一種脆性x綜合癥臨床快速pcr檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種脆性X綜合癥臨床快速檢測試劑盒，所述的試劑盒包括DNA聚合酶、dNTPs、引物群和緩沖體系。本發(fā)明的試劑盒用于檢測脆性X綜合癥致病基因FMR-1（CGG）n片段拷貝數(shù)，從而推斷出拷貝數(shù)的含量范圍，可以快捷的查出致病基因的攜帶者以及病人，可以用于產(chǎn)前診斷、阻止患兒出生從而降低脆性X綜合癥的發(fā)病率。
【專利說明】—種脆性X綜合癥臨床快速PCR檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種脆性X綜合癥臨床快速PCR檢測試劑盒，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]脆性X綜合癥是一種發(fā)病率僅次于唐氏綜合癥的遺傳性智力低下綜合癥，呈X連鎖遺傳，占X連鎖智力低下的40%。其外顯率因男女性別不同有明顯差異，男性80%，女性30%。脆性X綜合癥的發(fā)病率也因男女性別不同有差異，男性為1/4000，女性為1/6000.[0003]95%以上的脆性X綜合癥患者發(fā)病的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)是FMRl基因上的CGG重復(fù)區(qū)結(jié)構(gòu)擴展的突變引起的，5%以下則是由于FMRl基因的錯義突變和缺失型突變影響FMRl基因的正常結(jié)構(gòu)所導(dǎo)致的。
[0004]FMRl基因位于染色體Xq27.3，含17個外顯子，全長38kb。在基因5’非翻譯區(qū)存在一段數(shù)目可變的(CGG) η,在其上游250bp處存在一個CpG島。(CGG) n片段序列重復(fù)引起CpG島的甲基化，使FMRl基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制。正常人群FMR-1基因(CGG) n重復(fù)次數(shù)在1-50之間。當(dāng)重復(fù)數(shù)擴展到50-200時，攜帶者表型正常或有部分表現(xiàn)，但在遺傳過程中會進一步擴展，通常被稱為FMR-1基因的前突變。當(dāng)重復(fù)數(shù)擴展達200及以上時，個體表現(xiàn)患病特征，這種FMR-1基因的突變稱全突變。前突變CpG島無異常甲基化，全突變常伴隨有CpG島異常甲基化，使FMR-1基因表達翻譯產(chǎn)物受到抑制，從而造成臨床癥狀。
[0005]脆性X綜合癥發(fā)病率高，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，目前尚無有效地診斷方法。降低脆性X綜合癥發(fā)病率關(guān)鍵是查出攜帶者以及患者。通過遺傳咨詢，產(chǎn)前診斷阻止患兒的出生。女性前突變攜帶者表型不明顯，易被忽視，導(dǎo)致發(fā)病率逐代遞增。因此開發(fā)一種進行X染色體FMR-1基因(CGG) η片段的檢測的方法是非常有必要的。本發(fā)明旨在開發(fā)一種適用于臨床檢測的脆性X染色體綜合癥快速檢測試劑盒。
[0006]目前已公開的檢測方法如利用甲基化PCR、MLPA、Southern Blot、Real Time PCR等方法雖然都對脆性X綜合征進行檢測，但因其耗時長，消費高，步驟繁瑣等缺點限制了其應(yīng)用范圍，而本發(fā)明很好的彌補了這些缺點，并在已有技術(shù)的基礎(chǔ)上進行了創(chuàng)新，使脆性X綜合癥的檢測方法更為完善。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種脆性X綜合癥臨床快速PCR檢測試劑盒。
[0008]本發(fā)明的用于檢測脆性X綜合癥的PCR檢測試劑盒，所述的PCR試劑盒包括DNA聚合酶、dNTPs、引物群和緩沖體系，
[0009]所述的引物群包括用于擴增FMR-1基因CGG重復(fù)區(qū)的上游引物F和下游引物R，以及用于擴增內(nèi)參片段的上游引物F和下游引物M，所述的引物群的序列為下列(I)- (6)組中的任意一組，引物序列信息見表1:[0010]表1:引物序列信息
