一種利用線粒體D-loop區特異區域鑒定黿的標記引物及方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種利用線粒體D-Ioop區特異區域鑒定電的標記引物及方法。
【背景技術】
[0002] 電(Pelochelys cantorii)是電屬僅有的S個種之一，又被稱為"水中大熊貓"。電 生活在淡水中，是整科中體型最大的一種。電廣泛分布在東南亞各國，中國南部，印度和己 基斯坦的海岸。然而，因為捕獵，棲息地的破壞W及環境的污染，電的分布范圍和數量急劇 減少。在1996年，電被列入世界自然保護聯盟（IUCN)世界溯危動物紅色名錄易危種，并在 2000年提升為溯危種。因為電極度溯危的狀態，中國也將它列為一級保護動物。
[0003] 電的稀少使得人們缺少對它的了解，形態特征無法單獨作為精確判斷的標準，鑒 定方法不夠準確。電和整在幼體階段非常相似，野外的個體得不到有效保護。因為沒有專業 知識，人們有時會錯誤的將野外捕到的成電當作野生大整售賣。運種問題進一步加重了電 種質資源的減少，從而影響了保護措施的有效性。
[0004] 線粒體基因組是16-18kb大小的環狀DNA，編碼13個蛋白，22個tRNA，2個rRNA。線粒 體DNA具有結構簡單，高突變率，缺少基因重組W及嚴格的母性遺傳的特性。因為運種特點， 線粒體DNA被廣泛的用于物種鑒定，系統進化，種群多樣性等方面的研究。

【發明內容】

[0005] 本發明目的之一是提供一種利用線粒體D-Ioop區特異區域鑒定電的標記引物。
[0006] 本發明采用W下技術方案來實現本發明的目的：一種利用線粒體D-Ioop區特異區 域鑒定電的標記引物，為W下引物組： DlF:5 '-ATTAATTCATGCTTGTAGGAC-3 ' D1R:5'-CGGGGTAGGGGGTTTAG-3'。
[0007] 線粒體DNA(mtDNA)控制區，又稱D-Ioop區，是一段非編碼區，通常位于tRNAPro和 tRNAPhe基因之間。結構較為復雜，分為3個區段:終止序列區、中央保守區和保守序列區。由 于缺乏編碼的壓力，控制區的進化速度相對較快，其序列的變異不僅有核巧酸之間的替換， 還有不同長度核巧酸序列的缺失、插入或不同拷貝數的串聯重復，是線粒體DNA序列和長度 變異最大的區域，常用于種內的遺傳多樣性，進化分析等。盡管mtDNA變異率高，但也存在一 些保守序列，運些保守序列可W承擔標記基因的作用。本發明人采用廣東省的高明和肇慶 廣寧的死亡的幼電樣本提取線粒體DNA與NCBI上廈口電和永嘉電的線粒體DNA對比，發現電 的線粒體DNA控制區存在重復片段的特殊結構，而該特殊結構在目前已知的龜整物種中均 沒有發現?？梢?，線粒體DNA控制區序列在種內幾乎是相同的，在種間的差異很大，可用于種 間鑒別。因而，本發明根據所述特殊結構設計特異性引物用來實現對電的鑒定。本發明人還 采用多個電個體進行驗證，排除了由于單個個體突變所產生特殊結構的可能性，保證了引 物應用的廣泛性和可靠性。發明人針對電的線粒體DNA控制區存在的重復片段設計引物對， 并驗證所設及引物的特異性。圖1中虛線標注的地方為上游引物的設計位置，實線標注的地 方是下游引物的設計位置，而各引物組擴增的預期片段大小見表1。經過驗證，設計的Dl引 物對特異性最強。
[000引本發明的目的之二為提供一種鑒定電的方法。具體為，一種利用線粒體D-Ioop區 特異區域鑒定電的方法，采用上述引物組對待測樣本的全基因組DNA進行PCR擴增，然后進 行電泳，如能夠獲得兩條電特異性多態性片段的條帶，即判斷待測樣品的物種是電，反之則 獲得相反結果。
[0009]或者，在電泳后，切膠回收電特異性多態性片段進行連接載體測序，所得結果與已 有電線粒體DNA對比，運樣就可更加確切地判斷待測樣品的物種是否是電。
