙氧基苯磺?；?-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮。類似地處理500mg(1.27mmol)該產(chǎn)物，得到405mg(產(chǎn)率90％)的標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)6.98(2H，d)，7.11(1H，s)，7.23(1H，d)，7.85(1H，d)，8.00(2H，d)，11.25(1H，br).
制備實(shí)施例204-[(2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺酰基]水楊酸(化合物20)的合成以與制備實(shí)施例17相同的方式處理618mg(2.26mmol)4-叔丁氧羰基-3-羥基苯磺酰胺和613mg(2.26mmol)2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，得到792mg(產(chǎn)率78％)2-{[(4-叔丁氧羰基-3-羥基苯磺酰氨基)羰基]氨基}苯甲酸甲酯。性質(zhì)無色非晶形物，PMR(δppm，CDCl3)1.60(9H，s)，3.97(3H，s)，7.09(1H，t)，7.49-7.52(2H，m)，7.65(1H，d)，7.90(1H，d)，8.01(1H，dd)，8.33(1H，d)，10.98(1H，s)，11.18(1H，s).
然后，以相同方式處理790mg(1.75mmol)所得磺酰脲產(chǎn)物，得到100mg(3步產(chǎn)率8％)的標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)7.13(1H，d)，7.22(1H，t)，7.63-7.69(3H，m)，7.87(1H，d)，8.01(1H，d)，11.57(1H，s).
制備實(shí)施例215-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺酰基]水楊酸(化合物21)的合成以與制備實(shí)施例17相同的方式處理320mg(1.17mmol)3-叔丁氧羰基-4-羥基苯磺酰胺和447mg(1.17mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸芐基酯，得到611mg(產(chǎn)率93％)2-{[(3-叔丁氧羰基-4-羥基苯磺酰氨基)羰基]氨基}-4-氯苯甲酸甲酯。性質(zhì)無色非晶形物，PMR(δppm，CDCl3)1.62(9H，s)，5.35(2H，s)，7.01-7.05(2H，m)，7.37-7.41(5H，m)，7.96(1H，d)，8.10(1H，dd)，8.46-8.48(2H，m)，10.99(1H，s)，11.66(1H，s).
然后，以相同方式處理611mg(1.09mmol)所得磺酰脲產(chǎn)物，得到114mg(3步產(chǎn)率33％)的標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)， PMR(δppm，DMSO-d6)7.11(1H，s)，7.19(1H，d)，7.24(1H，d)，7.86(1H，d)，8.20(1H，d)，8.56(1H，s)，11.57(1H，s).
制備實(shí)施例223-(3-乙酰胺基-4-甲氧基苯磺?；?-7-氯-2.4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物22)的合成以與制備實(shí)施例8相同的方式處理500mg(2.19mmol)3-乙酰氨基-4-甲氧基苯磺酰胺和836mg(2.19mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸芐基酯，得到812mg(產(chǎn)率70％)2-{[(3-乙酰氨基-4-甲氧基苯磺酰氨基)羰基]氨基}-4-氯苯甲酸芐基酯。性質(zhì)無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)2.12(3H，s)，3.93(3H，s)，5.36(2H，s)，7.20(1H，d)，7.24(1H，d)，7.36-7.48(5H，m)，7.69(1H，d)，7.96(1H，d)，8.24(1H，s)，8.67(1H，s)，9.39(1H，s)，10.25(1H，s)，12.11(1H，br).
然后，以相同方式處理611mg(1.09mmol)所得磺酰脲產(chǎn)物，得到250mg(2步產(chǎn)率39％)的標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)2.12(3H，s)，3.95(3H，s)，7.12(1H，s)，7.23(1H，d)，7.30(1H，d)，7.85(1H，d)，7.89(1H，d)，8.80(1H，s)，9.42(1H，s)，11.59(1H，br).
制備實(shí)施例233-(3-氨基-4-甲氧基苯磺?；?-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物23)的合成以與制備實(shí)施例17相同的方式處理400mg(1.40mmol)3-叔丁氧羰基氨基-4-甲氧基苯磺酰胺和533mg(1.40mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸芐基酯，得到86mg(4步產(chǎn)率16％)的標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)3.81(3H，s)，7.26-7.37(5H，m)，7.77(1H，s)，7.90(1H，d)，7.94(1H，d)，11.73(1H，s).
制備實(shí)施例247-氯-3-(4-甲氧基-3-甲基磺酰氨基苯磺酰基)-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物24)的合成以與制備實(shí)施例8相同的方式處理500mg(1.89mmol)4-甲氧基-3-甲磺酰氨基苯磺酰胺和722mg(1.89mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸芐基酯，得到888mg(產(chǎn)率83％)2-({[(4-甲氧基-3-甲磺酰氨基)苯磺酰氨基]羰基}氨基)-4-氯苯甲酸芐基酯。性質(zhì)無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)2.12(3H，s)，3.93(3H，s)，5.36(2H，s)，7.20(1H，d)，7.24(1H，d)，7.36-7.48(5H，m)，7.69(1H，d)，7.96(1H，d)，8.24(1H，s)，8.67(1H，s)，9.39(1H，s)，10.25(1H，s)，12.11(1H，br).
然后，以相同方式處理880mg(1.55mmol)所得磺酰脲產(chǎn)物，得到620mg(2步產(chǎn)率85％)的標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)， PMR(δppm，DMSO-d6)3.04(3H，s)，3.94(3H，s)，7.11(1H，s)，7.23(1H，d)，7.34(1H，d)，7.86(1H，d)，7.99(1H，d)，8.10(1H，s).
制備實(shí)施例254-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺?；鵠-1-羥基萘-2-甲酸(化合物25)的合成以與制備實(shí)施例17相同的方式處理323mg(1.00mmol)3-叔丁氧羰基-4-羥基-1-萘磺酰胺和381mg(1.00mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸芐基酯，得到447mg(產(chǎn)率73％)4-({[(2-苯氧羰基-5-氯苯氨基)羰基]氨基}磺?；?-1-羥基-2-萘甲酸叔丁基酯。性質(zhì)無色非晶形物， PMR(δppm，DMSO-d6)1.66(9H，s)，5.34(3H，s)，6.98(1H，d)，7.35-7.48(5H，m)，7.66(1H，m)，7.81(1H，m)，7.89(1H，d)，8.37(2H，m)，8.44(1H，s)，8.71(1H，d)，10.02(1H，br)，12.52(1H，br).
然后，以相同方式處理445mg(0.72mmol)所得磺酰脲產(chǎn)物，得到56mg(3步產(chǎn)率18％)的標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)7.08(1H，s)，7.20(1H，d)，7.63(1H，t)，7.77(1H，t)，7.84(1H，d)，8.42(1H，d)，8.51(1H，d)，8.75(1H，s)，11.57(1H，s).
制備實(shí)施例265-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺?；鵠鄰氨基苯甲酸(化合物26)的合成以與制備實(shí)施例17相同的方式處理834mg(2.05mmol)4-苯氧羰基氨基-3-叔丁氧羰基苯磺酰胺和783mg(2.05mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸芐基酯，得到1.18g(產(chǎn)率83％)2-{[(4-芐氧羰基-3-叔丁氧羰基苯磺酰氨基)羰基]氨基}-4-氯苯甲酸芐基酯。性質(zhì)無色非晶形物，PMR(δppm，CDCl3)1.56(9H，s)，5.22(2H，s)，5.37(2H，s)，7.04(1H，dd)，7.33-7.42(10H，m)，7.97(1H，d)，8.14(1H，d)，8.45(1H，d)，8.60(1H，d)，8.65(1H，d)，11.01(1H，s)，11.11(1H，s).
然后，以相同方式處理1.17g(1.69mmol)所得磺酰脲產(chǎn)物，得到404mg(3步產(chǎn)率60％)的標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)6.89(1H，d)，7.11(1H，s)，7.23(1H，d)，7.85(1H，d)，7.98(1H，d)，8.51(1H，s)，11.51(1H，s).
制備實(shí)施例274-[(7-甲氧基-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺?；鵠鄰氨基苯甲酸(化合物27)的合成以與制備實(shí)施例17相同的方式處理500mg(1.23mmol)3-芐氧羰基氨基-4-叔丁氧羰基苯磺酰胺和460mg(1.22mmol)4-甲氧基-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸芐基酯，得到15mg(4步產(chǎn)率3.1％)標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)， PMR(δppm，DMSO-d6)3.82(3H，s)，6.58(1H，s)，6.80(1H，d)，7.16(1H，d)，7.56(1H，s)，7.80(1H，d)，7.90(1H，d)，11.49(1H，s).
制備實(shí)施例28(±)-7-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺?；鵠-2-氧代-1H，3H-喹啉-3-甲酸(化合物28)的合成以與制備實(shí)施例17相同的方式處理400mg(1.23mmol)(±)-3-叔丁氧羰基-2-氧代-1H，3H-喹啉-7-磺酰胺和468mg(1.23mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸芐基酯，得到649mg(產(chǎn)率86％)8-({[(2-芐氧羰基-5-氯苯氨基)羰基]氨基}磺?；?-2-氧代-1，2，3，4-四氫-3-喹啉甲酸叔丁基酯。性質(zhì)無色非晶形物，PMR(δppm，CDCl3)1.32(9H，s)，3.18-3.30(2H，m)，3.54(1H，m)，5.35(2H，s)，6.85(1H，m)，7.00(1H，m)，7.35-7.39(5H，m)，7.87-7.96(3H，m)，8.47(1H，m)，8.78(1H，br)，10.92(1H，br).
然后，以相同方式處理640mg(1.04mmol)所得磺酰脲產(chǎn)物，得到258mg(3步產(chǎn)率55％)的標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)3.23-3.31(2H，m)，3.59(1H，t)，7.07(1H，d)，7.12(1H，s)，7.25(1H，d)，7.86(1H，d)，7.96(1H，d)，7.98(1H，d)，10.84(1H，s)，11.60(1H，s).
