與水牛產奶性狀相關的snp標記及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了與水牛產奶性狀相關的SNP標記及其應用。所述SNP標記位于水牛LPAAT基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，其中在SEQ?ID?NO：1的第886bp、1471bp、2472bp、2813bp、3393bp和5540bp處的G886-A886、T1471-A1471、A2472-G2472、T2813-C2813、C3393-T3393和C5540-T5540的堿基突變，均與水牛產奶量顯著相關（p<0.05）；第1386bp處的A1386-G1386的堿基突變則與水牛產奶量極顯著相關（p<0.01）。本發明為水牛產奶性狀的標記輔助選擇提供了科學依據。
【專利說明】與水牛產奶性狀相關的SNP標記及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于家畜分子標記制備【技術領域】，具體涉及與水牛產奶性狀相關的SNP標記及其應用。
【背景技術】
[0002]據FA02013年的統計數據顯示，2011年底水牛存欄量為2338.2萬頭，僅次于印度11291.6萬頭和巴基斯坦3172.6萬頭，位居世界第三，可謂資源豐富。中國水牛屬于沼澤型品種，具有耐粗飼、役力大、耐濕、耐高溫、抗病力強等生物學特點，是我國南方地區重要的畜種，其資源豐富，奶質優良，營養豐富，具有“奶中之王”之美稱。但我國水牛產奶量較低，其泌乳性能遠低于世界著名的三大河流型水牛品種(摩拉、尼里-拉菲和地中海水牛)。為提升本地水牛的泌乳性能，我國自上世紀50年代和70年代分別從印度和巴基斯坦引進摩拉和尼里-拉菲水牛加以改良，并取得了較大的成效。盡管其產奶量得到了較大的提高，但仍存在著明顯的差異。因此，利用先進的分子標記輔助選擇技術應用于優良的奶水牛品種選育，對于改善水牛種質資源的創新與利用，尤其是有效的提高選種效率具有重要的意義。
[0003]泌乳主要來源于水牛的乳腺，受多種因素的影響，涉及乳腺發育和泌乳相關的基因、代謝通路以及細胞因子等。水牛的產奶性狀與其他家畜的經濟性狀一樣，同屬于數量性狀，由微效多基因控制。其中脂類代謝與其產奶量和乳品質相關。甘油三脂是乳脂和體脂的主要成分，溶血憐脂酸酸基轉移酶(lysophosphatitidic acid acy I transferase, LPAAT )可催化甘油三酯sn-2位置的酯化，催化溶血磷脂酸形成磷脂酸。而磷脂酸是甘油三酸脂及重要脂類分子信號生物合成的關鍵底物。顯然，LPAAT的生物學功能與水牛的產奶量和乳品質具有重要的相關性 。
[0004]迄今為止，尚無有關水牛LPAAT基因作為水牛產奶性狀的分子標記。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于圍繞我國水牛品種產奶量較低的問題，提供一種應用于選育水牛產奶性狀相關基因LPAAT。
[0006]本發明另一目的是提供上述一種水牛產奶性狀相關基因LPAAT SNP的篩選。
[0007]本發明還有一個目的是提供上述水牛產奶性狀相關基因LPAAT SNP的應用。
[0008]本發明解決上述技術問題的技術方案如下:
[0009]1.與水牛產奶性狀相關的SNP標記，所述SNP標記位于水牛LPAAT基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0010]上述LPAAT 序列的第 886bp、1471bp、2472bp、2813bp、3393bp 和 5540bp 處的G886-A886、T1471-A1471、A2472-G2472、T2813-C2813、C3393-T3393 和 C5540-T5540 的堿基突變，均與水牛產奶量顯著相關(P〈0.05);第1386bp處的A1386-G1386的堿基突變則與水牛產奶量極顯著相關(P〈0.01)。
[0011]2.水牛產奶性狀相關基因LPAAT的獲取方法，包括如下步驟:[0012](1)取I頭水牛靜脈血并提取其總DNA。
[0013](2)參考牛 LPAAT 基因(GenBank:AF285100.1)，利用 Primer5.0 引物設計軟件，經Oligo軟件檢測，確定用于擴增水牛LPAAT基因的正方向引物，并委托大連寶生物技術有限公司合成。
[0014](3)將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據產物大小判定結果。
[0015]PCR反應擴增程序為:
[0016]
【權利要求】
1.與水牛產奶性狀相關的SNP標記，其特征在于，所述SNP標記位于水牛LPAAT基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根據權利要求1所述的LPAAT基因，其特征在于:在SEQID NO:1的第886bp、1471bp、2472bp、2813bp、3393bp 和 5540bp 處的 G886-A886、T1471-A1471、A2472-G2472、T2813-C2813、C3393-T3393和C5540-T5540的堿基突變，均與水牛產奶量顯著相關；第1386bp處的A1386-G1386的堿基突變則與水牛產奶量極顯著相關。
3.權利要求1所述水牛產奶性狀相關基因LPAAT基因的獲取方法，其特征在于按照以下步驟: (1)取I頭水牛靜脈血并提取其總DNA； (2)以水牛LPAAT基因序列為模板，利用Primer5.0軟件設計引物，經Oligo軟件檢測，確定用于擴增水牛LPAAT基因的正方向引物，并委托大連寶生物技術有限公司合成； (3)將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據產物大小判定結果；PCR反應擴增程序為:940C /3min ；94°C /lmin, 60°C /30sec, 72°C /lmin, 31 個循環；72°C延伸 /lOmin ； 用1.5%含GoldView瓊脂糖凝膠電泳對5 μ L PCR擴增產物進行檢測，所述電泳條件為電壓5V/cm，時間為20min，在凝膠成像系統中觀察條帶，將剩余的擴增產物委托深圳華大科技有限公司測序； (4)將擴增產物克隆至PMD-18T，挑取陽性克隆委托深圳華大科技有限公司測序，結合生物信息學分析獲取水牛LPAAT基因核苷酸序列。
4.權利要求1所述水牛產奶性狀相關基因LPAAT分子標記的篩選，其特征在于按照以下步驟: (O根據水牛家族系譜和產奶記錄，選取5頭高產水牛，產奶量為305d大于或等于2000kg,以及5頭低產水牛，產奶量為305d小于或等于1000kg，對其靜脈采血并提取總DNA ； (2)根據水牛LPAAT基因序列設計引物，其序列如SEQID NO:17所示，對上述10頭水牛DNA樣品進行PCR擴增，取5 μ L PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余樣品委托深圳華大科技有限公司測序； (3)利用DNAStar7.0Seqman生物信息分析軟件對測序結果進行拼接和比對，獲取候選的SNP位點，其中有18個位點發生突變，即12個位于5’ UTR，而內含子2有3個，內含子5有2個，外顯子4有1個。
5.所述的分子標記在水牛分子標記輔助選擇育種中的應用，其特征在于，包括如下步驟: (1)對393頭水牛進行靜脈采血提取總DNA，對其進行質控，調整DNA終濃度在30-50ng/y L 之間； (2)針對權利要求4所篩選的SNP候選位點，利用SequenomMassARRAY技術對上述水牛DNA樣本進行SNP分型檢測，根據質譜峰圖判讀各樣本位點基因型； (3)利用SAS9.2軟件開展SNP基因分型檢測結果與水牛產奶量的相關性分析。
【文檔編號】C12N15/11GK103898106SQ201410145150
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月11日 優先權日:2014年4月11日
【發明者】鄧廷賢, 梁賢威, 龐春英, 楊炳壯, 陳明棠, 黃健, 譚正準, 李輝 申請人:廣西壯族自治區水牛研究所