一種高產木聚糖酶的黑曲霉及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種高產木聚糖酶的黑曲霉及其應用。黑曲霉（Aspergillus?niger）SM751，其保藏號為：CGMCC?No.8670。該菌所產生的木聚糖酶在多種抑制物的混合作用下，酶活受到激活，相較空白對照，酶活最高激活率達到了33.43%。本發明提供的黑曲霉（Aspergillus?niger）SM751，其能高產高酶活的、能耐受預處理后發酵抑制物的木聚糖酶，因此在木質纖維素酶解領域具有廣泛的應用。
【專利說明】一種高產木聚糖酶的黑曲霉及其應用
【技術領域】:
[0001]本發明屬于微生物發酵及其酶工程化應用領域，具體涉及一種高產木聚糖酶的黑曲霉(Aspergillus niger)SM751及所產的木聚糖酶，以及該木聚糖酶在木質纖維素水解液中酶解半纖維素的應用。
【背景技術】:
[0002]全球每年的半纖維素產量為6 X 101°噸，是僅次于纖維素的重要可再生碳資源庫，可廣泛的用來制造生物燃料和諸多的生化精煉品。在富含半纖維素原料的植物原料加工過程中，添加木聚糖酶可顯著加速反應進程，促進其它酶如纖維素酶、果膠酶和甘露聚糖酶等酶的酶解效果，顯著改善產品的使用特性。因此，木聚糖酶被廣泛地應用到紙漿造紙、食品、飼料和紡織等傳統領域和木質纖維素乙醇領域。
[0003]木聚糖酶在木質纖維素酶解領域具有重要的應用價值。有學者認為，通過添加木聚糖酶等酶的混合纖維素酶才是降低木質纖維素領域用酶成本和提高酶解效率的決定性因素。Varnai A (2011)的研究結果表明，針對來源于軟木、硬木和農作物的木質纖維素，木聚糖酶作為纖維素酶的副酶可以顯著地降低纖維素酶的用酶成本、提高纖維素酶的酶解效率。其可能的機理是通 過消除木聚糖的阻塞作用或者降解木寡糖對于纖維素酶吸附的阻礙以促進纖維素酶的酶解。Alvira (2011)的研究結果表明，木聚糖酶與纖維素酶的協作程度可以達到29.9%，并且能夠增加10%的水解糖。甚至有學者Hu J (2011)認為，可以利用木聚糖酶來部分的代替纖維素酶。
[0004]木聚糖酶在木質纖維素原料生產纖維乙醇工藝中具有重要的使用價值。不過，并不是所有的木聚糖酶都可以適用于預處理之后的木質纖維素。預處理之后的木質纖維素，其預處理液中往往含有或多或少的發酵抑制物。發酵抑制物有乙酸、糠醛、5-羥甲基糠醛、香草醛、阿魏酸等。國內外數千篇的木聚糖酶研究報告中，僅有少數幾篇研究牽涉到發酵抑制物對于木聚糖酶的影響。de Souza Moreira (2013)的研究表明，香草醒和阿魏酸對于來源于土曲霉的木聚糖酶具有一定的抑制作用或者激活作用，但該研究中所用的土曲霉所產的木聚糖酶酶活極低。而關于糠醛、乙酸以5-羥甲基糠醛對于木質纖維素預處理后的木聚糖酶酶解作用的影響尚未見報道。此外，酵母發酵過程所產生中的乙醇也會對木聚糖酶的酶解作用產生抑制作用。
[0005]當前關于預處理后發酵抑制物對木聚糖酶酶解性能的影響研究報導極其少見。

【發明內容】
:
[0006]本發明的第一個目的是提供一種高產木聚糖酶的黑曲霉(Aspergillus niger)SM751，該菌于2013年12月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為:CGMCC N0.8670。
[0007]本發明的黑曲霉(Aspergillus niger) SM751是從廣西省木論保護區中的枯枝爛葉、土壤等材料中篩選培養出來。其真菌分類學表明:該菌菌絲體起初呈白色，約36-48h后菌落顏色逐漸變成灰黑色，最終在48h可產旺盛、濃密的黑色孢子。常規方法提取真菌的18s rDNA，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，經18s rDNA序列分析表明，其屬于黑曲霉(Aspergillus niger),將其命名為黑曲霉(Aspergillus niger) SM751,該菌于 2013 年 12月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為=CGMCC N0.8670。