制備實(shí)施例29(±)-6-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺?；鵠-3-氧代-1，4-苯并噁嗪-2-甲酸(化合物29)的合成以與制備實(shí)施例17相同的方式處理300mg(0.91mmol)(±)-2-叔丁氧羰基-3-氧代-1，4-苯并噁嗪-6-磺酰胺和349mg(0.91mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸芐基酯，得到417mg(產(chǎn)率74％)5-({[(2-芐氧羰基-5-氯苯氨基)羰基]氨基}磺?；?-3-氧代-3，4-二氫-2H-1，4-苯并噁嗪-2-甲酸叔丁基酯。性質(zhì)無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)1.29(9H，s)，5.37(2H，s)，5.42(2H，s)，7.19-7.26(2H，m)，7.37-7.57(7H，m)，7.97(1H，d)，8.25(1H，d)，10.27(1H，s)，11.25(1H，s)，12.22(1H，br).
然后，以相同方式處理417mg(0.68mmol)所得磺酰脲產(chǎn)物，得到100mg(3步產(chǎn)率32％)的標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)5.47(1H，s)，7.11(1H，s)，7.24(1H，d)，7.29(1H，d)，7.76(1H，s)，7.78(1H，d)，7.86(1H，d)，11.25(1H，s)，11.62(1H，s).
制備實(shí)施例304-[(7-羥基-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺?；鵠鄰氨基苯甲酸(化合物30)的合成以與制備實(shí)施例17相同的方式處理620mg(1.53mmol)3-芐氧羰基氨基-4-叔丁氧羰基苯磺酰胺和550mg(1.51mmol)4-羥基-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸芐基酯，得到25mg(4步產(chǎn)率4％)標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)6.48(1H，s)，6.61(1H，d)，7.14(1H，d)，7.51(1H，s)，7.70(1H，d)，7.90(1H，d)，10.80(1H，s)，11.39(1H，s).
制備實(shí)施例314-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺?；鵠-2-N-丙?；彴被郊姿?化合物31)的合成將840mg(1.86mmol)化合物17溶于8ml 1，4-二噁烷中，加入240μl(2.79mmol)丙酰氯，然后將所得混合物在60℃下攪拌過夜。往該反應(yīng)溶液中加入過量水并用乙酸乙酯萃取該混合物。將如此得到的有機(jī)層洗滌，干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物4-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺酰基]-2-N-丙?；彴被郊姿崾宥』?。將所得該粗產(chǎn)物在室溫下在3ml三氟乙酸中攪拌1小時(shí)，然后真空濃縮該反應(yīng)溶液，得到粗產(chǎn)物。該產(chǎn)物經(jīng)乙醚洗滌，得到400mg(2步產(chǎn)率48％)的標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)1.10(3H，t)，2.45(2H，dd)，7.11(1H，s)，7.24(1H，d)，7.85(1H，d)，7.88(1H，d)，8.17(1H，d)，9.18(1H，s)，11.07(1H，s)，11.63(1H，s).
制備實(shí)施例324-[(6-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺?；鵠鄰氨基苯甲酸(化合物32)的合成以與制備實(shí)施例17相同的方式處理300mg(0.74mmol)3-芐氧羰基氨基-4-叔丁氧羰基苯磺酰胺和310mg(0.81mmol)5-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸芐基酯，得到75mg(4步產(chǎn)率26％)標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)7.13-7.20(2H，m)，7.56(1H，s)，7.72(1H，d)，7.82(1H，s)，7.90(1H，d)，11.68(1H，s).
制備實(shí)施例334-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺?；鵠-2-N-甲磺?；彴被郊姿?化合物33)的合成以與制備實(shí)施例3相同的方式處理200mg(0.44mmol)化合物17，得到81mg 4-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺酰基]-2-N-甲磺酰基鄰氨基苯甲酸叔丁基酯。對(duì)該產(chǎn)物進(jìn)行相同的脫丁基反應(yīng)，得到53mg(2步產(chǎn)率25％)的標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)3.24(3H，s)，7.11(1H，s)，7.25(1H，d)，7.85-7.91(2H，m)，8.23(1H，d)，8.39(1H，s)，11.05(1H，br)，11.70(1H，s).
制備實(shí)施例343-(3-氨基苯磺酰基)-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮甲磺酸鹽(化合物34)的合成將2.15g(6.10mmol)化合物12溶于65ml THF中并滴加0.4ml甲磺酸。往該溶液中，加入200ml乙醚并將過濾所得沉淀，得到2.59g(產(chǎn)率95％)的標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)2.35(3H，s)，6.98(1H，d)，7.12(1H，m)，7.25(1H，m)，7.34(2H，s)，7.43(1H，m)，7.86(1H，s)，11.64(1H，s).
制備實(shí)施例357-氯-3-[4-(吡唑-3-基)苯磺?；鵠-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮鹽酸鹽(化合物35)的合成按照合成方法(B)，將5.65g(25.34mmol)4-(吡唑-3-基)苯磺酰胺溶于60ml THF中，然后滴加7.8ml(52.16mmol)DBU。該反應(yīng)溶液在室溫?cái)嚢?0分鐘后，加入8.5g(27.86mmol)4-氯-2-苯氧羰基-氨基苯甲酸甲酯并在室溫?cái)嚢?小時(shí)。然后，往該反應(yīng)溶液中再加入400mg(0.131mmol)4-氯-2-苯氧羰基氨基苯甲酸甲酯，之后再在室溫下攪拌2小時(shí)。將過量的檸檬酸水溶液加到該反應(yīng)溶液中后，用乙酸乙酯萃取。有機(jī)層用水和飽和鹽水洗滌，然后經(jīng)無水硫酸鈉干燥并濃縮。將甲醇加到濃縮過的殘余物中，攪拌該混合物，過濾所得的結(jié)晶，得到10.49g粗產(chǎn)物。
將所得10.49g粗產(chǎn)物懸浮于45ml甲醇中，然后加入90ml 1N氫氧化鈉水溶液。該反應(yīng)溶液在60℃攪拌40分鐘后，過濾除去沉淀。將濾液真空濃縮并蒸除甲醇，然后將所得水性混合物用乙酸乙酯洗滌。用鹽酸使水層呈酸性，產(chǎn)生結(jié)晶沉淀。過濾得到結(jié)晶。濾液用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和鹽水洗滌后，干燥并經(jīng)無水硫酸鈉濃縮。將濃縮殘余物和上面過濾得到的結(jié)晶合并后，用THF-乙酸乙酯-己烷重結(jié)晶，得到7.70g(72％)N-[4-(吡唑-3-基)苯磺?；鵠-N’-(2-羧基-5-氯苯基)脲(性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)129-132℃，PMR(δppm，DMSO-d6)6.81(1H，d)，7.02(1H，dd)，7.78(1H，s)，7.89-7.92(3H，m)，7.96(2H，d)，8.24(1H，s)，10.57(1H，br).
3.0g(7.14mmol)上面得到的脲衍生物溶于60ml THF中。然后在冰冷下加入1.2g(7.40mmol)CDI并將所得反應(yīng)物攪拌2小時(shí)。該反應(yīng)溶液用乙酸乙酯稀釋后，順序用檸檬酸水溶液、飽和鹽水、0.5M碳酸氫鈉水溶液和飽和鹽水洗滌。有機(jī)層經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，濃縮得到粗產(chǎn)物。該粗產(chǎn)物用乙酸乙酯重結(jié)晶，得到1.93g(產(chǎn)率67％)7-氯-3-[4-(吡唑-3-基)苯磺酰基]-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)124-126℃(分解))，PMR(δppm，CDCl3-CD3OD)6.73(1H，s)，7.09(1H，s)，7.16(2H，d)，7.48(1H，s)，7.66(1H，s)，7.9-8.1(3H，m)，8.32(2H，d).
將545mg(1.35mmol)上面得到的喹唑啉衍生物溶于35ml THF中，然后滴加0.4ml 4M鹽酸的1，4-二噁烷溶液。將20ml乙醚加到該溶液中，然后過濾得到的沉淀結(jié)晶，得到572mg(產(chǎn)率96％)標(biāo)題化合物。性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點(diǎn)＞200℃(分解)， PMR(δppm，DMSO-d6)6.91(1H，d)，7.15(1H，d)，7.24(1H，dd)，7.84(1H，d)，7.86(1H，d)，8.01(2H，d)，8.17(2H，d)，11.7(1H，s).
