一種適用于間充質干細胞無血清培養的方法
【專利摘要】本發明公開了一種適用于間充質干細胞無血清培養的方法，該方法是在基礎培養基中添加刺激藥物凝血酶，刺激間充質干細胞自身分泌內源性纖連蛋白。本發明是一種簡便、成本低且安全性高的方法，有效解決了無血清培養間充質干細胞貼壁的問題，同時還能明顯的促進間充質干細胞在無血清培養基中增殖。適用于臨床研究級的間充質干細胞在無血清中培養擴增。
【專利說明】—種適用于間充質干細胞無血清培養的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬生物【技術領域】，具體涉及一種間充質干細胞無血清培養的方法。
【背景技術】
[0002]間充質干細胞(MSC)是一群具有高度自我更新能力和分化潛能的成體干細胞。因其具有免疫調控、分泌細胞因子、取材方便等優點而倍受關注，成為細胞治療的理想種子細胞。間充質干細胞研究日益受到廣泛關注并顯示出越來越廣闊的應用前景，在細胞治療、組織工程等領域具有極為重要的應用價值。是繼造血干細胞之后臨床應用研究最多，也是最成熟的一種成體干細胞。從1995年首次報道MSC應用于臨床試驗，現在培養的MSC已被廣泛地用于臨床試驗研究，如移植物抗宿主病(GVHD)、充血性心衰、急性心梗、2型糖尿病、脊髓損傷、軟骨和骨損傷、克羅恩病等，而且在腎臟、肌肉和肺的損傷修復中也有初步進展。
[0003]不管是來源于骨髓還是其他組織的間充質干細胞原始數量都是很有限的，要達到臨床應用的細胞數量級，就必須經過體外的擴增培養。培養基是MSC培養效率和安全的關鍵。選擇使用的培養基要求能夠維持MSC在經過數次傳代培養后的表型，基因穩定和功能。因此必須采用優化的培養條件。常用DMEM或a MEM添加動物血清(胎牛血清FBS)或人血清或血漿和生長因子。但在培養過程中，血清蛋白能細胞內化而殘留在細胞的胞漿中，由此可能會導致患者過敏反應，以及可能引起如瘋牛病(BSE)、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakobdisease)等疾病。因此臨床研究用MSC需要在無血清的條件下培養擴增。
[0004]現有的無血清培養基主要通過添加大量的生長因子來維持細胞的生長繁殖。但是因為MSC是貼壁生長的細胞，無血清培養基缺乏各種粘附貼壁因子如纖連蛋白(FN)等而不能很好貼壁。目前國際上幾家大生物公司研究的幾款無血清培養基如(加拿大STEMCELL公司的 MESENCULT，德國 LONZA 公司的 MSCGM-CDT，美國 GIBICO 公司的 STEMPRO MSC SFM CTS蛋，德國PAN公司的POWERSTEM MSCl等)，以及現有專利(201110420539.9)都是通過添加預先用纖連蛋白或其他專用試劑預先包被培養皿，或在培養基中添加大量的纖連蛋白來保證間充質干細胞的貼壁生長。現有方案的缺點是:1)需預先包被培養皿工作量大，不適用大規模培養。2)需用特殊蛋白如纖連蛋白FN，價格昂貴，Ig約100萬人民幣。3)重組的FN只是片段，不完全具有全部FN的功能。4)重組的FN還需要保證其生物安全，未被其它基因污染等。所以基于此的無血清培養基價格昂貴，使用不方便，使得其普及性十分低。 [0005]

【發明內容】

[0006]本發明的目的提供一種簡便、成本低且安全性高的方法，有效地解決間充質干細胞在無血清培養基中的貼壁問題。
[0007]本發明的技術方案如下:
一種適用于間充質干細胞無血清培養的方法，其特征在于:在基礎培養基中添加刺激藥物凝血酶,刺激間充質干細胞自身分泌內源性纖連蛋白。[0008]其中，所述的基礎培養基包括a MEM, DMEM,或其他無血清培養基。
