H9n2亞型禽流感病毒毒株及其滅活疫苗和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株H9N2亞型禽流感病毒株及其滅活疫苗和應用，屬于禽流感病毒毒株的分離和應用領域。本發明從疑似H9N2禽流感發病雞群中分離得到一株低致病性的H9N2亞型禽流感病毒J/ZY毒株，其微生物保藏編號為：CGMCC?No.8853。本發明還公開了一種H9N2亞型禽流感滅活疫苗的制備方法，包括：培養病毒，獲得病毒液上清；加入滅活劑，將病毒液上清滅活；混勻佐劑和病毒液上清，乳化，即得。免疫保護試驗證明，本發明所分離的H9N2亞型禽流感病毒J/ZY株作為疫苗株具有良好的免疫原性，免疫動物以后能產生較高的抗體水平。
【專利說明】H9N2亞型禽流感病毒毒株及其滅活疫苗和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及禽流感病毒株，尤其涉及一株分離的H9N2亞型禽流感病毒(AvainInfluenza Virus) J/ZY毒株及用該毒株制備的預防H9N2亞型禽流感病毒的滅活疫苗，屬于禽流感病毒毒株的分離和應用領域。
【背景技術】
[0002]禽流行性感冒(簡稱禽流感，Avain Influenza, Al)是由A型流感病毒引起的一種禽類(包括家禽和野禽)的感染和/或疾病綜合征，主要引起禽類的全身性或呼吸系統性疾病，被世界動物衛生組織確立為A類傳染病。根據禽流感致病性的不同，可以將禽流感分為高致病性禽流感、低致病性禽流感和無致病性禽流感。
[0003]H9N2亞型禽流感屬于低致病性禽流感，發病率高，但死亡率低。雖然該H9N2亞型禽流感病毒(AlV)對禽群呈低致病力，主要臨床表現僅為輕度呼吸道癥狀，但由于易與其他致病微生物發生協同 作用，造成繼發感染，從而引起了禽群的高發病率和致死率，對各國養禽業的危害也很大。更重要的是，該亞型AIV可以穿越宿主障礙感染哺乳動物包括人，也有機會在人類大流傳，給人類健康帶來了嚴重的威脅。
[0004]預防禽流感發生與傳播的最有效手段是疫苗接種。目前，市售的禽流感疫苗絕大多數為雞胚組織苗，相對于細胞苗而言，其具有成本高、產品質量批間差異大、且容易產生雞源性潛在疾病的感染等缺點。
【發明內容】
[0005]本發明的目的之一是提供一株分離的H9N2亞型禽流感病毒J/ZY毒株；
[0006]本發明的目的之二是將所分離的H9N2亞型禽流感病毒J/ZY毒株應用于預防H9N2亞型禽流感。
[0007]本發明的目的之三是提供一種制備預防H9N2亞型禽流感病毒的滅活疫苗的方法。
[0008]本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的:
[0009]本發明從中國吉林省某養雞地區的疑似H9N2禽流感發病雞群中分離得到一株低致病性的H9N2亞型禽流感病毒J/ZY毒株，本發明將分離的毒株提交專利認可的機構進行保藏，其微生物保藏編號為:CGMCC N0.8853 ;分類命名為:禽流感病毒。保藏單位:中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間是2014年3月7日:保藏地址:中國北京朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0010]本發明從中國吉林省某養雞地區的疑似H9N2禽流感發病雞群中，無菌采取具有典型臨床癥狀病雞的肺臟和肝臟等組織剪碎，按1:5 (W/V)比例加入滅菌生理鹽水后，研缽研磨后，-400C /室溫凍融3次，3000r/min離心15min，取上清液。將上述病料上清液通過
0.22 μ m微孔濾器除菌，尿囊腔接種10日齡非免疫雞胚。每份病料接種8枚雞胚，每枚雞胚接種0.2mL,同時作不接種對照，37°C孵育。棄去24h內死胚，無菌收集48h的雞胚尿囊液，_40°C保存備用病毒分離后需要在SPF雞胚上進行3次終點有限稀釋克隆純化，即每一次均取最高稀釋度有血凝價雞胚尿囊液作為下一次傳代純化的種毒。如此經三次純化后，以10_3稀釋度接種9-11日齡SPF胚，48h后收取雞胚尿囊液，經菌檢證明無污染后，分裝于小管中作為種毒貯存于_70°C。本發明將分離的H9N2亞型禽流感病毒毒株采用RT-PCR鑒定，擴增得到753bp的目的基因片段，與預期結果相符。對分離的病毒所做分型鑒定結果為所分離的毒株為H9N2亞型禽流感病毒，命名為A/Chicken/Jilin/J/ZY (縮寫為J/ZY)。
