自體血清抗原致敏dc-cik細胞的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種自體血清抗原致敏DC-CIK細胞的制備方法，所述自體血清抗原致敏DC-CIK細胞的制備方法，包括步驟：A）自體血清抗原的制備；B）外周血單個核細胞的制備；C）DC的分離和培養；D）CIK細胞的誘導擴增；E）DC與CIK細胞共培養制備DC-CIK細胞。本發明所述方法培養的DC-CIK與常規培養制備的DC-CIK相比，其對CIK的增殖活性和殺瘤活性都明顯增加，其增殖倍數平均達到了200-250倍，是傳統培養方法的2-3倍；體外實驗時殺瘤活性達到70-80%，明顯高于常規方法培養的DC-CIK細胞。本方法工序簡單，條件易控，對設備的要求較低，而所獲得的DC-CIK細胞增殖效率更高。
【專利說明】自體血清抗原致敏DC-CIK細胞的制備方法
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明屬于細胞生物學、腫瘤免疫治療領域，涉及使用自體腫瘤抗原致敏DC-CIK的制備方法和抗腫瘤過繼免疫治療應用。
[0003]
【背景技術】
[0004]惡性腫瘤已成為中國死亡原因第一位，嚴重威脅著人民的健康與生命，腫瘤免疫治療是臨床用于腫瘤治療的第四大療法，其中腫瘤過繼免疫細胞療法在中國得到廣泛的應用，目前國內開展最多的就是DC-CIK細胞過繼性回輸療法。
[0005]DC細胞是機體內最重要的抗原提呈細胞，通過抗原攝取、加工及提呈，DC細胞可以有效誘導抗原特異性CD4和CD8 T淋巴細胞活化，從而激活機體獲得性免疫反應。此外，DC同樣可以激活NK細胞，增強其增殖能力及殺傷作用，從而增強天然免疫反應，共同發揮抗腫瘤作用。
[0006]CIK細胞即細胞因子誘導殺傷細胞，是將人外周血單個核細胞在體外與多種細胞因子共同培養一段時間后獲得的非主要組織相容性復合體(MHC)限制性的細胞毒性T淋巴細胞，對腫瘤細胞具有 高效的溶解毒性，DC與CIK細胞共培養后，可以有效提高了 CIK的增殖能力和殺傷活性，更有利于提高DC-CIK的抗腫瘤免疫療效，也是目前國內應用最為廣泛的技術。
[0007]DC-CIK主要包括無抗原致敏的DC-CIK、腫瘤特異性抗原致敏的DC-CIK以及全腫瘤抗原致敏的DC-CIK。研究表明，經抗原致敏的DC和未經抗原致敏的DC均可以使得CIK的增殖能力和殺瘤活性升高，而且經過抗原致敏的DC能更好的協同刺激CIK細胞的增殖和活化，具有更好的殺瘤活性。因此，選用合適的抗原致敏DC成為DC-CIK療效的一個關鍵性
影響因素。
[0008]目前DC體外致敏所使用的抗原主要是已知的腫瘤特異性抗原、腫瘤細胞株裂解產物或者腫瘤標本裂解產物。由于大多數腫瘤的缺乏特異性抗原,而且腫瘤容易突變進而抵抗單一抗原的免疫攻擊，因此特異性抗原致敏的DC臨床應用受到很大限制。而腫瘤細胞株在培養過程中，表面抗原通常會發生改變，致敏DC后所獲得的DC-CIK臨床效果不佳，而腫瘤標本裂解產物只能用于手術前留取標本的患者，臨床實際中進行DC-CIK治療的患者大多為手術后的患者，難以獲得新鮮的手術標本，這些都大大限制了 DC-CIK的臨床效果。而由于腫瘤患者的個體差異，即使是同種類型的腫瘤，所擁有的腫瘤抗原也大不相同，人工合成的抗原并不能廣泛用于腫瘤患者的治療。
[0009]目前常用的蛋白質濃縮技術包括透析袋濃縮法、冷凍干燥濃縮法、吹干濃縮法、超濾膜濃縮法、化學沉淀法等，超濾膜濃縮法和透析袋濃縮法比較先進但是說需要的成本較高，不利于推廣，而其他方法大多容易造成血清的污染，難以用于細胞的培養，我們基于凍融可以使血清化學成分沉淀濃縮的原理，在不影響血清抗原活性的基礎上，找到切實可行的自體血清抗原制備方法，并進而使用這些血清來致敏DC，培養特異性的經過抗原致敏后的DC-CIK細胞，用于臨床。
