一種用于檢測白色念珠菌的引物對、試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于檢測白色念珠菌的引物對、試劑盒及其應用。本發明的引物對包括上游引物和下游引物，所述上游引物為SEQ?ID?NO：1上的一段序列，所述下游引物為SEQ?ID?NO：1的互補序列上的一段序列。使用本發明的特異性引物對能夠快速、靈敏、準確地從臨床樣品中檢測白色念珠菌，這對于早期診斷、及時治療和有效控制生殖道白色念珠菌感染極有意義。
【專利說明】一種用于檢測白色念珠菌的引物對、試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及疾病檢測【技術領域】，尤其涉及白色念珠菌的檢測，特別涉及一種用于檢測白色念珠菌的引物對、試劑盒和基因芯片。
【背景技術】
[0002]生殖道感染(Reproductive Tract Infection, RTI)是指各種病源微生物和寄生蟲感染于生殖道或是經生殖道感染的一組感染性疾病的統稱，包括內源性、外源性、醫源性及性傳播等感染，該病主要發生于生育期。生殖道感染疾病危害性涉及到諸多方面，表現在:(I)危害人類生殖健康，所導致的嚴重后果包括慢性盆腔炎疼痛、男女不孕癥、宮外孕、異位妊娠和感染HIV風險增加等。(2)RTI還會對新生兒的健康帶來影響，很多性傳播疾病(如梅毒、淋病、衣原體、乙肝、人類乳頭狀瘤病毒、單純皰疹病毒和艾滋病毒)可以通過婦女的懷孕期、分娩期和哺乳期傳給孩子，這被稱為“垂直傳播”，給嬰兒的健康造成嚴重后果。另外RTI也會引起自然流產、胎膜早破、早產和由此產生的低出生體重以及死胎。當孕婦為淋病患者時，多達35%的妊娠結果為自然流產和早產，多達10%為圍產兒死亡。當孕婦衣原體未經治療，新生兒先天性感染幾率為30%，每年有數千名新生兒因此而失明。(3)生殖道感染疾病影響避孕節育的安全性。(4)生殖道感染還可增加宮頸癌發生的危險。(5)生殖道感染會增加多種疾病混合感染的危險，例如淋病患者感染衣原體、支原體的概率為非感染者的3-5倍。RTI帶來這些嚴重的后果，對男性、女性個人和他們的家庭乃至整個社區造成健康問題。在我國有生殖感染癥狀的育齡婦女比例高達34.1%，已婚育齡婦女的既往生殖感染率高達73%，同時生殖感染疾病發病率目前也正以30%的速度逐年增長。
[0003]婦女RTI疾病 嚴重影響人類生殖健康，隨著RTI發病率的上升，經濟生產率受到影響，很多家庭的生活質量下降，RTI已經成為當今人類面臨的重大社會問題。
[0004]白色念珠菌(Candida albicans, CA)又稱假絲酵母菌,廣泛存在于自然界,也存在于正常人口腔、上呼吸道、腸道及陰道，一般在正常機體中數量少，不引起疾病，為條件致病性。當機體抵抗力降低或菌群失調時，白色念珠菌由酵母相轉化為有毒性的菌絲相并快速繁殖侵入人體細胞從而引起疾病。白色念珠菌是RTI重要的條件致病性真菌，白色念珠菌感染給人們特別是育齡婦女帶來非常嚴重的危害，造成的女性生殖器官病理性改變，是不孕不育的重要原因。孕婦感染白色念珠菌后，影響胎兒發育，上行感染時，會導致早產，也會引起宮頸炎和宮頸糜爛，如果病原體進入宮腔，則會引起輸卵管卵巢炎癥、盆腔炎等后果。
[0005]近年來，隨著社會發展及人們生活環境等因素改變，并伴隨光譜抗菌藥物、腫瘤化療、器官和細胞移植技術的發展、激素、放療、化療及免疫抑制劑的廣泛應用和侵入性醫療操作的普遍使用，機會性真菌尤其是白色念珠菌引起的生殖道感染人口數量日益增多。有文獻報道，女性陰道白色念珠菌感染率為80.77%，并且大部分經治療后極易復發，難以徹底治愈。