[0009]所述的刺激藥物凝血酶濃度為0.1~20 IU/mL，使用的凝血酶為臨床藥品級。
[0010]所述的刺激藥物凝血酶濃度優選為0.25~10 IU/mL。
[0011]所述的間充質干細胞的組織來源包括骨髓、臍帶、胎盤、脂肪、羊水、羊膜、血管。
[0012]本發明主要是通過用在基礎培養基中添加凝血酶，通過凝血酶與間充質干細胞上的蛋白激酶受體結合，激活NF K B和ERK信號通路，促進間充質干細胞合成和分泌纖連蛋白，增強間充質干細胞貼壁能力，同時不改變間充質干細胞的生物學特性。
[0013]本發明的顯著優點:
I)本發明的培養基中不含動物源血清，不含人源血清。
[0014]2)本發明利用MSC自身分泌大量的纖連蛋白，實現MSC在無血清培養基中的貼壁生長。
[0015]3)本發明還可以促進MSC在無血清培養基中的增殖。
[0016]4)本發明使得內源性FN分泌增多，內源性FN生物學功能優于重組的FN片段。有利于間充質干細 胞更好的維持自我更新的干性。
[0017]5)本發明添加的刺激物來自臨床藥品，適用于臨床研究級的間充質干細胞在無血清中培養擴增，及臨床治療應用。
[0018]6)通過本發明的方法培養的間充質干細胞維持其生物學特性，具有多向分化能力。
[0019]7)本發明經濟，簡便。
[0020]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為對照組(Control)與凝血酶組(Thrombin)分泌纖連蛋白(FN)量的比較。
[0022]圖2為對照組(Control)與凝血酶組(Thrombin)間充質干細胞mRNA水平表達纖連蛋白(FN)量的比較。
[0023]圖3為對照組(Control)與凝血酶組(Thrombin)間充質干細胞Ih細胞貼壁情況。
[0024]圖4為不同濃度的凝血酶在無血清培養基促進間充質干細胞增殖結果，其中Tl~T7代表不同濃度凝血酶。
[0025]圖5為凝血酶組培養的間充質干細胞流式檢測細胞標志物結果。
[0026]圖6為凝血酶組培養的間充質干細胞誘導分化成脂肪細胞(油紅O染色成紅色)。
[0027]圖7為凝血酶組培養的間充質干細胞誘導分化成骨細胞(ALP染色成藍黑色)。
【具體實施方式】
[0028]為了充分公開本發明一種適用于間充質干細胞無血清培養的方法，以下結合實施例加以說明，但本發明不僅限于此。
[0029]實施例1:刺激無血清培養骨髓間充質干細胞分泌內源纖連蛋白 操作步驟:
I)將骨髓間充質干細胞分別以5X IO4個細胞數種植到6孔板中。[0030]2)分別加2ml的培養基I (對照組，無血清基礎培養基a MEM)和培養基2 (凝血酶組，在無血清基礎培養基中添加凝血酶4 IU/ml)。37°C,CO2濃度為5%的細胞培養箱中培養24h。
[0031]3)收集培養上清進行ELISA方法測定間充質干細胞分泌纖連蛋白FN量。
[0032]4)收集細胞提取細胞總RNA，實時定量PCR方法檢測間充質干細胞纖連蛋白mRNA的表達。
[0033]結果:凝血酶刺激后，間充質干細胞纖連蛋白mRNA表達和內源性纖連蛋白分泌量增加6倍以上。見圖1、圖2，圖中對照組為不含凝血酶無血清基礎培養基，凝血酶組為含凝血酶的無血清基礎培養基。
[0034]實施例2:無血清培養間充質干細胞的貼壁效果 操作步驟:
I)將間充質干細胞分別培養于培養基I和(對照組，無血清基礎培養基a MEM)培養基2 (凝血酶組，在無血清基礎培養基中添加凝血酶4 IU/ml)中，分別以2 X IO4個細胞數種植于96孔板中，自然貼壁lh。
[0035]2)吸棄培養基和未貼壁細胞。
[0036]3) PBS洗滌3次，將未貼壁細胞充分洗凈。