[0010]

【發明內容】

[0011]本發明的目的在于克服現有技術的上述不足，提供一種能獲得高增殖活性和殺瘤活性的自體抗原致敏DC-CIK細胞的制備方法。
[0012]自體血清抗原致敏DC-CIK細胞的制備方法，包括以下步驟:
自體血清抗原的制備:外周血50-100ml，離心分離患者血清，加入終濃度為
0.1-1.0mg/ml的亮抑蛋白酶抑制劑，混合均勻，隨后用無菌離心管存儲，置于_20°C以下環境冷凍24-48h，取出后在0-4°C環境中放置10-16h，吸取上層血漿部分，并棄去，滅活20-30min，微孔濾膜過濾，得到自體血清腫瘤抗原；
優選的:所述分離血清后蛋白濃縮后的蛋白處理條件為-20°C冷凍48h，隨后在4°C環境中豎直放置16h，可以借助重力，幫助濃縮蛋白；所述滅活條件為56°C滅活補體成分30min ;所述微孔濾膜為孔徑為22 μ m及以下微孔濾膜。
[0013]外周血單個核細胞的制備:采用密度梯度離心法分離獲得外周血單個核細胞(PBMC)0采用AM-V無血清培養基懸浮分離的PBMC，按照0.5-1 X IO8/瓶的數量置于培養瓶中，細胞培養箱中靜置l_3h，吸取未貼壁淋巴細胞用于CIK細胞的培養；貼壁細胞用于DC的培養。
[0014]DC的分離和培養:依據腫瘤標志物測定結果，在細胞貼壁后加入終濃度為5-20%的自體血清進行DC致敏，在培養第6-第7天加入終濃度為200-1000ng/ml的腫瘤壞死因子，得到自身抗原致敏后的DC。
[0015]CIK細胞的誘導擴增:上述未貼壁細胞按照CIK細胞培養常規方案進行。
[0016]DC與CIK細胞共培養制備DC-CIK:將上述抗原致敏后的DC與前述CIK細胞混合培養5-8天，收獲自體抗原致敏DC-CIK細胞。
[0017]細胞組成:CD3+細胞占90%以上，其中CD3+CD4+細胞約在10_20%，CD3+CD8+細胞在 60-80%，CD3+CD56+ 細胞約在 10_20%。
[0018]本發明的另一目的在于制備由上述方法制備可以用于臨床的抗腫瘤過繼免疫活性細胞。
[0019] 上述方法培養的DC-CIK與常規培養制備的DC-CIK相比，其對CIK的增殖活性和殺瘤活性都明顯增加，其增殖倍數平均達到了 200-250倍，是傳統培養方法的2-3倍；體外實驗時殺瘤活性達到70-80%，明顯高于常規方法培養的DC-CIK細胞。使用上述方法，采用自體血清中抗原作為本人特異性腫瘤抗原，與單一的腫瘤特異性抗原相比，有效避免因腫瘤細胞突變對特異性抗原的抵抗作用；同腫瘤細胞株抗原相比，血清抗原是自體抗原，有效避免了細胞株在體外傳代過程中造成的抗原結構的改變；面對手術后患者或者難以獲得腫瘤標本的患者，有效避免了無腫瘤抗原可用的窘境。在腫瘤抗原制備的過程中，適量的蛋白酶抑制劑有效的保持了血清中腫瘤抗原的完整性；此外，本方法工序簡單，條件易控，對設備的要求較低，而所獲得的的DC-CIK細胞增殖效率更高。[0020]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為血清冷凍時間及溫度對濃縮后蛋白含量的影響(mg/ml)；
圖2為血清溶解時間對濃縮后蛋白含量的影響；
圖3為培養過程中的細胞生長曲線；
圖4為培養細胞流式檢測結果<D3+細胞占90%以上，其中⑶3+⑶4+細胞約在10-20%，CD3+CD8+ 細胞在 60-80%，CD3+CD56+ 細胞約在 10_20%。
[0022]圖5為培養的細胞對A549細胞的體外殺傷作用。
[0023]
【具體實施方式】
[0024]下面以實例來說明本發明，但本發明并不受其限制。下面實例中凡未注明具體條件的實驗方法，均為遵照常規方法和廠家操作說明進行。