實(shí)施例1胃促胰酶抑制活性的測(cè)定按照Urata等的方法(J.Biol.Chem.，1990，265，22348)純化人心臟胃促胰酶。以下列方式測(cè)定本發(fā)明喹唑啉衍生物對(duì)胃促胰酶的抑制活性。即，將純化的酶溶液用0.01M Tris-鹽酸緩沖液(pH＝7.5)、1M氯化鈉和0.01％Triton X-100稀釋到適宜濃度得到酶溶液。將10mMSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA(Peptide Institute)的二甲亞砜(下文稱DMSO)溶液用0.01M Tris-鹽酸緩沖液(pH＝7.5)、1M氯化鈉和0.01％Triton X-100稀釋20倍，得到底物溶液。
將溫?zé)岬?0℃的75μl酶溶液與5μl試驗(yàn)樣品的DMSO溶液混合。該混合物在30℃預(yù)先保溫10分鐘。然后，將溫?zé)岬?0℃的20μl底物溶液與該試驗(yàn)樣品-酶混合物混合并于30℃保溫。10分鐘后，加入50μl30％的乙酸以使酶反應(yīng)停止。用熒光光度計(jì)定量測(cè)定產(chǎn)生的AMC的量。同時(shí)，用5μl DMSO代替試驗(yàn)樣品溶液并進(jìn)行相同的反應(yīng)，作為空白試驗(yàn)。胃促胰酶抑制活性以抑制率，即基于空白試驗(yàn)值的50％抑制濃度(IC50)表示。
本發(fā)明的喹唑啉衍生物在100μM濃度下均強(qiáng)烈地抑制人胃促胰酶。代表性化合物的IC50示于表I。
表1

實(shí)施例2蛔蟲屬誘發(fā)的小鼠雙相皮炎模型中皮膚反應(yīng)的時(shí)間過程按照先前描述的方法(Folia Pharmacol.Jap.112，221，1998)誘發(fā)蛔蟲屬引發(fā)的雙相皮炎。即，經(jīng)腹膜內(nèi)注射0.5ml蛔蟲 提取物(800μg/ml，Cosmo BIo Co.，Ltd.)和明礬的鹽水懸浮液(16mg/ml在鹽水中懸浮液)的1∶1混合物敏化8周齡BALB/c小鼠(日本Charles River)。敏化兩周后，向小鼠右耳皮內(nèi)注射10ml蛔蟲提取物(1mg/ml)。在蛔蟲提取物注射之前(n＝3)和注射之后1小時(shí)(n＝4)、2小時(shí)(n＝4)、4小時(shí)(n＝4)、6小時(shí)(n＝4)、16小時(shí)(n＝4)和24小時(shí)(n＝4)，通過稱重用沖床(直徑6mm，F(xiàn)ukui Kiko Shokai)制備的耳部活檢組織評(píng)價(jià)在耳部誘發(fā)的水腫。以同一只小鼠右耳與左耳間的耳部活檢組織的重量差表示水腫(mg)。
通過向以相同抗原致敏的小鼠的耳部皮內(nèi)施以蛔蟲提取物引發(fā)雙相皮炎(附圖1)。1小時(shí)后，第一反應(yīng)達(dá)到頂峰，16小時(shí)后，第二反應(yīng)達(dá)到頂峰。
實(shí)施例3胃促胰酶抑制劑在蛔蟲屬誘發(fā)的小鼠雙相皮炎模型中作用按照實(shí)施例2描述的方法誘發(fā)皮炎，并以實(shí)施例2的相同方式測(cè)定耳部水腫，在對(duì)耳部皮內(nèi)施用蛔蟲提取物后1小時(shí)(n＝6)和16小時(shí)(n＝8)，觀察試驗(yàn)物質(zhì)對(duì)皮炎的作用。使用化合物34作為胃促胰酶抑制劑。使用diphenhydrazine(抗組胺藥，Sigma)和潑尼松龍(甾類，Nakarai TescCo.)作為對(duì)照藥物。將研究的各種藥物懸浮于含0.5％羥丙基纖維素的鹽水中，在皮內(nèi)施用蛔蟲提取物后60分鐘時(shí)經(jīng)腹膜內(nèi)施用。用以蛔蟲提取物致敏的并經(jīng)皮內(nèi)注射鹽水挑戰(zhàn)的小鼠作為對(duì)照(n＝3)。
結(jié)果腹膜內(nèi)施用胃促胰酶抑制劑(化合物34)的結(jié)果是，蛔蟲提取物誘發(fā)1小時(shí)后的反應(yīng)(早期反應(yīng))和16小時(shí)后的反應(yīng)(晚期反應(yīng))均以劑量方式被抑制。在50mg/kg劑量下觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(附圖2A)。50mg/kg下的早期反應(yīng)抑制率為約41％，晚期反應(yīng)抑制率為約45％(p都小于0.01，Dunnett檢驗(yàn))。對(duì)特應(yīng)性皮炎有效的潑尼松龍，在30mg/kg劑量下對(duì)早期反應(yīng)基本無效，但強(qiáng)烈抑制晚期反應(yīng)(抑制率67％)(附圖2B)。另一方面，diphenhydrazine明顯抑制早期反應(yīng)(抑制率79％)，但對(duì)晚期反應(yīng)基本上沒有作用(附圖2C)。
胃促胰酶抑制劑對(duì)表現(xiàn)出雙相皮膚反應(yīng)的變應(yīng)性皮炎模型表現(xiàn)出抑制作用的事實(shí)表明，胃促胰酶與變應(yīng)性雙相皮炎有關(guān)，因此胃促胰酶抑制劑可用于此類皮炎。特別是，胃促胰酶抑制劑同甾類一樣，明顯抑制晚期反應(yīng)，而抗組胺藥和抗變應(yīng)性藥物對(duì)晚期反應(yīng)基本沒有作用的發(fā)現(xiàn)表明胃促胰酶抑制劑可用于特應(yīng)性皮炎。在下面的實(shí)施例4-6中，為進(jìn)一步證實(shí)胃促胰酶在雙相皮膚反應(yīng)中的重要性，分析對(duì)小鼠耳部接種人胃促胰酶誘發(fā)的皮膚病癥。
實(shí)施例4單次施用人胃促胰酶誘發(fā)皮炎的能力在該實(shí)施例中施用重組人胃促胰酶。按照生產(chǎn)絲氨酸蛋白酶的已知方法(Biochem.Biophys.Acta 1350，11，1997)，通過表達(dá)和純化獲得重組的人胃促胰酶。即，首先，通過PCR方法擴(kuò)增編碼成熟人胃促胰酶(J.Biol.Chem.266，17173，1991)的cDNA(79-756)。將PCR產(chǎn)物與人胰蛋白酶II的信號(hào)序列和包括腸激酶裂解位點(diǎn)的區(qū)域(23個(gè)氨基酸)一起克隆到pDE載體中。將構(gòu)建的人胃促胰酶表達(dá)制粒轉(zhuǎn)染到CHOdhfr細(xì)胞中，并通過已知方法(Arch.Biochem.BIophys.307，133，1993)選擇轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞。用HiTrap Heparin柱(Amersham Pharmacia Biotech)濃縮所得細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中的分泌的人胃促胰酶和胰蛋白酶的融合蛋白，然后用腸激酶(Invitrogen)裂解，產(chǎn)生人的成熟胃促胰酶。用肝素5PW柱(Tosoh Corp.)純化人的成熟胃促胰酶。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析中，純化的胃促胰酶顯示33-36kDa的譜帶。另外，在0.1MTris/HCl緩沖液(pH8.0)中，用1mM Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA(PeplideInstitute)作為底物并測(cè)定游離MCA的熒光強(qiáng)度來測(cè)定胃促胰酶的活性。結(jié)果證實(shí)純化的胃促胰酶確實(shí)具有酶活性。
然后，為研究胃促胰酶對(duì)皮炎的作用，將20μl上述重組人胃促胰酶(下文稱人胃促胰酶)(0.1mg/ml)皮內(nèi)施用于BALB/c小鼠(日本Charles River)的耳部，并采用實(shí)施例2中描述的方法測(cè)定耳部的水腫反應(yīng)的時(shí)間過程(n＝3-4)。此外，類似地皮內(nèi)施用組胺(肥大細(xì)胞的炎性介質(zhì))并將該反應(yīng)過程與施用人胃促胰酶的情況進(jìn)行比較。組胺(Sigma-Aldrich)以溶于鹽水的形式(0.25mg/ml)進(jìn)行注射。
如附圖3A所示，通過對(duì)小鼠耳部施用人胃促胰酶(2.0μg/耳)，誘發(fā)類似于實(shí)施例2中的變應(yīng)性皮膚反應(yīng)的雙相水腫反應(yīng)。即，在施用人胃促胰酶后立即誘發(fā)第一皮膚反應(yīng)，該反應(yīng)在30分鐘-1小時(shí)時(shí)達(dá)到頂峰。再者，第二皮膚反應(yīng)在6小時(shí)后達(dá)到頂峰并持續(xù)至少24小時(shí)。另一方面，甚至在接種組胺時(shí)也誘發(fā)立即的水腫反應(yīng)，但與接種胃促胰酶的情況相反，該反應(yīng)在接種后20小時(shí)時(shí)完全消失(附圖3B)。對(duì)胃促胰酶誘發(fā)皮炎的劑量-依賴性分析揭示了早期反應(yīng)(1小時(shí)后)是劑量依賴性的，在實(shí)驗(yàn)中使用2.0μg/耳的量觀察到最大反應(yīng)(附圖4A)。另一方面，在第二反應(yīng)(16小時(shí)后)，在0.5μg/耳和1.0μg/耳劑量下的具有大約相同的反應(yīng)水平，以與第一反應(yīng)相同的方式，在2.0μg/耳劑量下可獲得最大反應(yīng)(附圖4B)如上顯示，對(duì)小鼠皮內(nèi)施用人胃促胰酶誘發(fā)了皮炎，其時(shí)間過程類似于抗原誘發(fā)的雙相皮炎(一種急性皮炎模型)的時(shí)間過程，表明胃促胰酶與雙相皮炎有關(guān)。
實(shí)施例5胃促胰酶活性與單次施用胃促胰酶誘發(fā)的皮炎的關(guān)系為研究胃促胰酶的酶活性是否與所示由人胃促胰酶誘發(fā)的皮炎有關(guān)，觀察熱處理過的胃促胰酶誘發(fā)皮炎的能力。通過將0.1mg/ml人胃促胰酶溶液在50℃保溫2小時(shí)，然后在100℃煮沸5分鐘，使人胃促胰酶失活。按照實(shí)施例4中描述的方法，對(duì)耳部施用失活的人胃促胰酶(2.0μg/耳)，施用后1小時(shí)評(píng)價(jià)皮炎。
熱處理人胃促胰酶的結(jié)果是由人胃促胰酶誘發(fā)的水腫反應(yīng)完全消失(與未處理的胃促胰酶施用組相比的p＜0.01，學(xué)生t檢驗(yàn)，N＝4)(附圖5)。結(jié)果顯示胃促胰酶活性為誘發(fā)皮炎所必要。