[0008]利用木聚糖(Beech wood, SIGMA)測定木聚糖酶酶活,發現黑曲霉(Aspergillusniger)SM751能高產木聚糖酶，該酶的固體發酵酶活最高可達10446IU/g，最適反應pH值為
5.0，在pH3.0~6.0之間，酶活殘留率高達93-99.8%。在pH6.5時酶活為最佳pH酶活的78%。因此，該酶在pH3.0~6.0之間具有很強的pH穩定性。最適反應溫度為45°C ;37°C、50。。與55°C時的酶活殘留率分別為80.41%,98.96%與79.01%。
[0009]因此，本發明的第二個目的是提供一種木聚糖酶，其特征在于，以黑曲霉(Aspergillus niger) SM751為發酵菌株,經發酵而制得。
[0010]本發明的第三個目的是提供黑曲霉(Aspergillus niger) SM751在生產木聚糖酶上的應用。
[0011]本發明的木聚糖酶能夠耐受預處理后發酵抑制物。該菌所產生的木聚糖酶在多種抑制物的混合作用下，酶活受到激活，相較空白對照，酶活最高激活率達到了 33.43%。
[0012]因此，本發明的第四個目的是提供木聚糖酶在木質纖維素水解液中酶解半纖維素的應用。
[0013]本發明提供的黑曲霉(Aspergillus niger) SM751,其能高產高酶活的、能耐受預處理后發酵抑制物的木聚糖酶，因此在木質纖維素酶解領域具有廣泛的應用。
[0014]本發明的黑曲霉(Aspergillus niger) SM751,該菌于2013年12月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為=CGMCC N0.8670。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0015]圖1是pH值作為發酵參數對本發明的黑曲霉(Aspergillus niger)SM751產木聚糖酶酶活性的影響；
[0016]圖2是本發明黑曲霉(Aspergillus niger) SM751產木聚糖酶的pH酶學特性；
[0017]圖3是本發明黑曲霉(Aspergillus niger) SM751產木聚糖酶的溫度酶學特性；
[0018]圖4是各種不同的發酵抑制物對本發明的黑曲霉(Aspergillus niger) SM751產木聚糖酶的作用；
[0019]圖5是應用本發明的黑曲霉(Aspergillus niger)SM751的18S rDNA構建的系統發育樹。
【具體實施方式】:
[0020]以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0021]實施例1:菌株的篩選
[0022]篩選樣品為枯枝爛葉、土壤等材料。篩選樣品經過適當處理后，梯度稀釋涂布于木聚糖初篩培養基，該培養基的配方是:每升培養基中含有KH2PO40.5g，(NH4)2S042.0g,MgSO4.7Η200.25g，木聚糖(購自上海源聚生物)5.0g，瓊脂18~20g，余量為水，pH5.6。30°C培養4~7d，挑取水解透明圈較大的菌落在PDA培養基上純化，純化后的菌株進行PDA斜面保存。
[0023]產木聚糖酶菌株發酵活力復篩:將PDA斜面保存的純化菌株分別接種到等量的發酵復篩培養基液，30°C，120rpm，培養6d，得到發酵液(即酶液)。依據Bailey (1992)等人的測定方法并進行適當修改。具體方法為:準確稱取木聚糖lg，在PH4.8 (0.2mol/L)的醋酸~醋酸鈉緩沖液低速攪拌2.5h后定容配置成1%的底物。取0.9mLl%的木聚糖底物置于15mL刻度試管，于50°C恒溫預熱5min。準確加入適當稀釋的酶液0.2mL，用秒表精確計時反應30min，立即加入2mL DNS終止反應，沸水浴5min，于540nm處測光吸收值(OD)。然后選擇木聚糖酶活力較高的菌株進行妥善保藏。所述的發酵復篩培養基液為修改過的Mandel ’ s營養液，其是在原Mandel’ s營養液的基礎上去掉酵母粉和蛋白胨再加入玉米芯粉，使其終濃度為30g/L。[0024]經篩選獲得I株木聚糖酶活力極高的菌株，將該菌株命名為菌株SM751。
