一種傳染性法氏囊病毒純化方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種傳染性法氏囊病毒的純化方法，該方法綜合采用了微濾澄清純化法，超濾濃縮純化法，重復洗濾法等一系列工藝，最大限度的增大了IBDV的回收效率，降低了純化成本。以本發(fā)明制備的傳染性法氏囊病毒濃縮液成品尤其適用于制備疫苗，以本發(fā)明制備的傳染性法氏囊病毒濃縮液成品制備的疫苗相對于現(xiàn)有技術(shù)的傳染性法氏囊病毒疫苗而言安全性高，均一性好、免疫效果好。同時，本發(fā)明工藝簡便、成本較低，具有突出的推廣前景。
【專利說明】一種傳染性法氏囊病毒純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種病毒純化方法，尤其涉及一種傳染性法氏囊病毒純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]雞傳染性法氏囊病(Infectiousbursal disease virus, IBD)是由雙 RNA 病毒科中的傳染性法氏囊病病毒引起的一種特殊疾病，損害幼雞法氏囊。特征是患雞腹瀉、衰竭，法氏囊先發(fā)生顯著炎癥和增大，繼之以萎縮，最后患雞死亡，自然條件下，本病只感染雞且所有品種的雞均可感染。本病除造成一些雛雞死亡外，還常引起病愈雞免疫抑制，導致免疫接種失敗，增加雛雞對雞新城疫等許多疾病的易感性。
[0003]疫苗是預防該病的主要方法之一。目前，我國商品化的傳染性法氏囊病毒疫苗主要是全病毒活疫苗，其安全性和有效性主要受病毒滴度，抗原純凈性等因素的影響。商品化疫苗如果直接以細胞繁殖的病毒液進行成品苗的生產(chǎn)，會受到細胞破碎產(chǎn)物，培養(yǎng)基成分，細胞代謝產(chǎn)物等雜質(zhì)的影響，致使疫苗免疫動物后易發(fā)生過敏反應，發(fā)熱反應等副作用。所以，提高病毒滴度和抗原純凈性是提升疫苗質(zhì)量基本途徑。
[0004]中空纖維膜過 濾技術(shù)屬于切向流過濾技術(shù)(Tangential Flow Filtration, TFF)的范疇，又稱錯流過濾(Cross-Flow Filtration, CFF):料液以一定的流速在膜的上表面循環(huán)，小于膜孔徑的物質(zhì)可以透過膜到透過端，而大于膜孔徑的物質(zhì)會被膜截留，從而實現(xiàn)目標物質(zhì)的濃縮以及不同物質(zhì)的分級分離。
[0005]和傳統(tǒng)的平板膜包相比，中空纖維柱具有纖維管狀的開放式流道結(jié)構(gòu)，無篩網(wǎng)的管狀流道結(jié)構(gòu)避免了料液的無規(guī)則劇烈湍流，因此具有更低的剪切力，溫和的操作可以有效防止病毒表面糖蛋白的脫落和蛋白的聚集，有利于保護病毒的完整性，防止病毒顆粒聚集的同時有助于雜蛋白的透過和去除。
[0006]目前，對于傳染性法氏囊病毒(IBDV)的中空纖維澄清純化及濃縮工藝尚無報道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有傳染性法氏囊病毒疫苗副反應率高、均一性差、免疫效果差等技術(shù)問題，提供一種使用微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)實現(xiàn)的傳染性法氏囊病毒純化方法。
[0008]為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0009]一種傳染性法氏囊病毒純化方法，該方法通過微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)來實現(xiàn)，過程如下:
[0010]I系統(tǒng)的組裝
[0011]無菌條件下，將微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)按照組裝要求進行組裝。在微濾澄清純化系統(tǒng)中可安裝無菌0.45 μ m或0.65 μ m、完整無損的中空纖維微濾膜,在超濾濃縮純化系統(tǒng)中可安裝無菌100KD或300KD、完整無損的中空纖維超濾膜。
[0012]2系統(tǒng)完整性檢測[0013]壓力保持法檢測系統(tǒng)的完整性。
[0014]3系統(tǒng)的處理
[0015]3.1清洗及滅菌
[0016]0.5M NaOH溶液注滿系統(tǒng)的進料罐，浸泡處理20min，開啟循環(huán)泵300rpm，進行系統(tǒng)的清洗及滅菌處理30min。
[0017]3.2水洗及通量檢測
[0018]滅囷結(jié)束后，排盡系統(tǒng)內(nèi)的NaOH溶液。將無囷超純水注?兩系統(tǒng)的進料--!，開啟循環(huán)泵，300rpm循環(huán)30min，棄盡系統(tǒng)內(nèi)的液體，如此反復水洗，直至系統(tǒng)內(nèi)PH為7.0左右。
[0019]3.3PBS 處理
[0020]水洗結(jié)束后，棄盡最后一次超純水。將0.1M PBS溶液注滿進料罐，開啟循環(huán)泵300rpm循環(huán)沖洗20min。[0021]上述所述技術(shù)方案中，步驟3.1和3.2中用到的NaOH溶液起到清洗、滅菌作用，也可選用50%~80%的酒精溶液，或采用蒸汽滅菌的方式進行系統(tǒng)滅菌。