實(shí)施例6單次施用胃促胰酶誘發(fā)的皮炎的組織學(xué)分析為進(jìn)一步研究胃促胰酶與雙相皮炎的關(guān)系，對(duì)胃促胰酶誘發(fā)的皮炎的進(jìn)行病理組織學(xué)分析，并與將其實(shí)施例2中所示雙相皮炎進(jìn)行比較。按照實(shí)施例2和實(shí)施例4描述的方法(人胃促胰酶的劑量為2.0μg/耳)誘發(fā)這些類型的皮炎。在兩種模型施用后1小時(shí)和24小時(shí)時(shí)，按照常規(guī)方法，在福爾馬林中固定鼠耳并制備石蠟切片。將切片用蘇木精和曙紅染色，然后在顯微鏡下觀察并照相。另外，用正常BALB/c小鼠的耳部切片作為陰性對(duì)照。
與正常小鼠的耳部切片相比，在胃促胰酶性皮炎引發(fā)后1小時(shí)的切片(附圖6D)中，觀察到明顯的增厚(附圖6A)；但在白細(xì)胞浸潤上，觀察到兩組沒有明顯區(qū)別。但是，如附圖6E所示，在胃促胰酶注射后24小時(shí)的切片中觀察到了白細(xì)胞的明顯浸潤。胃促胰酶性皮炎顯示的組織學(xué)類型類似于蛔蟲誘發(fā)的雙相皮炎模型(附圖6B和6C)。即，1小時(shí)時(shí)的組織顯著增厚，但僅在24后才觀察到細(xì)胞浸潤。總之，即使在病理組織分析方面，胃促胰酶誘發(fā)的皮炎也與抗原誘發(fā)的雙相皮炎類似。
在下列實(shí)施例7和實(shí)施例8中，為研究胃促胰酶在雙相皮炎中的作用，分析胃促胰酶誘發(fā)皮炎的機(jī)理。
實(shí)施例7人胃促胰酶誘發(fā)缺乏肥大細(xì)胞的小鼠皮炎的能力因?yàn)閾?jù)報(bào)道，胃促胰酶誘發(fā)大鼠腹膜肥大細(xì)胞脫粒(J.Immunol.136，3812，1986)，故認(rèn)為胃促胰酶可能是通過肥大細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)而誘發(fā)皮炎的。由此，隨之用肥大細(xì)胞缺乏的小鼠研究了肥大細(xì)胞與胃促胰酶誘發(fā)皮炎的關(guān)系(Blood 52，447-425，1978)。從日本SLC獲得肥大細(xì)胞缺乏的(WBB6F1-W/Wv)小鼠和它們的對(duì)照小鼠(WBB6F1-+/+)。采用實(shí)施例4中描述的方法，通過皮內(nèi)施用人胃促胰酶(2.0μg/耳)誘發(fā)胃促胰酶性皮炎并在1小時(shí)和16小時(shí)后評(píng)價(jià)水腫反應(yīng)。
如附圖7A和7B所示，在1小時(shí)(附圖7A)和16小時(shí)(附圖7B)后，即使在肥大細(xì)胞缺乏的(WBB6F1-W/Wv)小鼠中也觀察到了與對(duì)照小鼠(Wbb6F1-+/+)程度類似的皮膚反應(yīng)。該結(jié)果表明，無論是否存在肥大細(xì)胞，胃促胰酶都誘發(fā)雙相皮膚反應(yīng)。
實(shí)施例8人胃促胰酶促進(jìn)多形核白細(xì)胞遷移的能力實(shí)施例6顯示，在人胃促胰酶誘發(fā)的皮炎的晚期反應(yīng)中觀察到明顯的白細(xì)胞浸潤。為研究胃促胰酶誘發(fā)白細(xì)胞浸潤的機(jī)理，體外觀察人胃促胰酶對(duì)多形核白細(xì)胞(PMN)遷移的作用。如下分離PMN向取自正常健康者的肝素化全血中加入1/5體積的6％葡聚糖溶液，并使其在37℃下放置1小時(shí)，然后在Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia Biotech)中使上清液分層并離心。再按照教科書的方法(BiopharmacologyExperiment Lectures 12，315，Hirokawa Shoten)，用48孔趨化性小室(Neuroprobe Co.)測(cè)定PMN的遷移。即，在小室的下部孔中放入含人胃促胰酶(200-800nM)或fMLP(N-甲酰-L-甲硫氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酸，Sigma-Aldrich Co.)(10mM)的培養(yǎng)基。通過聚碳酸酯纖維(5μm孔徑)(Neuroprobe Co.)隔離上部孔和下部孔，將PMN(1×106/ml)加到上部孔中并在37℃培養(yǎng)1小時(shí)，然后固定濾膜，染色并在顯微鏡(400X)下計(jì)數(shù)膜中的細(xì)胞數(shù)(Seibutsu Yakkagaku Jikken Koza(Biopharmacology Experiment Lectures)12，315)。用hemacolor溶液(Merck)進(jìn)行細(xì)胞染色。在該試驗(yàn)中，當(dāng)研究胃促胰酶抑制劑的作用時(shí)，將胃促胰酶抑制劑(化合物18或化合物34)溶于二甲亞砜并在臨加入人胃促胰酶之前將其加到小室的下部孔中。調(diào)整化合物的濃度以使二甲亞砜的終濃度為1％。
由附圖8A，觀察到人胃促胰酶以濃度依賴方式促進(jìn)人PMN的遷移(在≥400nM時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義，p＜0.05，Dunett’s檢驗(yàn))。200-400nM濃度的人胃促胰酶表現(xiàn)出與10nM fMLP相同的促進(jìn)遷移活性的事實(shí)，推斷其活性約為fMLP的1/30。人胃促胰酶促進(jìn)人PMN遷移的作用被人胃促胰酶抑制劑(化合物18和化合物34)顯著抑制(附圖8B)。這些結(jié)果表明胃促胰酶直接作用于多形核白細(xì)胞，促進(jìn)它們的遷移，并顯示胃促胰酶的酶活性與該作用有關(guān)。
總而言之，因?yàn)楫?dāng)對(duì)小鼠耳部皮內(nèi)注射時(shí)，在抗原刺激下，由肥大細(xì)胞釋放的胃促胰酶誘發(fā)雙相皮膚反應(yīng)(實(shí)施例4-6)，因此，十分清楚，胃促胰酶在表現(xiàn)出雙相反應(yīng)的皮膚反應(yīng)中起著重要作用。實(shí)施例7和8的數(shù)據(jù)提示人們，胃促胰酶與雙相皮膚反應(yīng)有關(guān)的機(jī)制。此外，還顯示胃促胰酶抑制劑抑制由蛔蟲誘發(fā)的皮炎(一種雙相皮膚反應(yīng))(實(shí)施例2和實(shí)施例3)。
其次，以重復(fù)應(yīng)用半抗原的誘發(fā)性小鼠皮炎模型作為與抗原重復(fù)接觸誘發(fā)性皮炎模型進(jìn)行分析并顯示胃促胰酶抑制劑在該模型中的作用。
實(shí)施例9通過重復(fù)應(yīng)用半抗原誘發(fā)的小鼠皮炎模型中耳部厚度增加的時(shí)間過程按照已知方法(J.Pharmacol.Exp.Ther.283，321，1997)，用二硝基氟代苯(DNFB)作為半抗原誘發(fā)皮炎。即，對(duì)8周齡雌性C3H/HeN小鼠(Nippon Clare)(n＝7)的右耳涂以0.15％ DNFB溶于丙酮/橄欖油(3∶1)中的溶液(25μl)，每七天涂抹6次。在每次應(yīng)用半抗原時(shí)，在臨應(yīng)用前以及應(yīng)用后1、6、24和48小時(shí)后立即用測(cè)微計(jì)(DigimaticIndicator，Mitsutoyo Co.)測(cè)定耳部厚度，以得出與第一次應(yīng)用半抗原之前的耳部厚度相比的增加量。另外，類似地，用不含DNFB的丙酮/橄欖油溶液(3∶1)處理的組作為對(duì)照組。再者，在一個(gè)與上面試驗(yàn)分離的試驗(yàn)中，在臨應(yīng)用第三次半抗原之前立即切割下耳朵，按照已知方法測(cè)定皮膚的胃促胰酶樣活性(n＝3)，并將其與用不含DNFB丙酮/橄欖油溶液(3∶1)處理過的小鼠(n＝3)的活性進(jìn)行比較。
應(yīng)用DNFB誘發(fā)暫時(shí)性皮膚反應(yīng)。該暫時(shí)性皮膚反應(yīng)隨每次應(yīng)用逐漸增大(附圖9)。重復(fù)應(yīng)用DNFB，除對(duì)DNFB的反應(yīng)增強(qiáng)外，應(yīng)用前(基值)的耳部厚度也逐漸增加。例如，與第一次應(yīng)用前的耳部相比，在開始應(yīng)用后第五周時(shí)，臨應(yīng)用前的耳部厚度增加了約240μm(附圖9)。在僅用不含DNFB的溶劑處理的對(duì)照組中，在任何時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的耳部厚度幾乎都沒有增加。第三次臨應(yīng)用前的耳部的胃促胰酶活性明顯高于僅用不含DNFB的溶劑處理的對(duì)照組(p＜0.05，學(xué)生t檢驗(yàn))(附圖10)?？傊砻鲗?duì)小鼠耳部重復(fù)應(yīng)用半抗原DNFB除增強(qiáng)胃促胰酶活性和引發(fā)明顯的暫時(shí)性反應(yīng)外，還誘發(fā)持久的耳部增厚。
實(shí)施例10胃促胰酶抑制劑在重復(fù)應(yīng)用半抗原誘發(fā)的小鼠皮炎模型中的作用按照實(shí)施例9中描述的方法，通過誘發(fā)皮炎研究試驗(yàn)物質(zhì)對(duì)皮炎的作用(n＝7)并以相同于實(shí)施例9的方式測(cè)定耳部厚度。使用三種胃促胰酶抑制劑(化合物18、化合物34和化合物35)作為試驗(yàn)物質(zhì)，同時(shí)使用甾類潑尼松龍(Nakarai Tesc Inc.)作為對(duì)照。另外，以相同于實(shí)施例3的方式，將試驗(yàn)物質(zhì)懸浮于含0.5％羥丙基纖維素的鹽水(HPC/鹽水)中并以每天10mg/kg或50mg/kg的劑量經(jīng)腹膜內(nèi)給予，每周連續(xù)給予五天直至試驗(yàn)結(jié)束；在臨開始應(yīng)用半抗原前進(jìn)行第一次給藥。另外，用類似地以DNFB處理的和用HPC/鹽水代替試驗(yàn)物質(zhì)的組作為對(duì)照組。