[0010] 本發明所述PCR擴增反應的循環參數為：94°C解鏈4min，94°C變性30s，59°C退火 30s，72°C 延伸 3〇3,30個循環，72°(：延伸1〇111111。
[0011] 本發明的有益效果是： (1)本發明根據電線粒體DNA控制區存在重復片段的特殊結構設計特異性引物，利用 所設計的特異性引物對待測樣本的全基因組DNA進行擴增，根據擴增后的電泳是否出現電 的特異性多態性片段來判斷待測樣本的物種是否為電。
[0012] (2)本發明利用mtDNA標記，但不需要單獨提取mtDNA用于鑒定，只需按常規方法 提取全基因組，利用全基因組中少量的mtDNA即可通過引物通過PCR擴增及電泳后獲得鑒定 結果，操作簡單，周期時間短，可大批量進行鑒定，一天即可得到鑒定結果。
【附圖說明】
[001 ：3 ]圖1是不同電的線粒體DNA中控制區的氨基酸序列的比對， 虛線標注的地方是引物Dl和D3上游引物D-Ioop區的設計位;黑線標注的是Dl和D3的下 游引物的設計位置，在序列上有兩個結合位置。
[0014] 圖2是特異引物篩選擴增片段電泳圖， 1為引物Dl擴增結果;2和3為引物D2擴增結果;4為引物D3擴增結果;5為化5000 mark。
[0015] 圖3是特異引物擴增片段電泳圖， 1-4為廣寧電擴增產物;5-8為高明電擴增產物;9為化2000 mark; 10-15為黃喉擬水龜 擴增產物；16-22為中華整擴增產物。
【具體實施方式】
[0016] W下實施例僅用于闡述本發明，而本發明的保護范圍并非僅僅局限于W下實施 例。所述技術領域的普通技術人員依據W上本發明公開的內容，均可實現本發明的目的。 [0017]材料和方法 1.1材料 在廣東省的高明和肇慶廣寧，分別發現有電的活體材料。它們被保護在池塘中進行養 殖，雌電性成熟產卵，已成功解化幼電。實驗用的組織取自死亡的幼電樣本，用利用組織 E.Z.N.A.? Tissue DNA Kit (Omega Bio-Tek, Guangzhou, Qiina)提取分布兩地的電全 基因組DNA，-20度保存備用。
[0018] 提取步驟具體如下： 1)取保存于無水乙醇中的肌肉組織30yg左右，用去離子水洗涂指甲上的酒精，并放在 濾紙上干燥。
[0019] 2)把洗凈驚干的組織轉入1.5ml離屯、管中，加入20化L Buffer TL,剪碎。
[0020] 3)加入20化OB蛋白酶，混勻，放在搖床中，55°C，180r/min消解1-3 h。
[0021] 4)消化后aooog離屯、5min，吸取上清液，轉移至1.5ml離屯、管內，棄沉淀。
[0022] 5)加入220ul Buffer BL，混勻，在70°C水浴鍋中放置lOmin，期間混勻2-3次。
[0023] 6)取出后加入220 Ul無水乙醇，混勻。
[0024] 7)將上一步中的混合液轉移至套在2ml收集管中化Bind DNA柱中，室溫中SOOOg 離屯、Imin，將DNA結合到濾膜上，棄濾液。 8)將柱子轉移到另一組2ml收集管中，加入50化L皿Buffer,室溫SOOOg離屯、Imin, 棄濾液。
[00巧]9)再將柱子轉移到另一組2ml收集管中，加入650化用乙醇稀釋的DNA Wash Buffer，室溫中SOOOg離屯、Imin，倒掉濾液 10)用同一組收集管重復上述步驟9)。
[00%] 11)將柱子重新放在收集管中，室溫中ISOOOg離屯、3min。
[0027] 12)將柱子裝在1.5ml離屯、管上，打開柱子蓋子，干燥3min中，加50ul 70°C預熱 的無菌水。在室溫下放置3min。室溫下，1000 Og離屯、2min，得到的濾液即為DNA溶液。
[0028] 13)瓊脂糖凝膠電泳檢巧陽NA的純度及完整性，NanoQTM微型分光光度計檢巧陽NA 濃度，并用去離子水稀釋至終濃度20ngAiL，置于-20°C保存備用。