[0037]4)加入 MTT 孵育 3_4h，棄去 MTT。
[0038]5)顯微鏡下觀察細胞貼壁數。
[0039]6)加DMSO溶解貼壁細胞。
[0040]7) 490nm波長測定細胞吸光度值，判定細胞貼壁情況。
[0041]結果:凝血酶組刺激的間充質干細胞在無血清培養中的Ih貼壁數明顯增加。如圖3所示，圖中對照組為不含凝血酶無血清基礎培養基，凝血酶組為含凝血酶的無血清基礎培養基。說明本發明方法可以提高無血清培養基的細胞貼壁率。
[0042]實施例3:凝血酶組對間充質干細胞在無血清培養基中的增殖效果 操作步驟:
I)將間充質干細胞充分重懸混勻，按每孔2X IO3細胞數種植到96孔板中，分別加入培養基I (對照組，無血清基礎培養基α MEM)和培養基2 (凝血酶組，在無血清基礎培養基中添加凝血酶濃度分為0.25, 0.5，I, 2，4,8, 10 IU/mL，7個濃度)。
[0043]2) 37°C、CO2濃度為5%的細胞培養箱中培養3天。
[0044]3)加入CCK-8孵育汕。
[0045]4) 450nm波長測定細胞吸光度值，判定細胞增殖情況。
[0046]結果:本方法可明顯刺激間充質干細胞在無血清培養基中增殖，且具有濃度依賴效應，見圖4。
[0047]實施例4:凝血酶組培養的間充質干細胞的生物學特性
1.細胞培養
I)將間充質干細胞培養于培養基2 (凝血酶添加濃度為4 IU/mL)中3-7天。
[0048]2)胰蛋白酶消化細胞。
[0049]3)磷酸鹽緩沖液PBS洗滌細胞2次。
[0050]4)加間充質干細胞鑒定表面標志物抗體CD34，CD45，CD31，CD44，CD73，CD90，CDlO5，HLA-DR孵育30分鐘。
[0051]5)加 PBS 洗滌 2 次。
[0052]6)流式細胞儀器檢測。
[0053]2.誘導分化
O培養的間充質干細胞，以每IX IO4細胞數分別種于24孔板中。
[0054]2)分別加成骨、成脂肪誘導液。
[0055]3)每3-4天換液一次。
[0056]4)誘導2周后，進行染色鑒定。成脂肪細胞(油紅O染色)，成骨細胞(堿性磷酸酶ALP染色)。
[0057]3.結果
流式結果顯示，培養的間充質干細胞表面標志表達不改變，高表達⑶44，⑶73，⑶90，⑶105等間充質干細胞標的標志物，不表達造血系統的標志物⑶34，⑶45，⑶31，HLA-DR等，見圖5。培養的間充質干細胞保持多向分化的能力，能夠誘導分化成骨細胞，脂肪細胞等，見圖6、圖 7。
【權利要求】
1.一種適用于間充質干細胞無血清培養的方法，其特征在于:在基礎培養基中添加刺激藥物凝血酶，刺激間充質干細胞自身分泌內源性纖連蛋白。
2.如權利要求1所述的一種適用于間充質干細胞無血清培養的方法，其特征在于:所述的基礎培養基包括a MEM, DMEM，或其他無血清培養基。
3.如權利要求1所述的一種適用于間充質干細胞無血清培養的方法，其特征在于:所述的刺激藥物凝血酶濃度為0.1~20 IU/mL，使用的凝血酶為臨床藥品級。
4.如權利要求1所述的一種適用于間充質干細胞無血清培養的方法，其特征在于:所述的間充質干細胞的組織來源包括骨髓、臍帶、胎盤、脂肪、羊水、羊膜、血管。
5.如權利要求3所述的一種適用于間充質干細胞無血清培養的方法，其特征在于:所述的刺激藥物凝血酶濃度優選 為0.25~10 IU/mL。
【文檔編號】C12N5/0775GK103881972SQ201310379426
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2013年8月28日 優先權日:2013年8月28日
【發明者】陳津, 馬予潔, 郭子寬, 譚建明 申請人:中國人民解放軍南京軍區福州總醫院