潑尼松龍以劑量-依賴方式抑制該模型的皮炎(附圖11A)。另一方面，胃促胰酶抑制劑也顯著抑制應(yīng)用半抗原誘發(fā)的暫時(shí)性皮膚反應(yīng)，尤其是在第四周(在開始應(yīng)用半抗原后3周)后(附圖11B-D)。例如，在第四至第六周(在開始應(yīng)用半抗原3周，和其后)中，在半抗原應(yīng)用后1、6、24和48小時(shí)，50mg/ml的化合物35顯著抑制耳部增厚(p＜0.05，Dunett’s檢驗(yàn))。在第五周后的應(yīng)用后1-48小時(shí)(開始應(yīng)用半抗原后四周，和其后)，50mg/ml的化合物34也顯著抑制皮膚反應(yīng)；并且甚至10mg/kg量的化合物34在第五周后的1、24和48小時(shí)(第五次應(yīng)用半抗原后)以及第六周后的1小時(shí)(第六次應(yīng)用半抗原后)也表現(xiàn)出明顯抑制作用。另外，50mg/kg的化合物18明顯抑制第四周和第五周應(yīng)用后1-24小時(shí)(第四周應(yīng)用和第五周應(yīng)用半抗原后)以及第六周1-48小時(shí)(第六次應(yīng)用半抗原后)的反應(yīng)，并且甚至10mg/kg的化合物34在第六周(第六次應(yīng)用半抗原后)應(yīng)用后1-48小時(shí)也表現(xiàn)出明顯作用。
這些結(jié)果顯示胃促胰酶抑制劑抑制重復(fù)應(yīng)用半抗原誘發(fā)的小鼠皮炎模型的水腫。
實(shí)施例11在重復(fù)應(yīng)用半抗原誘發(fā)的小鼠皮炎模型中胃促胰酶抑制劑對(duì)皮膚中嗜酸性粒細(xì)胞增多的作用研究胃促胰酶對(duì)實(shí)施例10試驗(yàn)中的皮膚的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤的影響。即，在第六次應(yīng)用半抗原后48小時(shí)，按常規(guī)方法用福爾馬林固定小鼠的耳部并制備石蠟切片。用已知特異性染色嗜酸性粒細(xì)胞的(CurrentProtocol in Immunology，Wiley Interscience)堅(jiān)牢綠(Fluka)染色切片。即，將除去石蠟的切片用100％甲醇固定1分鐘，然后用溶于70％乙醇的0.2％牢固綠染色30分鐘。在顯微鏡(X400)下，隨機(jī)選擇10個(gè)視野并用目測(cè)網(wǎng)格計(jì)數(shù)每個(gè)視面的細(xì)胞數(shù)量以測(cè)量嗜酸性粒細(xì)胞。用化合物18和化合物34作為胃促胰酶抑制劑并通過實(shí)施例10描述的方法施用。另外，以用不含DNFB的丙酮/橄欖油(3∶1)處理的組為非誘發(fā)性對(duì)照組，以用DNFB處理的并且施以HPC/鹽水代替試驗(yàn)物質(zhì)的組為施用胃促胰酶抑制劑組的對(duì)照組。
如附圖12所示，重復(fù)應(yīng)用半抗原導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量顯著增加(約是對(duì)照組的22倍，p＜0.01，學(xué)生t檢驗(yàn))。施用胃促胰酶抑制劑(化合物18)的結(jié)果是以劑量依賴性方式明顯抑制嗜酸性粒細(xì)胞的增多。即，在10 mg/kg和50 mg/kg下的抑制率分別為37.1％和60.5％。對(duì)于化合物34，認(rèn)為沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，也顯示了依賴于劑量的抑制趨勢(shì)。這些結(jié)果表明胃促胰酶抑制劑抑制重復(fù)應(yīng)用半抗原誘發(fā)的小鼠皮炎模型中皮膚的嗜酸性粒細(xì)胞的增多。
實(shí)施例12在重復(fù)應(yīng)用半抗原誘發(fā)的小鼠皮炎模型中胃促胰酶抑制劑對(duì)皮膚中肥大細(xì)胞數(shù)量增加的作用研究胃促胰酶抑制劑對(duì)實(shí)施例10的試驗(yàn)中皮膚肥大細(xì)胞增多的影響。以與實(shí)施例11相同的方式，在第六次應(yīng)用半抗原后48小時(shí)，按常規(guī)方法用福爾馬林固定小鼠耳部并制備石蠟切片。通過甲苯胺藍(lán)方法對(duì)肥大細(xì)胞切片染色，然后在顯微鏡(X400)下，對(duì)每個(gè)切片的10個(gè)視野計(jì)數(shù)肥大細(xì)胞的數(shù)量。按照Kitagaki等的方法(J.Invest.Dermatol.105，749，1995)，測(cè)定皮膚中肥大細(xì)胞的密度。用化合物18和化合物34作為胃促胰酶抑制劑。按照實(shí)施例10描述的方法施用。另外，以用不含DNFB的丙酮/橄欖油(3∶1)處理的組為非誘發(fā)性對(duì)照組，以用DNFB處理的并且施以HPC/鹽水代替試驗(yàn)物質(zhì)的組為施用胃促胰酶抑制劑組的對(duì)照組。
如附圖13所示，應(yīng)用半抗原顯著增高皮膚中肥大細(xì)胞的密度(約是非誘發(fā)組的2.5倍)，但施用胃促胰酶抑制劑(化合物18和化合物34)的結(jié)果是，肥大細(xì)胞密度的增高被所有劑量的兩種化合物顯著抑制?；衔?8在10mg/kg時(shí)的抑制率為約57％，在50mg/kg時(shí)的抑制率為約64％，化合物34在10mg/kg時(shí)的抑制率為約37％，在50mg/kg時(shí)的抑制率為約51％。附圖14顯示了代表性顯微圖。附圖14A顯示了非誘發(fā)性小鼠的耳部，附圖14B顯示了用DNFB處理的并施以HPC/鹽水(在第六次應(yīng)用DNFB后48小時(shí))小鼠的耳部，附圖14C顯示了用DNFB處理的并且施以化合物34(在第六次應(yīng)用DNFB后48小時(shí))的小鼠的耳部。這些結(jié)果表明在重復(fù)應(yīng)用半抗原誘發(fā)的小鼠皮炎模型中，胃促胰酶抑制劑抑制皮膚中肥大細(xì)胞數(shù)量的增加。
實(shí)施例13重復(fù)施用人胃促胰酶誘發(fā)皮炎的能力通過對(duì)小鼠耳部重復(fù)皮內(nèi)施用人胃促胰酶研究胃促胰酶在與抗原重復(fù)接觸誘發(fā)的皮炎中的作用。按照實(shí)施例4中描述的方法，每周施用一次人胃促胰酶(2.0μg/耳/每次注射)。在每次臨施用胃促胰酶之前和施用后1、6、24和48小時(shí)用測(cè)微計(jì)(Digimatic Indicator，Mitsutoyo Co.)測(cè)量耳部厚度，以得出與第一次施用胃促胰酶之前相比耳部厚度的增加。另外，采用實(shí)施例5中描述的方法制備熱處理過的胃促胰酶，并研究其作用。
對(duì)小鼠耳部皮內(nèi)施用人胃促胰酶誘發(fā)暫時(shí)性皮膚反應(yīng)。在第一次到第三次施用胃促胰酶期間，對(duì)胃促胰酶的反應(yīng)性大致相同，但在第四次至第五次施用期間產(chǎn)生了放大反應(yīng)(附圖15)。當(dāng)重復(fù)施用失活的胃促胰酶時(shí)，沒有觀察到暫時(shí)性反應(yīng)。另外，當(dāng)重復(fù)施用該失活的胃促胰酶時(shí)，竟然沒有觀察到任何皮膚反應(yīng)(附圖15)。這顯示了觀察到的皮膚反應(yīng)是由于胃促胰酶的酶活性，當(dāng)施用四-五次胃促胰酶時(shí)觀察到的放大皮膚反應(yīng)并不是因?yàn)閷?duì)小鼠施用了外源性蛋白。
實(shí)施例14重復(fù)施用人胃促胰酶對(duì)皮膚中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量的影響對(duì)小鼠耳部重復(fù)施用人胃促胰酶以觀察皮膚中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量的變化。按照實(shí)施例13中描述的方法，對(duì)小鼠耳部重復(fù)施用人胃促胰酶。采用實(shí)施例11中描述的方法測(cè)定皮膚中嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量。另外，以重復(fù)施用鹽水的耳部組織作為對(duì)照。
如附圖16所示，與施用鹽水的耳部相比，在單次施用2.0μg人胃促胰酶后24小時(shí)時(shí)，耳中嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量增加了約7.6倍(p＜0.01，學(xué)生t檢驗(yàn))。當(dāng)以1周間隔施用人胃促胰酶，總共施用四次時(shí)，在每次施用后一周時(shí)測(cè)定嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量，嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量也增加到鹽水施用組的約21倍(p＜0.01，學(xué)生t檢驗(yàn))。這些結(jié)果表明了胃促胰酶提高嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量以及該增多率取決于與胃促胰酶接觸的頻率的可能性。
實(shí)施例15重復(fù)施用人胃促胰酶對(duì)皮膚中肥大細(xì)胞數(shù)量的影響對(duì)小鼠耳部重皮內(nèi)施用人胃促胰酶以觀察皮膚中肥大細(xì)胞數(shù)量的變化。按照實(shí)施例13描述的方法重復(fù)施用人胃促胰酶，采用實(shí)施例12描述的方法或者測(cè)定皮膚中組胺含量的方法，研究施用胃促胰酶后1周的皮膚中肥大細(xì)胞的變化。如下測(cè)定皮膚組胺含量割下耳部，在20mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)中勻化，離心提取物(10,000rpm，10分鐘)，然后用ELISA檢測(cè)盒(Medical Biological Laboratories)分析上清液中的組胺量。另外，用重復(fù)施用鹽水的耳部組織作為對(duì)照。
按照實(shí)施例12中描述的方法觀察皮膚中肥大細(xì)胞數(shù)量的變化，看到了施用人胃促胰酶導(dǎo)致肥大細(xì)胞數(shù)量增加的趨勢(shì)。但是，該細(xì)胞數(shù)量的增加不顯著。為更客觀或者定量地評(píng)價(jià)皮膚肥大細(xì)胞數(shù)量的增加，測(cè)定皮膚中作為組織中肥大細(xì)胞數(shù)量的指示劑的組胺含量。結(jié)果，如附圖17所示，在第四次施用人胃促胰酶后一周時(shí)，皮膚的組胺含量明顯高于施用鹽水的組。由這些結(jié)果，提示存在這樣一種機(jī)制由肥大細(xì)胞產(chǎn)生的胃促胰酶以正反饋方式作用于肥大細(xì)胞。