[0029] 特異性引物的設計和篩選 在D-Ioop區存在重復的部分(圖1)，根據重復部分設計了 2對引物(表1)。因為存在重復 片段，經過PCR電泳引物擴增結果就會呈現長度多態性。
[0030]

用設計的引物對電的全基因組DNA分別進行PCR擴增，參考預期的多態性片段大小和電 泳結果進行比較，篩選達到預期的引物。
[0031 ] PCR采用20 反應體系，1 的模板DNA (20 ng)，10 的Premix Taq?(Takara Biotechnology, Dalian, Qiina)，0.5 yl 的上下游引物（10 mM)，8 yl 水補至20 yl。 PCR擴增反應的循環參數為:94°C解鏈4min，94°C變性30s，59°C退火30s，72°C延伸30s，30個 循環，72 °C延伸lOmin。
[0032]電泳結果如圖2所示，設計的引物利用電基因組DNA擴增進行初篩，引物D1-3都呈 現了多態性片段。但是D2-3由于特異性不足，除了獲得了預期大小的片段，也出現了預期大 小之外的片段。而引物Dl沒有雜帶，同時得到了預期大小的目的條帶，選定作為主要的篩選 引物。
[0033] 引物擴增片段測序驗證 將PCR擴增產物利用E. Z. N. A膠回收試劑盒(Omega)純化回收： (I) 用T肥緩沖液配制1.2%(w/v)的瓊脂糖凝膠(含0.5iig/mL DNAgreen)。
[0034] (2)將DNA樣品加入點樣孔，220V電壓，常溫進行電泳13min。
[0035] (3)在紫外燈下觀察DNA帶遷移位置，當目的帶分離清楚時，用干凈的刀片切下含 有目的DNA的凝膠，轉入1.5mL離屯、管中。
[0036] (4)按照E. Z. N. A膠回收試劑盒操作步驟(Omega)介紹的方法回收純化PCR產物。
[0037] (5)稱取空離屯、管的重量，切下帶目的片段的凝膠裝在1.5mL離屯、管中并稱其重 量，近似地確定其體積。一般情況下，凝膠的密度為Ig/mL，于是凝膠的體積與重量的關系可 按下面換算：凝膠薄片的重量為〇.2g則其體積為0.2mL加入等倍凝膠體積的Binding Buffer,把混合物置于55°C-65°C水浴中溫浴7min至凝膠完全融化，其間每隔2-3min混勻一 次。
[0038] (6)轉移70化L的DNA-瓊脂糖溶液到一個化BindTM DNA柱子，并把柱子裝在一個干 淨的2mL收集管內，室溫下，10，000 X g離屯、Imin，棄去液體。
[0039] (7)-個化Bind DNA柱子最多可容納70化L的溶液，如果DNA-瓊脂糖混合物的體積 大于70化L，可先轉移70化L溶液至柱子，離屯、完后，將余下的溶液繼續加上柱子上。但是每 一個化Bind TM柱子最多可W結合25-3化g DNA。如果預期產量較大，則把樣品分別加到合 適數目的柱中。
[0040] (8)將柱子重新套回收集管中，加300化Binding Buffer至HiBind DNA柱子中； 室溫下，10，000 X g離屯、Imin，完全去除濾出液。
[0041 ] (9)將柱子重新套回收集管中，加入700化SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子 中，室溫下，10,OOOXg離屯、Imin,去棄濾出液。
[0042] (10)將柱子重新套回收集管中，重復加入700化SPW Wash buffer至HiBind DNA 柱子中，室溫下，10,OOOXg離屯、Imin，棄去濾出液； (II) 棄去濾出液后，將柱子重新套回收集管中，l〇,〇〇〇Xg離屯、IminW甩干柱基質殘 余的液體。
[0043] (12)把柱子裝在一個干凈的1.5mL離屯、管上，加入30~5化L洗脫液或滅菌水上柱 子膜上，10，000 X g離屯、Imin，離屯、管中的溶液就是純化的DNA產物，保存于-20°c。