[0025]采用改良CTAB法提取菌株SM751總DNA，選擇擴增真菌ITS序列的通用引物ITSl: 5，-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3，和 ITS4:5，-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3，對黑曲霉(Aspergillus niger)SM751總DNA進行序列的擴增。在20 μ L的PCR反應體系中含有 10XBuffer2y L (含 MgCl2, 2.5mmol/L), dNTP (10mmol/L) 0.4 μ L，引物量為 IOpmol,rTag (5U/ μ L)0.2 μ L，約50ng的模板DNA，其余體積以無菌超純水補足。PCR擴增條件為:95°〇預變性311^11，941:變性 lmin，52°C退火 50s，72°C延伸 50s，35 個循環，72°C延伸 lOmin。PCR擴增產物采用DNA凝膠回收試劑盒進行割膠回收。進行測序。經測序，其序列如SEQ IDN0.1所示。將該序列與GenBank數據庫中的已知序列進行BLAST比較分析，并從數據庫獲得相關種屬的18S rDNA序列，構建系統發育樹，如圖5所示，經比較分析并結合BIOLOG鑒定結果，該菌屬于黑曲霉，將其命名為黑曲霉(Aspergillus niger) SM751，該菌于2013年12月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)Jia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，其保藏編號為=CGMCC N0.8670。
[0026]實施例2:木聚糖酶的制備及其酶活力、酶學性質測定
[0027]1.木聚糖酶制劑的制備:將黑曲霉(Aspergillus niger) SM751經種子培養后活化。種子培養基為修改過的Mandel’ s營養液(同實施例1 )，加入5g/L的木聚糖，起始PH5.6。在115°C下滅菌30min。設定搖床的參數為:30°C，120rpm，培養3天后獲得種子培養液。將種子培養液以10% (v/w)的接種量接種到固體發酵培養基中。固態發酵培養基的配方為:玉米芯與麩皮的質量比1:5，以玉米芯和麩皮的混合物為底物和支撐材料，以 1.4g/L(_2S04，2.0g/L KH2PO4,0.3g/L CaCl2,0.3g/L MgSO4，添加適量的微量元素(FeSO4 *7H20,5mg/L ；CoCl2, 20mg/L ；MnSO4, 1.6mg/L ；ZnSO4,1.4mg/L)配置成營養液，溶劑為水。該營養液的起始PH為3.5 (如圖1，該pH值是在一系列單因素優化實驗后確定的)，以料水比(玉米芯和麩皮的混合物:營養液)1:3.5配置好固態發酵培養基后進行滅菌。接種量為7.5%v/v進行發酵。發酵92-108h后，其發酵液即為木聚糖酶制劑，進行木聚糖酶酶活測定。
[0028]在三角瓶中加入40mL pH4.8的醋酸緩沖液，用玻璃棒搗碎結塊的固體發酵培養基(同上)，于110rpm30°C搖蕩60min,直接吸取未經離心及過濾的浸提液0.4mL進行梯度稀釋，直至達到適當的倍數，然后進行木聚糖酶酶活的測定。
[0029] 2.木聚糖酶的酶活力測定:依據Bailey(1992)等人的測定方法并進行適當修改。稱取Ig山毛櫸木聚糖置于IOOmL燒杯后，倒入60mL pH4.8的醋酸緩沖液低速攪拌2.5h，然后定容IOOmL容量瓶配置成1%山毛櫸木聚糖溶液。吸取0.9mLl%山毛櫸木聚糖溶液(Beechwood, SIGMA)作為底物,預熱5min再加入0.2mL適當稀釋的木聚糖酶,在50°C反應30min,立即加入2mL DNS溶液終止反應，沸水浴5min，于540nm處測光吸收值(OD)。經測定，步驟I得到的黑曲霉(Aspergillus niger) SM751產的木聚糖酶的活力達到10446IU/g,具有極聞的酶活力。