實(shí)施例16人胃促胰酶的施用對(duì)干細(xì)胞因子(SCF)的影響為搞清施用人胃促胰酶時(shí)肥大細(xì)胞數(shù)量增加的作用機(jī)制，采用免疫組織化學(xué)方法分析表達(dá)的干細(xì)胞因子(SCF)，該因子已知是一種負(fù)責(zé)肥大細(xì)胞分化和增殖的因子(Blood 90，1345，1997)。采用實(shí)施例4的方法對(duì)小鼠耳部施用人胃促胰酶(2.0μg/耳)。在1、6和24小時(shí)后，收獲耳組織并采用常規(guī)方法制備5μm的冷凍組織切片。用正常小鼠的耳部作為對(duì)照。在免疫組織化學(xué)分析中，用抗小鼠SCF山羊IgG(由R&D Systems制備)作為用于PAP試劑盒(DAKO Co.)測(cè)定的初級(jí)抗體。需要說明的是，用正常山羊IgG(Vector Laboratories Co.)代替SCF抗體作為陰性對(duì)照。另外，在免疫染色后，按照常規(guī)方法(Sensyokuho no Subete(Everything About Dyeing)，Ishiyaku Shuppan)用甲基綠(Wako PureChemicals)染色細(xì)胞核。
在正常小鼠耳部，在表皮的角質(zhì)層(corneal layer)周圍觀察到強(qiáng)烈的免疫染色(附圖18A)。另一方面，當(dāng)使用正常山羊IgG代替抗SCF抗體作為初級(jí)抗體時(shí)，沒有觀察到絲毫的免疫染色。這表明角質(zhì)層的免疫染色是特異性的。另一方面，在使用胃促胰酶的小鼠耳部，角質(zhì)層周圍的染色以時(shí)間依賴方式變?nèi)酢?4小時(shí)后，耳部幾乎觀察不到形成的顏色(附圖18B)。
實(shí)施例17人胃促胰酶對(duì)人角質(zhì)細(xì)胞中SCF表達(dá)的影響研究人胃促胰酶在體外對(duì)人正常角質(zhì)細(xì)胞中SCF的表達(dá)的影響。從Cell Applications Co.獲得人的正常角質(zhì)細(xì)胞。用不含酶的細(xì)胞分離緩沖液(GIBCO BRL Co.)收獲培養(yǎng)的角質(zhì)細(xì)胞，用PBS洗滌三次，然后將細(xì)胞濃度調(diào)整到106/50μl，加入人胃促胰酶并使其在37℃反應(yīng)10分鐘。加入終濃度為10％的胎牛血清(FCS)使胃促胰酶反應(yīng)停止，然后離心除去細(xì)胞。用ELISA試劑盒(PeproTech Co.)分析上清液中的SCF。用細(xì)胞毒性測(cè)定試劑盒(Roche Molecular Biochemicals Co.制備)作為乳酸脫氫酶(LDH)的指示劑，研究胃促胰酶對(duì)角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
如附圖19所示，在人胃促胰酶的存在下將角質(zhì)細(xì)胞保溫10分鐘，SCF的釋放以劑量依賴方式得到促進(jìn)。當(dāng)在沒有人胃促胰酶的存在下，將其培養(yǎng)10分鐘時(shí)，SCF的釋放量與不進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)的釋放量大致相同。另一方面，在各種情況下，上清液中釋放的LDH沒有變化。這證實(shí)了因?yàn)槿宋复僖让傅腟CF的釋放不是因?yàn)榧?xì)胞的損害。綜上所述，體外表明人胃促胰酶作用于人角質(zhì)細(xì)胞的膜結(jié)合的SCF并引起游離SCF的釋放。
SCF由因不同結(jié)合產(chǎn)生的兩類分子SCF248和SCF220組成(Blood 90，1345，1997)。SCF248首先以細(xì)胞膜蛋白形式被合成，然后在數(shù)種蛋白酶的作用下成為游離的SCF，而后該SCF由細(xì)胞釋放。另一方面，SCF220不具有任何被酶消化的位點(diǎn)，因此僅具有膜蛋白功能(Blood 90，1345，1997)。Longley等提供的數(shù)據(jù)表明，健康者皮膚SCF主要在表皮角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)，但是在伴隨皮膚肥大細(xì)胞增多的皮炎情況下，不再能觀察到細(xì)胞上SCF的表達(dá)，在真皮和角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞間檢測(cè)到了SCF(N.Engl.J.Med.328，1302，1993)。再者，在用于過度表達(dá)220SCF和248SCF的轉(zhuǎn)基因小鼠中，觀察到皮膚肥大細(xì)胞數(shù)量的增加，但在僅過度表達(dá)SCF220中的轉(zhuǎn)基因小鼠中并未觀察到該現(xiàn)象(J.Exp.Med.187，1565，1998)。這些發(fā)現(xiàn)提示我們，膜結(jié)合型和游離型SCF的病生理作用不同，特別是游離SCF與皮膚肥大細(xì)胞數(shù)量的增加密切相關(guān)。事實(shí)上，人們已經(jīng)已知向人皮膚施用游離SCF導(dǎo)致皮膚中肥大細(xì)胞數(shù)量的增加(J.Exp.Med.183，2681，1996)。
Longley等還報(bào)道，人胃促胰酶裂解膜結(jié)合的SCF并將其轉(zhuǎn)化為游離SCF(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，9017，1997)。實(shí)施例16的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)完全是一種新發(fā)現(xiàn)，它證實(shí)了Longley等的報(bào)道。實(shí)施例17的發(fā)現(xiàn)顯示了使用人細(xì)胞的初始數(shù)據(jù)。另外也可以說，實(shí)施例16和17的發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)解釋了實(shí)施例15所示施用胃促胰酶引發(fā)的皮膚肥大細(xì)胞增多以及實(shí)施例12中所示的胃促胰酶抑制劑抑制皮膚肥大細(xì)胞增多作用的機(jī)制。
通過人工施用因抗原刺激導(dǎo)致肥大細(xì)胞釋放的外部胃促胰酶引發(fā)的皮膚反應(yīng)隨重復(fù)施用次數(shù)增加而放大的事實(shí)(實(shí)施例13)，清楚地表明胃促胰酶在與抗原重復(fù)接觸引發(fā)的皮炎中起著重要作用。再者，由胃促胰酶抑制劑抑制重復(fù)應(yīng)用半抗原誘發(fā)的皮炎中皮膚中嗜酸性粒細(xì)胞或肥大細(xì)胞增多(實(shí)施例11和12)以及施用胃促胰酶導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞或肥大細(xì)胞增多(實(shí)施例14-15)的事實(shí)，清楚地說明胃促胰酶控制在變態(tài)反應(yīng)中起重要作用的嗜酸性粒細(xì)胞或肥大細(xì)胞的數(shù)量。此外，還顯示胃促胰酶抑制劑改善由重復(fù)應(yīng)用半抗原誘發(fā)的皮炎中皮炎的癥狀，所述模型是一種通過與抗原重復(fù)接觸誘發(fā)的皮炎模型(實(shí)施例9和10)。
接下來，顯示胃促胰酶抑制劑對(duì)作為第二種通過與抗原重復(fù)接觸誘發(fā)的皮炎模型的自然發(fā)生皮炎(NC/Nga)的小鼠的作用。
實(shí)施例18胃促胰酶抑制劑對(duì)自然發(fā)生皮炎(NC/Nga)小鼠的作用按照先前報(bào)道中描述的方法(Progress in Medicine 19，1201，1999)喂養(yǎng)NC/Nga小鼠。具體地說是，將從日本Charles River得到的并在沒有特定病原體(SPF)的環(huán)境下飼養(yǎng)的5周齡大NC/Nga小鼠，從6周齡開始與Hiroshima University的應(yīng)用生物科學(xué)系飼養(yǎng)的NC/Nga小鼠混合并在正常的非SPF環(huán)境中喂養(yǎng)至15周齡，然后用于試驗(yàn)。試驗(yàn)在非SPF的常規(guī)環(huán)境中進(jìn)行。將試驗(yàn)物質(zhì)(化合物18)與飲用水混合并以150mg/kg/天(n＝7)的劑量連續(xù)施用35天，然后按照先前報(bào)道中描述的方法(Progress in Medicine 19，1201，1999)進(jìn)行評(píng)價(jià)。即，首先，在開始施用35天后，對(duì)五項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行0-2級(jí)的評(píng)分(1)搔癢行為，(2)水腫，(3)紅斑和出血，(4)脫毛和潰瘍，及(5)干燥，用以評(píng)價(jià)皮膚外觀。然后，用福爾馬林固定耳部和背部的皮膚，包埋在石蠟中，采用蘇木精和曙紅法、甲苯胺藍(lán)法或剛果紅法(Stain Technol.56，323，1981)對(duì)耳部染色并且采用甲苯胺藍(lán)法或剛果紅法對(duì)背部皮膚染色后進(jìn)行組織學(xué)分析。通過對(duì)三項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行0-3級(jí)評(píng)分(1)表皮厚度，(2)真皮厚度，和(3)細(xì)胞浸潤，判斷組織變化來評(píng)價(jià)用蘇木精和曙紅染色的耳部切片并以總評(píng)分來表示。此外，使用以甲苯胺藍(lán)和剛果紅染色的樣品計(jì)數(shù)肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量。具體地說，在X400顯微鏡視野下計(jì)數(shù)背部皮膚的嗜酸性粒細(xì)胞，另一種細(xì)胞在總共五個(gè)X200倍視野下計(jì)數(shù)并以總數(shù)表示。