[0022]一種傳染性法氏囊病毒純化方法，該方法通過微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)來實現(xiàn)，該方法包括以下步驟:
[0023]I)將無菌的吐溫20按0.5%~10%(v/v)的比例加入傳染性法氏囊病毒(IBDV)病毒液中，振蕩處理；
[0024]2)將步驟I)振蕩處理后的病毒液注入微濾澄清純化系統(tǒng)的進料罐中，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時間后經(jīng)0.45或0.65 μ m中空纖維微濾柱過濾，收集透過液待用；
[0025]3)以l:l(v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，收集透過液，得到第一洗濾液待用；
[0026]4)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟3)處理完畢的進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，收集透過液，得到第二洗濾液待用；
[0027]5)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟4)處理完畢的進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，收集透過液，得到第三洗濾液待用；
[0028]6)將上述透過液、第一洗濾液、第二洗濾液、第三洗濾液混合均勻，得到混合液；
[0029]7)將步驟6)得到的混合液注入超濾濃縮純化系統(tǒng)的進料罐，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，經(jīng)100~300KD中空纖維超濾柱進行過濾處理，棄去透過液，收集進料罐中剩余截留液，即為初級濃縮病毒液；
[0030]8)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的初級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，棄去透過液，收集進料罐中剩余截留液，即為二級濃縮病毒液；
[0031]9)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的二級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時間，棄去洗濾液，收集進料罐中剩余截留液，即為三級濃縮病毒液；
[0032]10)以1:1 (v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的三級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時間，棄去洗濾液，收集進料罐中剩余截留液，即為病毒濃縮液成品。
[0033]將上述制備的病毒濃縮液成品保存于_20°C。
[0034]上述傳染性法氏囊病毒純化方法，采用的是二步純化法，第一步通過較大孔徑的澄清純化濾膜過濾病毒液，除去毒液中的細胞碎片；第二步通過較小孔徑的澄清純化濾膜洗濾第一步的濾過液，達到除去病毒液中的吐溫20、小分子蛋白，細胞代謝產(chǎn)線的小分子物質(zhì)等雜質(zhì)及實現(xiàn)濃縮病毒等目的。
[0035]上述傳染性法氏囊病毒純化方法中，步驟I)所述的震蕩處理時間優(yōu)選為IOmin ；步驟I)所述的比例優(yōu)選為6% ;步驟2)所述的微濾的濾膜孔徑優(yōu)選為0.65 μ m ;步驟7)所述的超濾濾膜孔徑優(yōu)選為300KD ;步驟2、3、4、5、7、8、9、10中所述的開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間的操作條件均優(yōu)選為1500rpm循環(huán)15min ;利用該方法制備的病毒濃縮液成品用于制備疫苗；上述所述病毒澄清純化及濃縮方法，步驟2)中透過液的體積可以根據(jù)需要進行調(diào)整，優(yōu)選為透過液體積達到原液的90% ;步驟7)中的濃縮倍數(shù)可以根據(jù)實際需要進行調(diào)整，優(yōu)選為濃縮10倍以上。
[0036]上述技術(shù)方案中，步驟I)所述的傳染性法氏囊病毒液是指制備得到的病毒原液，未經(jīng)稀釋處理；步驟I)加入吐溫20起到乳化作用，能夠有效避免病毒粒子聚集成團，從而提升后續(xù)過濾效率。
[0037]所述微濾澄清純化系統(tǒng)是指GE公司制造的FlexStand中空纖維澄清純化系統(tǒng)；所述微濾膜可以選用GE公司制造的型號為CFP-6-D-6A或CFP-4-E-6A的Xample微濾柱膜；所述超濾膜可以選自 GE公司制造的型號為UFP-300-C-6A或UFP-100-C-9A的Xample超濾柱膜。
[0038]上述制備的病毒濃縮液成品檢測方法如下:
[0039]對純化濃縮工藝過程中的病毒樣品進行病毒滴度及蛋白濃度檢測，以分析濃縮工藝的有效性。其中病毒滴度的檢測方法為:
[0040]以TCID5tl法對各樣品的病毒滴度進行檢測，純化有效的判定標準為:純化及濃縮步驟的洗濾液檢測不出存活病毒，表明工藝有效；病毒的回收率在80%以上。
[0041]蛋白含量的測定方法為:
[0042]以蛋白濃度測定試劑盒對濃縮病毒液的蛋白殘存量進行測定，可溶性蛋白的殘存量應低于原液可溶性蛋白的10%,表明工藝有效。
[0043]以上對本發(fā)明到的
【發(fā)明內(nèi)容】
進行了詳細說明。本發(fā)明的純化方法綜合采用了病毒粒子洗脫法，二級純化法，重復洗濾法等一系列工藝，最大限度的增大了 PCV2的回收效率，降低了純化成本。以本發(fā)明制備的豬圓環(huán)病毒濃縮液成品尤其適用于制備疫苗，以本發(fā)明制備的傳染性法氏囊病毒濃縮液成品制備的疫苗相對于現(xiàn)有技術(shù)的傳染性法氏囊病毒疫苗而言安全性高,均一性好、免疫效果好。同時,本發(fā)明工藝簡便、成本較低,具有突出的規(guī)模化應用前景。
【具體實施方式】
[0044]實施例所用儀器如下:
[0045]FlexStand中空纖維澄清純化系統(tǒng)；
[0046]Xample 微濾柱:CFP-6-D_9A (0.65 μ m)，CFP-4-E-9A (0.45 μ m)
[0047]Xample 超濾柱:UFP-300-C_9A (300KD)，UFP-100-C-9A (100KD)，
[0048]上述儀器均購自GE公司。
[0049]實施例所用試劑如下:
[0050]100L傳染性法氏囊病毒病毒液，107 0TCID50/ml,由本公司生產(chǎn)；
[0051]0.5M NaOHlOOL ；[0052]無菌0.1M PBS100L ；
[0053]無菌高純水100L ；
[0054]吐溫20，分析純。
[0055]實施例1
[0056]I操作流程
[0057]1.1預處理
[0058]1.1.1系統(tǒng)的組裝
[0059]無菌條件下，將澄清純化系統(tǒng)和濃縮系統(tǒng)按照組裝要求進行組裝。在澄清系統(tǒng)中可安裝無菌0.65 μ m、完整無損的中空纖維微濾膜，在濃縮系統(tǒng)中安裝孔徑為300KD的無菌中空纖維超濾膜；[0060]1.1.2系統(tǒng)完整性檢測
[0061]壓力保持法檢測系統(tǒng)的完整性。
[0062]1.1.3系統(tǒng)的處理
[0063]清洗及滅菌:
[0064]將0.5M NaOH溶液注滿純化系統(tǒng)的進料罐，浸泡處理20min，開啟循環(huán)泵300rpm，進行純化系統(tǒng)的清洗及滅菌處理30min。
[0065]水洗及通量檢測:
[0066]滅囷結(jié)束后，排盡純化系統(tǒng)內(nèi)的NaOH溶液。將無囷超純水注?兩系統(tǒng)的進料iip，開啟循環(huán)泵，300rpm循環(huán)30min，棄盡系統(tǒng)內(nèi)的液體，如此反復水洗，直至系統(tǒng)內(nèi)PH為7.0左右。
[0067]PBS 處理:
[0068]水洗結(jié)束后，棄盡最后一次超純水。將無菌的0.1M PBS溶液注滿進料罐，開啟循環(huán)泵300rpm循環(huán)沖洗20min。
[0069]1.2病毒的澄清純化
[0070]1.2.1病毒液的處理
[0071]將6L無菌的吐溫20加入100L傳染性法氏囊病毒(IBDV)病毒液中，1500rpm振蕩處理15min。
[0072]1.2.2病毒液的澄清
[0073]澄清系統(tǒng)處理完畢后，棄盡系統(tǒng)內(nèi)的PBS溶液，將振蕩處理后的病毒液，注入澄清純化系統(tǒng)的進料罐中，開啟循環(huán)泵，800rpm循環(huán)30min,經(jīng)0.65 μ m中空纖維微濾柱進行過濾純化處理，收集透過液90L，進料罐內(nèi)存留截留液10L。
[0074]1.2.3截留液的洗濾
[0075]第一次洗濾:
[0076]將IOL無菌的0.1M PBS加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵800rpm循環(huán)30min，收集透過液10L，記為洗濾液I。
[0077]第二次洗濾:
[0078]將IOL無菌的0.1M PBS加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵800rpm循環(huán)30min,收集透過液10L，記為洗濾液2。
[0079]第三次洗濾:[0080]將IOL無菌的0.1M PBS加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵800rpm循環(huán)30min,收集透過液10L，記為洗濾液3。
[0081]L 2.4病毒液的收集
[0082]將上述澄清純化過程所收集的透過液及三次洗濾液混合均勻，得到混合液120L。
[0083]1.2.5初級濃縮