[0011]
【權(quán)利要求】
1.用于檢測脆性X綜合癥的PCR試劑盒，其特征在于，所述的PCR試劑盒包括DNA聚合酶、dNTPs、引物群、緩沖體系及檢測用標(biāo)準(zhǔn)Marker; 所述的引物群包括用于擴增FMR-1基因CGG重復(fù)區(qū)的上游引物F和下游引物R，以及用于擴增內(nèi)參片段的上游引物F和下游引物M，所述的引物群的序列為下列(I)- (6)組中的任意一組，引物序列信息見表1: (1)目的基因引物的上游引物F的核苷酸序列為SEQID NO: 1，下游引物R的核苷酸序列為SEQ ID N0:2，內(nèi)參引物的上游引物F的核苷酸序列為SEQ ID N0:1，下游引物M的核苷酸序列為SEQ ID NO:3 ； (2)目的基因引物的上游引物F的核苷酸序列為SEQID N0:4，下游引物R的核苷酸序列為SEQ ID N0:5，內(nèi)參引物的上游引物F的核苷酸序列為SEQ ID N0:4，下游引物M的核苷酸序列為SEQ ID NO:6 ； (3)目的基因引物的上游引物F的核苷酸序列為SEQID N0:7，下游引物R的核苷酸序列為SEQ ID N0:8，內(nèi)參引物的上游引物F的核苷酸序列為SEQ ID N0:7，下游引物M的核苷酸序列為SEQ ID NO:9 ； (4)目的基因引物的上游引物F的核苷酸序列為SEQID NO: 10，下游引物R的核苷酸序列為SEQ ID NO: 11，內(nèi)參引物的上游引物F的核苷酸序列為SEQ ID N0:10，下游引物M的核苷酸序列為SEQ ID NO: 12 ； (5)目的基因引物的上游引物F的核苷酸序列為SEQID NO: 13，下游引物R的核苷酸序列為SEQ ID NO: 14，內(nèi)參引物的上游引物F的核苷酸序列為SEQ ID NO:13，下游引物M的核苷酸序列為SEQ ID NO: 15 ； (6)目的基因引物的上游引物F的核苷酸序列為SEQID NO: 16，下游引物R的核苷酸序列為SEQ ID NO: 17，內(nèi)參引物的上游引物F的核苷酸序列為SEQ ID NO:16，下游引物M的核苷酸序列為SEQ ID NO: 18 ； 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測脆性X綜合癥的PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還含有PCR增強劑，所述的PCR增強劑包含7-deaza-dGTP、甜菜堿或甜菜堿類似物、DMSO、甘油、甲酰胺和聚乙二醇中的2種或2種以上的組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還提供一種特異性區(qū)分脆X綜合征檢測用Marker，其組成為 4個不同大小的DNA片段:1) 170-230 bp; 2)420-480 bp; 3) 600-640bp; 4) 1020-1080 bp，濃度為 50 ng-100 ng/ μ I。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，擴增過程產(chǎn)生2條特征條帶，其中一條為內(nèi)參片段大小為:100-300 bp ;—條為目標(biāo)片段，其大小為400-1200bp。
4.當(dāng)目標(biāo)片段大小處于為400-650bp時，樣品為陰性樣本；當(dāng)目標(biāo)片段大小處于650bp-1100 bp之間為陽性樣本(前突變)；當(dāng)目標(biāo)片段大于1100 bp或無法擴增時，樣本為陽性(全突變)。
5.如權(quán)利要求所述的PCR檢測試劑盒具有用于臨床快速檢測脆X染色體的綜合征的用途。
【文檔編號】C12Q1/68GK103981254SQ201410119507
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】潘海波, 謝陽, 邢楠楠, 華琴 申請人:江蘇佰齡全基因生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司