[0006]CA的傳統檢測有濕片法、免疫血清檢查、微生物法(培養觀察菌落特征和菌體形態結合生化特性檢驗)和動物接種等方法。濕片法敏感性較低(30%~50%)；白色念珠菌在人體某些部位正常寄居，其孢子可存在于正常人體，而且與人體某些組織間有共同抗原，使免疫血清鑒定缺乏特異性；微生物法培養時間長，而且生化性狀陽性率參數設置因地域差或生化型不好控制，直接影響鑒定結果的準確性，漏檢率也很高；動物接種法可靠，但手續繁瑣，對早期診斷不利，難以推廣。自上世紀80年代起，分子生物學研究的不斷深入，新的技術也普遍應用于白色念珠菌的檢測，如分子雜交和熒光探針和直接免疫熒光法等，這些方法需要特殊的實驗設備和條件，成本較高，難以在臨床推廣。有報道以白色念珠菌的P47細胞質的抗原蛋白建立了 ELISA檢測試劑盒，但此試劑盒缺乏敏感度和特異性，有待臨床考驗。由于早期治療能減低病死率，因此，快速、靈敏、準確地從臨床標本中直接檢出CA對于疾病的早期診斷和治療有著非常重要的意義。
[0007]自上世紀80年代起，分子生物學研究的不斷深入，PCR技術開始廣泛應用于微生物領域，該技術靈敏度好、特異性高，操作簡單、快速，很大程度上縮短了診斷時間。

【發明內容】

[0008]針對現有技術的不足，本發明人通過PCR方法確定了一段白色念珠菌的保守序列，通過檢測該段保守序列能夠檢測白色念珠菌的感染，所述保守序列具有SEQ ID N0:1所示的序列。因此，本發明的目的在于提供一種用于檢測白色念珠菌的引物對，包括所述引物對的PCR檢測試劑盒及其應用。使用本發明提供的白色念珠菌的特異性引物對能夠快速、靈敏、準確地從臨床樣品中檢測白色念珠菌，這對于早期診斷、及時治療和有效控制生殖道白色念珠菌感染極有意義。
[0009]在第一方面，本發明提供一種用于檢測白色念珠菌的引物對，包括上游引物和下游引物，所述上游引物為SEQ ID NO:1上的一段序列，所述下游引物為SEQ ID N0:1的互補序列上的一段序列。
[0010]本發明人通過研究發現，SEQ ID NO:1是一段在白色念珠菌基因組上具有高度保守性的序列，而且相比于白色念珠菌基因組上的其它序列片段，該序列片段更容易擴增，針對該序列片段通過設計引物對取自人體(如女性生殖器)的樣品進行PCR擴增能夠判定白色念珠菌的感染情況。發明人針對該序列片段設計了多對引物進行PCR擴增，均能得到預期的擴增產物。而針對白色念珠菌基因組上的其它幾個序列片段設計引物進行PCR擴增，沒有得到預期的擴增產物。說明本發明的SEQ ID NO:1是易于擴增的序列片段，能夠用于確定白色念珠菌的感染。
[0011]作為本發明的優選技術方案，所述上游引物和下游引物的序列長度均為12-30個堿基，例如12個堿基、15個堿基、16個堿基、18個堿基、20個堿基、22個堿基、25個堿基、27個喊基或29個喊基等。
[0012]作為本發明的優選技術方案，所述上游引物的5’端起始于SEQ ID NO:1的第一個堿基；所述下游引物的5’端第一個堿基與SEQ ID NO:1的最后一個堿基互補。其中，SEQID NO:1的第一個堿基即5’端的首個堿基，最后一個堿基即3’端的首個堿基。這樣的一對引物能夠擴增出SEQ ID N0:1的全長序列，長度為118bp。
[0013]作為本發明的優選技術方案，所述上游引物和下游引物的PCR擴增產物的大小為80-118bp，例如 82bp、88bp、92bp、98bp、100bp、105bp、108bp、112bp、114bp、115bp 或 117bp,優選90-118bp，更優選99-118bp。PCR擴增產物的大小具體是由引物對在SEQ ID N0:1序列上的位置決定的。
[0014]作為本發明的優選技術方案，所述引物對的擴增產物為SEQ ID NO:USEQ ID NO:10、SEQ ID N0:15 或 SEQ ID NO: 18，大小分別為 118bp、112bp、104bp 和 99bp。
[0015]作為本發明的優選技術方案，所述上游引物選自SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13 或 SEQ ID NO:16 ;所述下游引物選自 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:170可以從上游引物的具體例中選擇一個引物與從下游引物的具體例中選擇的一個引物配對進行PCR擴增。[0016]作為本發明的優選技術方案，所述引物對選自下列任一項:
[0017](a)所述上游引物為SEQ ID NO:2，所述下游引物為SEQ ID NO:3 ；
[0018](b)所述上游引物為SEQ ID NO:4，所述下游引物為SEQ ID NO:5 ；
[0019](c)所述上游引物為SEQ ID NO:6，所述下游引物為SEQ ID NO:7 ；
[0020](d)所述上游引物為SEQ ID NO:8，所述下游引物為SEQ ID NO:9 ；
[0021](e)所述上游引物為SEQ ID NO:11，所述下游引物為SEQ ID NO:12 ；
[0022](f)所述上游引物為SEQ ID NO:13，所述下游引物為SEQ ID NO:14 ；
[0023](g)所述上游引物為SEQ ID NO:16，所述下游引物為SEQ ID NO:17。
[0024]本發明人使用(a)~(g)中的7對引物進行PCR擴增，分別得到118bp、118bp、118bp、112bp、112bp、104bp和99bp的擴增產物，與預期相符，因此可使用這7對引物作為檢測白色念珠菌感染的引物對。
[0025]在第二方面，本發明提供一種白色念珠菌的PCR檢測試劑盒，包括第一方面所述的引物對。
[0026]作為本發明的優選技術方案，所述PCR檢測試劑盒還包括PCR緩沖液、MgCl2溶液、dNTPs和Taq DNA聚合酶。
[0027]在第三方面，本發明提供一種第一方面所述的引物對在作為白色念珠菌的PCR檢測試劑盒的特異性引物或作為白色念珠菌的基因芯片探針序列中的應用。
[0028]本發明的有益效果為:本發明人研究發現了一段白色念珠菌的保守序列SEQ IDNO:1，該段保守序列易于擴增，具有高度的白色念珠菌特異性，本發明針對該序列設計了引物對，使用本發明提供的引物對擴增臨床樣品，能夠快速、靈敏、準確地從臨床樣品中檢測白色念珠菌，對于早期診斷、及時治療和有效控制生殖道白色念珠菌感染極有意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為本發明實施例1的引物對擴增臨床標本的PCR擴增產物鑒定結果圖，其中泳道Mr為DNA Marker,泳道I和2為從臨床陽性樣品(白色念珠菌感染)DNA中擴增的產物，泳道3為陰性對照。
[0030]圖2為本發明實施例1陽性擴增產物的測序結果圖，其中，測序圖譜上第167位G到284位G之間的序列為擴增產物的序列，與預計序列一致。
[0031]圖3為本發明實施例1陽性擴增產物的測序結果與NCBI數據庫中Blast比對結
果O【具體實施方式】
[0032]下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述。本領域技術人員將會理解，以下實施例僅為本發明的優選實施例，以便于更好地理解本發明，因而不應視為限定本發明的范圍。
[0033]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所用的實驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑廠商購買得到的。
[0034]實施例中，pMD18-T載體、PCR buffer、MgCl2, dNTPs、Taq DNA 聚合酶和 DNALigation Kit 購自 Takara (大連)，DNeasy Plant Mini Kit 購自 Qiagen 公司。試劑盒保存于-20°C，盡量避免反復凍融。
[0035]實施例1:
[0036]本實施例以GMCCACCTCAMATCATCCAAC(SEQ ID NO:2)和 CTTGAGAAGACGMGAAGCGG(SEQ ID NO:3)作為引物對擴增臨床樣本。