[0025]常規采集晚期肺癌患者外周血50-100ml，5-15IU/ml的肝素鈉抗凝，轉速800g，離心10分鐘，收集上層血漿部分(約1/3的液體層)，加入終濃度為0.1-1.0mg/ml的亮抑蛋白酶抑制劑，混合均勻，隨后用無菌離心管存儲，置于_20°C以下環境冷凍24-48h(參見圖1)，取出后在0-4°C環境中放置10-16h (參見圖2);56°C滅活30min，0.22 μ m微孔濾膜過濾，得到自體血清腫瘤抗原。
[0026]密度梯度離心法分離PBMC，生理鹽水等倍稀釋沉淀的血細胞，人淋巴細胞分離液與稀釋的血液按照1:2的比例加入離心管中，轉速700g，離心20分鐘，小心吸取白膜層，用生理鹽水洗滌2次，1500轉/分，離心8分鐘，即得到外周血單個核細胞。
[0027]采用AIM-V無血清培養基懸浮分離的PBMC，按照I X IO8/瓶的數量置于75cm2的培養瓶中，細胞培養箱中靜置2h，輕輕晃動培養瓶，吸取未貼壁淋巴細胞用于CIK細胞的培養，貼壁細胞用于DC的培養。
[0028]DC培養和致敏:依照表1所示，抗原分為高、低、中表達3類。
[0029]表1抗原表達分類
【權利要求】
1.自體血清抗原致敏DC-CIK細胞的制備方法，包括以下步驟: A)自體血清抗原的制備； B)外周血單個核細胞的制備； ODC的分離和培養； D)CIK細胞的誘導擴增； E)DC與CIK細胞共培養制備DC-CIK細胞。
2.如權利要求1所述的自體血清抗原致敏DC-CIK細胞的制備方法，其特征是:所述的A)步驟為取外周血50-100ml，離心分離患者血清，加入終濃度為0.1-1.0mg/ml的亮抑蛋白酶抑制劑進行蛋白濃縮，隨后用無菌離心管存儲，置于_20°C以下環境冷凍24-48h，取出后在0-4°C環境中放置10_16h，吸取上層血漿部分并棄去；滅活20-30min，微孔濾膜過濾，得到自體血清腫瘤抗原。
3.如權利要求2所述的自體血清抗原致敏DC-CIK細胞的制備方法，其特征是:所述分離血清后蛋白濃縮后的蛋白處理條件為-20 V冷凍48h，隨后在4°C環境中豎直放置16h ;所述滅活條件為56°C滅活補體成分30min ;所述微孔濾膜為孔徑為22 μ m及以下微孔濾膜。
4.如權利要求1所述的自體血清抗原致敏DC-CIK細胞的制備方法，其特征是:所述的B)步驟為采用密度梯度 離心法分離獲得外周血單個核細胞(PBMC);采用AM-V無血清培養基懸浮分離的PBMC，按照0.5-1 X IO8/瓶的數量置于培養瓶中，細胞培養箱中靜置l_3h，吸取未貼壁淋巴細胞用于CIK細胞的培養；貼壁細胞用于DC的培養。
5.如權利要求1所述的自體血清抗原致敏DC-CIK細胞的制備方法，其特征是:所述的C)步驟為依據腫瘤標志物測定結果，在細胞貼壁后加入終濃度為5-20%的自體血清進行DC致敏，在培養第6至第7天加入終濃度為200-1000ng/ml的腫瘤壞死因子，得到自身抗原致敏后的DC ；
6.如權利要求1所述的自體血清抗原致敏DC-CIK細胞的制備方法，其特征是:所述的E)步驟為將上述抗原致敏后的DC與前述CIK細胞混合培養5-8天，收獲自體抗原致敏DC-CIK 細胞。
7.如權利要求1-6任一項所述的自體血清抗原致敏DC-CIK細胞的制備方法，其特征是:所述DC-CIK細胞的細胞組成為⑶3+細胞占90%以上，其中⑶3+⑶4+細胞在10-20%，CD3+CD8+ 細胞在 60-80%，CD3+CD56+ 細胞在 10-20%。
【文檔編號】C12N5/0783GK103981144SQ201410095323
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年3月17日 優先權日:2014年3月17日
【發明者】黃浩, 鄒暢 申請人:深圳市合一康生物科技有限公司