[0030]酶活定義:在Imin內催化產生I μ mo I還原木糖的量定義為一個酶單位。
[0031]3.木聚糖酶的酶學性質的測定:按上述測定方法，其它條件不變的情況下，調節緩沖液到不同的pH、不同的溫度進行酶活測定反應，以測得最高酶活為100%，其它pH值下或者溫度下的酶活與最高酶活相除之后乘以100%即為相對酶活。利用相應的緩沖液進行梯度稀釋，在50°C下測定最佳pH。在最佳的pH條件下，設定不同溫度以測定酶的最佳溫度。
[0032]結果表明，本發明的黑曲霉(Aspergillus niger)SM751產的木聚糖酶的最佳反應pH為5.0 (如圖2所示)，且在pH5.0的條件下保持酶活穩定，最適反應溫度為45°C (如圖3所示)。該酶在ρΗ3.5~6.0之間具有優良的pH穩定性，其相對酶活為93.45%~99.84%。
[0033]實施例3:發酵抑制物對于木聚糖酶的作用
[0034]1.單一的發酵抑制物對于木聚糖酶(黑曲霉(Aspergillus niger) SM751產的木聚糖酶)的抑制作用:
[0035]不同的發酵抑制物對木聚糖酶的抑制作用不同。如圖4所示，在乙醇濃度為10.00g/L時，木聚糖酶的酶活殘留率為102.15%，酶活提高約2.15%。在乙酸濃度為10.1Og/L時，木聚糖酶的酶活殘留率為99.05%?？啡舛葹?.40g/L時，木聚糖酶的殘留率為100.08%。5-羥甲基糠醛濃度為1.20g/L時，木聚糖酶的殘留率為95.64%。香草醛的濃度為1.10g/L時，木聚糖酶的殘留率分別為98.16%。阿魏酸的濃度為1.10g/L時，木聚糖酶的殘留率為72.99%。因此，本發明的木聚糖酶對于發酵抑制物具有良好的耐受性。
[0036]2.混合抑制物對于木聚糖酶(黑曲霉(Aspergillus niger) SM751產的木聚糖酶)的抑制作用:
[0037]乙醇(11.90g/L)、乙酸(13.60g/L)、糠醛(1.40g/L)、5_ 羥甲基糠醛(1.10g/L)、阿魏酸(1.20g/L)和香草醛(1.30g/L)的混合物對于木聚糖酶具有激活作用。酶活殘留率為133.39%，也就是說，在此發酵抑制物的作用下，木聚糖酶酶活為11008IU/g，激活率可達33.39%ο
[0038]由此可見,本發明的黑曲霉(Aspergillus niger) SM751產的木聚糖酶酶活力較高，酶活高達10446IU/g。在應用于木質纖維素水解液酶解時，對于各種單一的發酵抑制物或者多種發酵抑制物的混合物具有優良的耐受性。
[0039]本發明的木聚糖酶的對抑制物的耐受性與現有技術中的木聚糖酶完全不同，這種耐受性的木聚糖酶未見有過報道。
[0040]利用黑曲霉(Aspergillus niger) SM751產的木聚糖酶來酶解高溫液態水預處理后的甘蔗渣。高溫液態水預處理甘蔗渣的條件為:180度，氮氣加壓4MPA，20min，固液比1:20。加入600IU的木聚糖酶酶解24h之后，木糖得率為75.63%。 [0041]上述詳細說明是針對本發明的可行實施例的具體說明，該實施例并非用以限制本發明的專利范圍，凡未脫離本發明的等效實施或變更，均應包含于本發明的專利范圍中。
【權利要求】
1.一種黑曲霉(Aspergillus niger) SM751，其保藏號為=CGMCC N0.8670。
2.—種木聚糖酶，其特征在于，以權利要求1所述的黑曲霉(Aspergillus niger)SM751為發酵菌株，經發酵而制得。
3.權利要求1所述的黑曲霉(Aspergillusniger)SM751在生產權利要求2所述的木聚糖酶上的應用。
4.權利要求2所述的木聚糖酶在木質纖維素水解液中酶解半纖維素的應用。
【文檔編號】C12N9/42GK103923840SQ201410124121
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年3月28日 優先權日:2014年3月28日
【發明者】袁振宏, 許敬亮, 何敏超, 張宇, 孔曉英, 陳小燕, 粱翠誼, 郭穎, 劉云云 申請人:中國科學院廣州能源研究所