[0037](1) PCR擴增反應
[0038]準備好3支PCR反應管，分別向其中加入臨床陽性樣品DNA和陰性對照樣品，隨后分別加入0.1yL Taq 酶、0.8μ L dNTPs (2.5mM)U μ L PCR buffer (10*PCR buffer),
0.6μ L MgCl2(25yM)、0.1yL上游引物(100 μ M)和 0.1 μ L下游引物(100 μ Μ)，用 ddH20補充至總體積?ο μ L。將已經加好樣的PCR管放置PCR儀上，設置PCR反應參數(見表1)，進行擴增；反應結束后，用1%的瓊脂糖凝膠進行鑒定，結果如圖1，樣品大小結果與預計大小相符，陰性結果正常。
[0039]表1PCR反應參數
【權利要求】
1.一種用于檢測白色念珠菌的引物對，包括上游引物和下游引物，所述上游引物為SEQID NO:1上的一段序列，所述下游引物為SEQ ID NO:1的互補序列上的一段序列。
2.根據權利要求1所述的引物對，其特征在于，所述上游引物和下游引物的序列長度均為12-30個堿基。
3.根據權利要求1或2所述的引物對，其特征在于，所述上游引物的5’端起始于SEQID NO:1的第一個堿基；所述下游引物的5’端第一個堿基與SEQ ID NO:1的最后一個堿基互補。
4.根據權利要求1或2所述的引物對，其特征在于，所述上游引物和下游引物的PCR擴增產物的大小為80-118bp，優選90-118bp，更優選99_118bp。
5.根據權利要求1-4任一項所述的引物對，其特征在于，所述引物對的擴增產物為SEQID NO:U SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:15 或 SEQ ID NO:180
6.根據權利要求1-5任一項所述的引物對，其特征在于，所述上游引物選自SEQIDNO:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO:13 或 SEQ IDNO:16 ;所述下游引物選自 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:12, SEQ ID NO:14 或 SEQ ID NO:17。
7.根據權利要求1-6任一項所述的引物對，其特征在于，所述引物對選自下列任一項: Ca)所述上游引物為SEQ ID NO:2，所述下游引物為SEQ ID NO:3 ； (b)所述上游引物為SE QID NO:4，所述下游引物為SEQ ID NO:5 ； (c)所述上游引物為SEQID NO:6，所述下游引物為SEQ ID NO:7 ； Cd)所述上游引物為SEQ ID NO:8，所述下游引物為SEQ ID NO:9 ； Ce)所述上游引物為SEQ ID NO:11，所述下游引物為SEQ ID NO:12 ； Cf)所述上游引物為SEQ ID NO:13，所述下游引物為SEQ ID NO:14 ； (g)所述上游引物為SEQ ID NO:16，所述下游引物為SEQ ID NO:17。
8.一種白色念珠菌的PCR檢測試劑盒，包括權利要求1-7任一項所述的引物對。
9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，還包括PCR緩沖液、MgCl2溶液、dNTPs和Taq DNA聚合酶。
10.一種權利要求1-7任一項所述的引物對在作為白色念珠菌的PCR檢測試劑盒的特異性引物或作為白色念珠菌的基因芯片探針序列中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK103882135SQ201410125747
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月31日 優先權日:2014年3月31日
【發明者】黃鐘, 李小青 申請人:深圳意達凱生物科技有限公司