如附圖20A和20B所示，在試驗(yàn)開始(15周齡)時(shí)，觀察到對(duì)照組與胃促胰酶抑制劑(化合物18)施用組之間的皮膚癥狀評(píng)分沒有差異(附圖20A)，但施用胃促胰酶抑制劑35天后，與對(duì)照組相比，皮炎評(píng)分明顯降低(p＜0.05，Mann-Whitney檢驗(yàn))(附圖20B)。同樣，通過施用胃促胰酶抑制劑，耳部的組織學(xué)評(píng)分也顯著降低(附圖21，p＜0.05，Mann-Whitney檢驗(yàn))。另一方面，計(jì)數(shù)耳部皮膚(附圖22A)和背部皮膚(附圖22B)的肥大細(xì)胞。結(jié)果，對(duì)兩種樣本施用胃促胰酶抑制劑都觀察到了明顯的抑制作用。此外還表明，胃促胰酶抑制劑還顯著抑制耳部皮膚(附圖23A)和背部皮膚(附圖23B)的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量。
綜上所述，在自然發(fā)生的特異性皮炎模型中，其中這種發(fā)作被認(rèn)為是由于與非SPF環(huán)境下空氣中的抗原重復(fù)接觸導(dǎo)致的，胃促胰酶抑制劑改善皮膚外觀和皮膚的組織學(xué)變化并抑制肥大細(xì)胞的增多和嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤，由此證明，胃促胰酶抑制劑可用于對(duì)抗與抗原重復(fù)接觸引發(fā)的皮炎。
制劑實(shí)施例1片劑的制備將100.0g化合物1與22.5g微晶纖維素和2.5g硬脂酸鎂混合，然后用直接壓片機(jī)壓片，制備直徑為9mm的含200mg化合物1的片劑，每片重250mg。
制劑實(shí)施例2顆粒劑的制備將30g化合物1與265g乳糖和5g硬脂酸鎂混合。將該混合文壓模后粉碎，制粒并過篩得到10％的20-50目顆粒。
制劑實(shí)施例3直腸栓劑的制備將Vitepsol H-15(Dynamite Nobel Co.)溫?zé)崛诨Ｍ渲屑尤牖衔?使其達(dá)到12.5mg/ml的濃度。將其均勻混合后，加到2ml直腸栓劑模型中并使其冷卻，得到含25mg化合物1的直腸栓劑。
工業(yè)實(shí)用性依據(jù)本發(fā)明，胃促胰酶抑制劑緩解雙相皮膚炎癥反應(yīng)或者其晚期反應(yīng)，可有效對(duì)抗由于重復(fù)應(yīng)用半抗原誘發(fā)的皮炎(特異性皮炎的動(dòng)物疾病模型之一)的皮膚增厚，因此可有效預(yù)防和/或治療表現(xiàn)出雙相炎癥反應(yīng)的皮炎或者由于與抗原重復(fù)接觸引發(fā)的皮炎適應(yīng)癥。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防或治療表現(xiàn)出雙相皮膚反應(yīng)的皮炎的藥物，該藥物含有胃促胰酶抑制劑作為有效成分。
2.權(quán)利要求1的預(yù)防或治療性藥物，其中表現(xiàn)出雙相皮膚反應(yīng)的皮炎是特應(yīng)性皮炎。
3.權(quán)利要求1或2的預(yù)防或治療性藥物，其中的胃促胰酶抑制劑是下式(I)的喹唑啉衍生物及其可藥用鹽 其中，A環(huán)表示芳基；R1表示羥基、氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)烷基氨基、可被羧酸基取代的C7-C10低級(jí)芳烷基氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)脂肪酸酰化的氨基、可被羧酸基取代的芳環(huán)羧酸酰化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環(huán)羧酸?；陌被?、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)鏈烷磺酸磺?；陌被?、可被羧酸基取代的芳環(huán)磺酸磺?；陌被⒖杀霍人峄〈碾s芳環(huán)磺酸磺?；陌被⒖杀霍人峄〈腃1-C4低級(jí)烷基或者可被羧酸基取代的C2-C4鏈烯基；R2和R3可以相同或不同，并且表示氫原子、未取代的或取代的C1-C4低級(jí)烷基、鹵原子、羥基、C1-C4低級(jí)烷氧基、氨基、未取代的或取代的C1-C4低級(jí)烷基氨基、未取代的或取代的C7-C10芳烷基氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)脂肪酸?；陌被⒖杀霍人峄〈姆辑h(huán)羧酸?；陌被?、可被羧酸基取代的雜芳環(huán)羧酸酰化的氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)鏈烷磺酸磺酰化的氨基、可被羧酸基取代的芳環(huán)磺酸磺酰化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環(huán)磺酸磺?；陌被蛘唪人峄?，或者當(dāng)A環(huán)是苯環(huán)時(shí)，R1和R2可與該取代的苯環(huán)一起形成可被羧酸取代的稠合雜環(huán)，其中環(huán)中的碳原子可形成羰基并且R3定義如上；并且X表示氫原子、C1-C4低級(jí)烷基、C1-C4低級(jí)烷氧基、鹵原子、羥基、氨基或硝基。
4.權(quán)利要求1或2的預(yù)防或治療性藥物，其中的胃促胰酶抑制劑是下式(II)的喹唑啉衍生物及其可藥用鹽 其中，其中B環(huán)表示苯環(huán)、吡啶環(huán)、吡咯環(huán)或吡唑環(huán)，m表示0、1或2，Y表示羥基、硝基、氯原子、可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷基、可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷氧基或C7-C12芳烷氧基，或者Y表示與所示被所述Y取代的苯環(huán)一起形成萘環(huán)或喹啉環(huán)，R5和R6可以相同或不同，并且表示氫原子、鹵原子、可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷基、硝基、氰基、吡唑基、四唑基、可被C1-C4低級(jí)烷基或烯丙基酯化的羧基或者可被一個(gè)或多個(gè)選自下列的取代基取代的C1-C4低級(jí)烷氧基鹵原子、嗎啉代、苯基哌嗪基和可被C1-C4低級(jí)烷基或烯丙基酯化的羧基；或者當(dāng)B環(huán)表示苯環(huán)時(shí)，R5和R6代表與所示被所述R5和R6取代的苯環(huán)一起形成萘環(huán)或喹啉環(huán)的基團(tuán)，并且Z表示氫原子、可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷基，C2-C5鏈烯基，未取代的或取代的芳烷基，未取代的或取代的芳香雜環(huán)烷基，可被C1-C4低級(jí)烷基或烯丙基酯化的羧甲基，被伯胺、仲胺或環(huán)狀胺酰胺化的甲酰甲基，未取代的或取代芳甲酰甲基，或者未取代的或取代的芳烷氧基甲基。
5.一種緩解表現(xiàn)出雙相皮膚反應(yīng)的皮炎的晚期反應(yīng)的藥物，它含有胃促胰酶抑制劑作為有效成分。
6.權(quán)利要求5的緩解性藥物，其中表現(xiàn)出雙相皮膚反應(yīng)的皮炎是特應(yīng)性皮炎。
7.權(quán)利要求5或6的緩解性藥物，其中的胃促胰酶抑制劑是下式I的喹唑啉衍生物及其可藥用鹽 其中，A環(huán)表示芳基；R1表示羥基、氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)烷基氨基、可被羧酸基取代的C7-C10低級(jí)芳烷基氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)脂肪酸?；陌被?、可被羧酸基取代的芳環(huán)羧酸?；陌被⒖杀霍人峄〈碾s芳環(huán)羧酸?；陌被?、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)鏈烷磺酸磺?；陌被?、可被羧酸基取代的芳環(huán)磺酸磺?；陌被⒖杀霍人峄〈碾s芳環(huán)磺酸磺?；陌被?、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)烷基或者可被羧酸基取代的C2-C4鏈烯基；R2和R3可以相同或不同，并且表示氫原子、未取代的或取代的C1-C4低級(jí)烷基、鹵原子、羥基、C1-C4低級(jí)烷氧基、氨基、未取代的或取代的C1-C4低級(jí)烷基氨基、未取代的或取代的C7-C10芳烷基氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)脂肪酸酰化的氨基、可被羧酸基取代的芳環(huán)羧酸?；陌被?、可被羧酸基取代的雜芳環(huán)羧酸?；陌被⒖杀霍人峄〈腃1-C4低級(jí)鏈烷磺酸磺?；陌被?、可被羧酸基取代的芳環(huán)磺酸磺?；陌被⒖杀霍人峄〈碾s芳環(huán)磺酸磺酰化的氨基，或者羧酸基，或者當(dāng)A環(huán)是苯環(huán)時(shí)，R1和R2可與該取代的苯環(huán)一起形成可被羧酸取代的稠合雜環(huán)，其中環(huán)中的碳原子可形成羰基并且R3定義如上；并且X表示氫原子、C1-C4低級(jí)烷基、C1-C4低級(jí)烷氧基、鹵原子、羥基、氨基或硝基。