[0084]濃縮系統(tǒng)處理完畢后，將混合液注入濃縮系統(tǒng)的進料罐，開啟循環(huán)泵，SOOrpm循環(huán)30min,經(jīng)300KD中空纖維超濾柱進行純化處理,棄去透過液,進料罐中剩余截留液10L,記為初級濃縮病毒液。
[0085]1.2.6濃縮液的洗濾
[0086]第一次洗濾:
[0087]將10L0.1M PBS注入進料罐中的初級濃縮液中，重懸，開啟循環(huán)泵，800rpm循環(huán)30min，棄去透過液10L，進料罐中剩余截留液10L，記為二級濃縮病毒液。
[0088]第二次洗濾:
[0089]將10L0.1M PBS注入進料罐中的二級濃縮液，重懸，開啟循環(huán)泵，800rpm循環(huán)30min，棄去洗濾液10L，進料罐中剩余截留液10L，記為三級濃縮病毒液。
[0090]第三次洗濾:
[0091]將10L0.1M PBS注入進料罐中的三級濃縮液，重懸，開啟循環(huán)泵，800rpm循環(huán)30min，棄去洗濾液10L，進料罐中剩余截留液10L，即為病毒濃縮液成品。
[0092]1.2.7病毒液的收集
[0093]將經(jīng)過上述處理后的得到的病毒濃縮液成品進行收集，保存于-20°C。
[0094]2有效性檢測
[0095]對純化濃縮工藝過程中的病毒樣品進行病毒滴度及蛋白濃度進行檢測，以分析濃縮工藝的有效性。
[0096]2.1病毒滴度的檢測:
[0097]將濃縮后的病毒用細胞維持液做10倍系列稀釋，取10_5、10_6、10_73個稀釋度接種96孔培養(yǎng)板CEF細胞單層，每個稀釋度重復5孔，每孔0.1ml，5%C02、37°C培養(yǎng)120小時，觀察細胞病變(CPE)，計算TCID5tlt5檢測結(jié)果證實，濃縮液每0.1ml病毒含量IO7 tlTCID5ci，濃縮階段的洗濾液無效價，病毒回收率接近100%。
[0098]2.2可溶性蛋白的檢測:
[0099]取各樣品以BCA蛋白濃度試劑盒進打測定，結(jié)果顯不，可溶性蛋白殘存率為9.3%。
[0100]3疫苗制備
[0101]以上述工藝制備的病毒濃縮液作為原料，進一步制備疫苗，其工藝步驟如下:
[0102]3.1 滅活
[0103]將純化濃縮后的IBDV毒液以0.1M PBS進行稀釋，使其病毒滴度達到107_ tlTCID5tl/ml，將純化前的IBDV病毒液(107_°TCID5Q/ml)與純化后的IBDV病毒液(107_°TCID5Q/ml)分別置于滅活罐內(nèi)，加入總體積2%。甲醛溶液，開啟攪拌機攪拌，使其充分混合，37°C滅活16小時(以罐內(nèi)液體溫度達到37°C開始計時)后放2~8°C保存。
[0104]3.2 乳化
[0105]油相制備:取優(yōu)質(zhì)注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，司班-802份，先將白油緩慢加溫，按6%和2%加入司班-80和硬脂酸鋁，邊攪邊加溫，直到硬脂酸鋁充分溶解至透明為止，高壓滅菌備用。
[0106]乳化分別取油相3份放入兩個乳化罐中，開動電機，慢速轉(zhuǎn)動攪拌，同時分別徐徐加入徹底滅活的毒液1份后，再以4000r/min攪拌30分鐘,制備為油包水型疫苗,將純化前的IBDV病毒液制備的IBDV滅活疫苗，記為IBDV滅活疫苗I ;純化后的IBDV病毒液制備的IBDV滅活疫苗，記為IBDV滅活疫苗2。
[0107]4疫苗安全檢驗
[0108]以上述工藝制備的IBDV滅活疫苗1，IBDV滅活疫苗2，無菌0.1M PBS溶液作為實驗材料；取21日齡SPF雞40只，20只各頸背部皮下注射兩組疫苗2羽份，另20只作對照，同條件飼養(yǎng)，觀察15日后撲殺。檢查疫苗接種部位的組織、法氏囊和各臟器均無病例變化。兩組雞均無肉眼可見異常變化。
[0109]5疫苗效力檢驗
[0110]以下方法任擇其一。
[0111]I)血清學方法:取21日齡SPF雞4只，其中20只各肌肉或頸部皮下注射疫苗I羽份，另外20只不免疫作為對照，同條件下隔離飼養(yǎng)。，接種后21日，每只雞分別采血，分離血清，做瓊脂免疫擴散試驗。免疫IBDV滅活疫苗I的10只雞瓊擴效價為1:21，免疫IBDV滅活疫苗2的10只雞瓊擴效價為1:28，對照雞全部陰性。
[0112]2)免疫攻毒法:取21日齡SPF雞40只，其中20只各肌肉或頸部皮下注射疫苗I羽份，另外20只不免疫作為對照，同條件下隔離飼養(yǎng)。接種21日后，所有免疫雞和對照雞，每只點眼途徑接種10倍稀釋的雞傳染性法氏囊病毒BJQ902株毒液0.1ml0攻毒后，每天觀察雞只的臨床表現(xiàn)，記錄發(fā)病和死亡雞數(shù)，至96小時，撲殺存活雞，逐只剖解，觀察法氏囊等病變。免疫雞20只全部正常，不出現(xiàn)法氏囊病變；對照雞10只全發(fā)病，出現(xiàn)明顯的法氏囊病變(如胸肌或腿肌條狀出血、法氏囊腫大或萎縮、發(fā)黃、內(nèi)有膠凍樣分泌物等一種以上病變)。
[0113]綜上所述，利用本發(fā)明純化得到的傳染性法氏囊病毒濃縮純化液成品適用于制備傳染性法氏囊病毒疫苗；利用本發(fā)明純化得到的傳染性法氏囊病毒濃縮純化液成品制備傳染性法氏囊病毒疫苗，其安全性良好同時免疫效力顯著。
[0114]實施例2
[0115]I)將無菌吐溫20按10%(v/v)的比例加入傳染性法氏囊病毒(IBDV)病毒液中，振蕩處理；