[0044] 將回收的DNA連接到PMD18-T Vector載體中，轉化入感受態細胞D冊a，37°C培養化 后，挑選陽性克隆檢測后進行測序。引物Dl擴增的兩片段大小結果分別是107bp和37化P，與 預期結果相同。將測序結果的序列同NCBKNational Center for Biotechnology Inf ormat ion)上已經確定的電的線粒體DNA進行比對，比對結果的相似性為99%，故確定引 物Dl和D3通過PCR擴增得到的DNA片段為電的DNA片段。
[0045] 多個體及陰性對照驗證 篩選出引物后，取6個樣本采用引物Dl進行PCR擴增，然后電泳，觀察篩選的引物是否能 在大量樣本中正常作用，判斷引物的應用可行性。同時利用中華整，黃喉擬水龜的全基因組 DNA作為陰性對照進行擴增，確定引物是否只在電中出現了長度多態性或者是具有擴增能 力。由圖3所示的電泳結果可知，采用本發明提供的引物擴增的電樣本可W穩定的出現兩條 多態片段，整跑不出完整條帶，而黃喉擬水龜只能擴增出一種片段，從而證明本發明的引物 的特異性。
[0046] PCR 采用20 反應體系，1 的模板 DNA (20 ng)，10 的Premix TaqTM (Takara Biotechnology, Dalian, Qiina) ,0.5 yl 的上下游引物（10 mM)，8 yl 水補至 20 111。？〔巧廣增反應的循環參數為：94°(：解鏈4111111，94°(：變性3〇3,59°(：退火3〇3,72°(：延伸 30s，30個循環，72 °C延伸 10 min。
【主權項】
1. 一種利用線粒體D-l00p區特異區域鑒定黿的標記引物，其特征是，為以下引物組： DIF:5 '-ATTAATTCATGCTTGTAGGAC-3 ' DIR:5'-CGGGGTAGGGGGTTTAG-3'。2. -種利用線粒體D-loop區特異區域鑒定黿的方法，其特征是，采用權利要求1所述引 物組對待測樣本的全基因組DNA進行PCR擴增，然后進行電泳，如能夠獲得兩條黿特異性多 態性片段的條帶，即判斷待測樣品的物種是黿，反之則獲得相反結果。3. 權利要求2所述的利用線粒體D-loop區特異區域鑒定黿的方法，其特征是，所述PCR 擴增反應的循環參數為：94°C解鏈4min，94°C變性30 s，59 °C退火30s，72°C延伸30 s，30個循 環，72°C 延伸 lOmin。4. 一種利用線粒體D-loop區特異區域鑒定黿的方法，其特征是，采用權利要求1所述引 物組對待測樣本的全基因組DNA進行PCR擴增，然后進行電泳，切膠回收黿特異性多態性片 段進行連接載體測序，所得結果與已有黿線粒體DNA對比，這樣就可更加確切地判斷待測樣 品的物種是否是黿。5. 權利要求4所述的利用線粒體D-loop區特異區域鑒定黿的方法，其特征是，所述PCR 擴增反應的循環參數為：94°C解鏈4min，94°C變性30 s，59 °C退火30s，72°C延伸30 s，30個循 環，72°C 延伸 10min。
【專利摘要】本發明提供了一種利用線粒體D-loop區特異區域鑒定黿的標記引物，為以下引物組：D1F：5’-ATTAATTCATGCTTGTAGGAC-3’，D1R：5’-CGGGGTAGGGGGTTTAG-3’。本發明還提供了利用線粒體D-loop區特異區域鑒定黿的方法，采用所述引物組對待測樣本的全基因組DNA進行PCR擴增，然后進行電泳，如能夠獲得兩條黿特異性多態性片段的條帶，即判斷待測樣品的物種是黿，反之則獲得相反結果。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105713973
【申請號】CN201610170843
【發明人】朱新平, 張新鋮, 趙建, 李偉
【申請人】中國水產科學研究院珠江水產研究所