8.權(quán)利要求5或6的緩解性藥物，其中的胃促胰酶抑制劑是下式(II)的喹唑啉衍生物及其可藥用鹽 其中，其中B環(huán)表示苯環(huán)、吡啶環(huán)、吡咯環(huán)或吡唑環(huán)，m表示0、1或2，Y表示羥基、硝基、氯原子、可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷基、可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷氧基或C7-C12芳烷氧基，或者Y表示與所示被所述Y取代的苯環(huán)一起形成萘環(huán)或喹啉環(huán)，R5和R6可以相同或不同，并且表示氫原子、鹵原子、可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷基、硝基、氰基、吡唑基、四唑基、可被C1-C4低級(jí)烷基或烯丙基酯化的羧基或者可被一個(gè)或多個(gè)選自下列的取代基取代的C1-C4低級(jí)烷氧基鹵原子、嗎啉代、苯基哌嗪基和可被C1-C4低級(jí)烷基或烯丙基酯化的羧基；或者當(dāng)B環(huán)表示苯環(huán)時(shí)，R5和R6代表與所示被所述R5和R6取代的苯環(huán)一起形成萘環(huán)或喹啉環(huán)的基團(tuán)，并且Z表示氫原子、可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷基，C2-C5鏈烯基，未取代的或取代的芳烷基，未取代的或取代的芳香雜環(huán)烷基，可被C1-C4低級(jí)烷基或烯丙基酯化的羧甲基，被伯胺、仲胺或環(huán)狀胺酰胺化的甲酰甲基，未取代的或取代芳甲酰甲基，或者未取代的或取代的芳烷氧基甲基。
9.一種預(yù)防或治療與抗原重復(fù)接觸引發(fā)的皮炎的藥物，該藥物含有胃促胰酶抑制劑作為有效成分。
10.權(quán)利要求7的預(yù)防或治療性藥物，其中與抗原重復(fù)接觸引發(fā)的皮炎是特應(yīng)性皮炎。
11.權(quán)利要求7或8的預(yù)防或治療性藥物，其中的胃促胰酶抑制劑是下式I的喹唑啉衍生物及其可藥用鹽 其中，A環(huán)表示芳基；R1表示羥基、氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)烷基氨基、可被羧酸基取代的C7-C10低級(jí)芳烷基氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)脂肪酸?；陌被⒖杀霍人峄〈姆辑h(huán)羧酸?；陌被?、可被羧酸基取代的雜芳環(huán)羧酸?；陌被?、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)鏈烷磺酸磺?；陌被⒖杀霍人峄〈姆辑h(huán)磺酸磺?；陌被?、可被羧酸基取代的雜芳環(huán)磺酸磺酰化的氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)烷基或者可被羧酸基取代的C2-C4鏈烯基；R2和R3可以相同或不同，并且表示氫原子、未取代的或取代的C1-C4低級(jí)烷基、鹵原子、羥基、C1-C4低級(jí)烷氧基、氨基、未取代的或取代的C1-C4低級(jí)烷基氨基、未取代的或取代的C7-C10芳烷基氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)脂肪酸酰化的氨基、可被羧酸基取代的芳環(huán)羧酸?；陌被?、可被羧酸基取代的雜芳環(huán)羧酸?；陌被?、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)鏈烷磺酸磺?；陌被⒖杀霍人峄〈姆辑h(huán)磺酸磺?；陌被?、可被羧酸基取代的雜芳環(huán)磺酸磺?；陌被?，或者羧酸基，或者當(dāng)A環(huán)是苯環(huán)時(shí)，R1和R2可與該取代的苯環(huán)一起形成可被羧酸取代的稠合雜環(huán)，其中環(huán)中的碳原子可形成羰基并且R3定義如上；并且X表示氫原子、C1-C4低級(jí)烷基、C1-C4低級(jí)烷氧基、鹵原子、羥基、氨基或硝基。
12.權(quán)利要求9或10的預(yù)防或治療性藥物，其中的胃促胰酶抑制劑是下式(II)的喹唑啉衍生物及其可藥用鹽 其中，其中B環(huán)表示苯環(huán)、吡啶環(huán)、吡咯環(huán)或吡唑環(huán)，m表示0、1或2，Y表示羥基、硝基、氯原子、可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷基、可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷氧基或C7-C12芳烷氧基，或者Y表示與所示被所述Y取代的苯環(huán)一起形成萘環(huán)或喹啉環(huán)，R5和R6可以相同或不同，并且表示氫原子、鹵原子、可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷基、硝基、氰基、吡唑基、四唑基、可被C1-C4低級(jí)烷基或烯丙基酯化的羧基或者可被一個(gè)或多個(gè)選自下列的取代基取代的C1-C4低級(jí)烷氧基鹵原子、嗎啉代、苯基哌嗪基和可被C1-C4低級(jí)烷基或烯丙基酯化的羧基；或者當(dāng)B環(huán)表示苯環(huán)時(shí)，R5和R6代表與所示被所述R5和R6取代的苯環(huán)一起形成萘環(huán)或喹啉環(huán)的基團(tuán)，并且Z表示氫原子、可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷基，C2-C5鏈烯基，未取代的或取代的芳烷基，未取代的或取代的芳香雜環(huán)烷基，可被C1-C4低級(jí)烷基或烯丙基酯化的羧甲基，被伯胺、仲胺或環(huán)狀胺酰胺化的甲酰甲基，未取代的或取代芳甲酰甲基，或者未取代的或取代的芳烷氧基甲基。
13.一種預(yù)防或治療表現(xiàn)出雙相皮膚反應(yīng)的皮炎的藥物組合物，該組合物含有緩解晚期反應(yīng)量的胃促胰酶抑制劑和藥用賦形劑。
14.權(quán)利要求13的預(yù)防或治療性藥物組合物，其中表現(xiàn)出雙相皮膚反應(yīng)的皮炎是特應(yīng)性皮炎。
15.權(quán)利要求13或14的預(yù)防或治療性藥物組合物，其中的胃促胰酶抑制劑是下式I的喹唑啉衍生物及其可藥用鹽 其中，A環(huán)表示芳基；R1表示羥基、氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)烷基氨基、可被羧酸基取代的C7-C10低級(jí)芳烷基氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)脂肪酸?；陌被⒖杀霍人峄〈姆辑h(huán)羧酸?；陌被?、可被羧酸基取代的雜芳環(huán)羧酸?；陌被⒖杀霍人峄〈腃1-C4低級(jí)鏈烷磺酸磺酰化的氨基、可被羧酸基取代的芳環(huán)磺酸磺?；陌被⒖杀霍人峄〈碾s芳環(huán)磺酸磺酰化的氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)烷基或者可被羧酸基取代的C2-C4鏈烯基；R2和R3可以相同或不同，并且表示氫原子、未取代的或取代的C1-C4低級(jí)烷基、鹵原子、羥基、C1-C4低級(jí)烷氧基、氨基、未取代的或取代的C1-C4低級(jí)烷基氨基、未取代的或取代的C7-C10芳烷基氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)脂肪酸?；陌被⒖杀霍人峄〈姆辑h(huán)羧酸酰化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環(huán)羧酸?；陌被?、可被羧酸基取代的C1-C4低級(jí)鏈烷磺酸磺?；陌被?、可被羧酸基取代的芳環(huán)磺酸磺?；陌被?、可被羧酸基取代的雜芳環(huán)磺酸磺?；陌被?，或者羧酸基，或者當(dāng)A環(huán)是苯環(huán)時(shí)，R1和R2可與該取代的苯環(huán)一起形成可被羧酸取代的稠合雜環(huán)，其中環(huán)中的碳原子可形成羰基并且R3定義如上；并且X表示氫原子、C1-C4低級(jí)烷基、C1-C4低級(jí)烷氧基、鹵原子、羥基、氨基或硝基。
16.權(quán)利要求13或14的預(yù)防或治療性藥物，其中的胃促胰酶抑制劑是下式(II)的喹唑啉衍生物及其可藥用鹽 其中，其中B環(huán)表示苯環(huán)、吡啶環(huán)、吡咯環(huán)或吡唑環(huán)，m表示0、1或2，Y表示羥基、硝基、氯原子、可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷基、可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷氧基或C7-C12芳烷氧基，或者Y表示與所示被所述Y取代的苯環(huán)一起形成萘環(huán)或喹啉環(huán)，R5和R6可以相同或不同，并且表示氫原子、鹵原子、可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷基、硝基、氰基、吡唑基、四唑基、可被C1-C4低級(jí)烷基或烯丙基酯化的羧基或者可被一個(gè)或多個(gè)選自下列的取代基取代的C1-C4低級(jí)烷氧基鹵原子、嗎啉代、苯基哌嗪基和可被C1-C4低級(jí)烷基或烯丙基酯化的羧基；或者當(dāng)B環(huán)表示苯環(huán)時(shí)，R5和R6代表與所示被所述R5和R6取代的苯環(huán)一起形成萘環(huán)或喹啉環(huán)的基團(tuán)，并且Z表示氫原子、可被鹵原子取代的C1-C4低級(jí)烷基，C2-C5鏈烯基，未取代的或取代的芳烷基，未取代的或取代的芳香雜環(huán)烷基，可被C1-C4低級(jí)烷基或烯丙基酯化的羧甲基，被伯胺、仲胺或環(huán)狀胺酰胺化的甲酰甲基，未取代的或取代芳甲酰甲基，或者未取代的或取代的芳烷氧基甲基。
全文摘要
用于伴有二態(tài)炎癥反應(yīng)的皮炎和與抗原反復(fù)接觸引發(fā)的皮炎的預(yù)防或治療藥物,其抑制該皮炎的發(fā)展且由于無副作用,是如此的安全,從而可提高患者的每日生活質(zhì)量。具體地,上述皮炎的藥物含有胃促胰酶抑制劑作為活性成分,其中的胃促胰酶抑制劑是式(I)或(II)的喹唑啉衍生物或其藥用鹽。
文檔編號(hào)A61P17/04GK1366460SQ01800793
公開日2002年8月28日 申請(qǐng)日期2001年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月22日
發(fā)明者深見治一, 富森嘉晃, 福田好晃, 渡邊直熙 申請(qǐng)人:三得利株式會(huì)社