[0116]2)將步驟I)振蕩處理后的病毒液注入微濾澄清純化系統(tǒng)的進料罐中，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時間后經(jīng)0.45 μ m中空纖維微濾柱過濾處理，收集透過液待用；
[0117]3)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，收集透過液，得到第一洗濾液，4~10°C保存待用；
[0118]4)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，收集透過液，得到第二洗濾液，4~10°C保存待用；
[0119] 5)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，收集透過液，得到第三洗濾液，4~10°C保存待用。
[0120]6)將上述透過液、第一洗濾液、第二洗濾液、第三洗濾液混合均勻，得到混合液；[0121]7)將步驟6)得到的混合液注入超濾濃縮純化系統(tǒng)的進料罐，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，經(jīng)100KD中空纖維超濾柱進行過濾處理，棄去透過液，收集進料罐中剩余截留液，即為初級濃縮病毒液；
[0122]8)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS注入進料罐中的初級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，棄去透過液，收集進料罐中剩余截留液，即為二級濃縮病毒液；
[0123]9)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS注入進料罐中的二級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時間，棄去洗濾液，收集進料罐中剩余截留液，即為三級濃縮病毒液；
[0124]10)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS注入進料罐中的三級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時間，棄去洗濾液，收集進料罐中剩余截留液，即為病毒濃縮液成品O
[0125]實施例3
[0126]1)將無菌吐溫20按0.5%(v/v)的比例加入傳染性法氏囊病毒(IBDV)病毒液中，1500rpm 振蕩處理 2 0min ；
[0127]2)將步驟I)振蕩處理后的病毒液注入微濾澄清純化系統(tǒng)的進料罐中，開啟循環(huán)泵以800rpm的條件循環(huán)30min,而后經(jīng)0.65 μ m中空纖維微濾柱微濾,收集透過液待用；
[0128]3)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵以SOOrpm的條件循環(huán)30min，收集透過液，得到第一洗濾液，4~10°C保存待用；
[0129]4)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵以800rpm的條件循環(huán)30min,收集透過液,得到第二洗濾液待用，4~10°C保存；
[0130]5)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵以SOOrpm的條件循環(huán)30min，收集透過液，得到第三洗濾液待用。
[0131]6)將上述透過液、第一洗濾液、第二洗濾液、第三洗濾液混合均勻，得到混合液；
[0132]7)將步驟6)得到的混合液注入超濾濃縮系統(tǒng)的進料罐，開啟循環(huán)泵以SOOrpm的條件循環(huán)30min,經(jīng)100KD中空纖維超濾柱進行超濾處理,棄去透過液,收集進料罐中剩余截留液，即為初級濃縮病毒液；
[0133]8)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS注入進料罐中的初級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵以800rpm的條件循環(huán)30min,棄去透過液,收集進料罐中剩余截留液，即為二級濃縮病毒液；
[0134]9)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS注入進料罐中的二級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵以800rpm的條件循環(huán)30min,棄去洗濾液,收集進料罐中剩余截留液，即為三級濃縮病毒液；
[0135]10)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS注入進料罐中的三級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵以800rpm的條件循環(huán)30min,棄去洗濾液,收集進料罐中剩余截留液，即為病毒濃縮液成品。
[0136]以上對本發(fā)明實施例進行了詳細說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明 。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種傳染性法氏囊病毒純化方法，其特征在于使用微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)，并包括以下步驟: 1)將無菌的吐溫20按0.5%~10%(v/v)的比例加入傳染性法氏囊病毒(IBDV)病毒液中，振蕩處理； 2)將步驟I)振蕩 處理后的病毒液注入微濾澄清純化系統(tǒng)的進料罐中，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時間后經(jīng)0.45或0.65 μ m中空纖維微濾柱過濾,收集透過液待用； 3)以l:l(v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，收集透過液，得到第一洗濾液待用； 4)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟3)處理完畢的進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，收集透過液，得到第二洗濾液待用； 5)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟4)處理完畢的進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，收集透過液，得到第三洗濾液待用； 6)將上述透過液、第一洗濾液、第二洗濾液、第三洗濾液混合均勻，得到混合液； 7)將步驟6)得到的混合液注入超濾濃縮純化系統(tǒng)的進料罐，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，經(jīng)100KD或300KD中空纖維超濾柱進行過濾處理，棄去透過液，收集進料罐中剩余截留液，即為初級濃縮病毒液； 8)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的初級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，棄去透過液，收集進料罐中剩余截留液，即為二級濃縮病毒液； 9)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的二級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時間，棄去洗濾液，收集進料罐中剩余截留液，即為三級濃縮病毒液； 10)以1:1 (v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的三級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時間，棄去洗濾液，收集進料罐中剩余截留液，即為病毒濃縮液成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種傳染性法氏囊病毒純化方法，其特征在于步驟I)所述的震蕩處理時間為IOmin。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種傳染性法氏囊病毒純化方法，其特征在于其特征在于步驟I)所述的比例為6%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種傳染性法氏囊病毒純化方法，其特征在于步驟2)所述的微濾的濾膜孔徑為0.45或0.65 μ m,較優(yōu)的為0.65 μ m。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種傳染性法氏囊病毒純化方法，其特征在于步驟7)所述的超濾濾膜孔徑為300KD。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種傳染性法氏囊病毒純化方法，其特征在于步驟2、3、4、5、7、8、9、10中所述的開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間的操作條件均為1500rpm循環(huán)15min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6所述的一種傳染性法氏囊病毒純化方法，其特征在于利用該方法制備的病毒濃縮液成品用于制備疫苗。
【文檔編號】C12N7/02GK103937755SQ201410145471
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】吳全忠, 米娜, 李倬, 丁旭娜, 呂茂杰, 楊保收, 梁武, 李守軍 申請人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司