[0011]本發明通過雞胚半數感染量(EID50)、半數組織感染量(TCID50)和靜脈接種指數(IVPI)試驗檢測分離的病毒J/ZY株的致病性，試驗中對細胞毒和胚毒進行了同步試驗，以比較不同培養方式繁殖的病毒液在毒力方面的差異。測定結果顯示，細胞毒、胚毒EID50/0.1ml分別為IO6-9UO6 3 ;細胞毒、胚毒TCID50/0.1ml分別為IO6 5UO6-1 ;細胞毒、胚毒IVPI分別為0.8,0.9 ;細胞毒、胚毒HA分別為21(1、29。以上結果顯示本發明所分離的病毒J/ZY株為低致病性禽流感病毒。
[0012]本發明將經MDCK細胞和SPF雞胚擴增的兩種病毒液分別制備成油乳劑滅活苗進行免疫保護試驗，結果顯示，用分離的病毒J/ZY株油乳劑滅活疫苗免疫SPF雞，在免疫后I周雞群就可檢測到低水平的HI抗體，免疫后2周免疫組所有雞群都產生明顯的抗體，平均HI抗體水平達61og2，免疫后3周各試驗組的HI抗體水平達到高峰，平均效價達71og2以上；實驗結果表明本發明所分離的H9N2亞型禽流感病毒J/ZY株作為疫苗株具有良好的免疫原性，免疫動物以后能產生較高的抗體水平。并且從抗體檢測結果可以看出，在各個時間點細胞毒制備疫苗免疫組的抗體水平均要比胚毒制備疫苗免疫組高，抗體水平上升也較快。
[0013]因此，本發明提供一種防治禽流感的疫苗組合物，包括:預防或治療上有效量的所分離的H9N2亞型禽流感病毒J/ZY毒株以及藥學上可接受的佐劑。
[0014]將本發明所分離的H9N2亞型禽流感病毒J/ZY毒株分別經MDCK細胞和SPF雞胚擴增，收集兩種病毒液分別制備成油乳劑滅活苗，即獲得禽流感細胞毒滅活疫苗和禽流感胚毒滅活疫苗。
[0015]本發明進一步提供了一種制備禽流感疫苗的方法，該方法包括以下步驟
[0016](I)培養所分離的H9N2亞型禽流感病毒J/ZY毒株，得到病毒液，離心取上清；
[0017](2)向病毒液上清中加入滅活劑，將病毒液上清滅活；
[0018](3)滅活后的病毒液上清與佐劑混合均勻，乳化，即得。
[0019]步驟(1)中將H9N2亞型禽流感病毒J/ZY毒株接種病毒宿主細胞或SPF雞胚得到擴增的病毒液；其中，所述的病毒宿主細胞優選為MDCK細胞。
[0020]步驟(1)中將收集的病毒液5000r/min離心30min,取上清。
[0021]步驟(2)中向病毒液上清中加入的滅活劑是福爾馬林，加入福爾馬林至其終濃度為病毒液上清總量的0.1%，于37°C滅活48小時。
[0022]步驟(3)中，所述的佐劑為油佐劑，其中，按體積比計，按體積比計，滅活后的病毒液上清和油佐劑的比例優選為1:1.5。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1為本發明所分離的H9N2亞型禽流感病毒J/ZY毒株HA基因的RT-PCR擴增結果；M:DNA Marker ；1:分離的病毒的雞胚尿囊液；2:空白對照。
【具體實施方式】
[0024]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但是應理解所述實施例僅是范例性的，不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發明的保護范圍。
[0025]實施例1H9N2亞型禽流感病毒J/ZY毒株的分離及鑒定
[0026]1、實驗方法
[0027]1.1病毒的分離
[0028]2010年從中國吉林省某養雞地區的疑似H9N2禽流感發病雞群中，無菌采取具有典型臨床癥狀病雞的肺臟和肝臟等組織剪碎，按1:5 (W/V)比例加入滅菌生理鹽水后，研缽研磨后，-400C /室溫凍融3次，3000r/min離心15min,取上清液備用。
[0029]將上述病料上清液通過0.22 μ m微孔濾器除菌，尿囊腔接種10日齡非免疫雞胚。每份病料接種8枚雞胚，每枚雞胚接種0.2mL,同時作不接種對照，37°C孵育。棄去24h內死胚，無菌收集48h的雞胚尿囊液，_40°C保存備用。
[0030]病毒分離后需要在SPF雞胚上進行3次終點有限稀釋克隆純化，即每一次均取最高稀釋度有血凝價雞胚尿囊液作為下一次傳代純化的種毒。如此經三次純化后，以10_3稀釋度接種9-11日齡SPF胚，48h后收取雞胚尿囊液，經菌檢證明無污染后，分裝于小管中作為種毒貯存于_70°C。
[0031]1.2所分離的病毒株的血清學鑒定
[0032]將無菌收集的雞胚尿囊液以1.0%雞紅細胞懸液采用β微量法進行HA試驗，以HA價> 31og2為試驗陽性。對有直接血凝性的樣本進行H9亞型AIV HI (血凝抑制試驗)與NI (神經氨酸酶抑制試驗)。
[0033]1.3所分離的病毒株的RT-PCR鑒定
[0034]根據GenBank已發表的H9N2毒株的HA基因序列，用Primer5.0軟件設計一對H9N2HA基因的特異性引物，用于HA基因部分序列的擴增。預期擴增產物片段長度為753bp。引物序列如下:上游引物(18bp):5' -AATGGTCCTACATCGTCG-3';下游引物(18bp):5' -TGGCTCCAAATAGTCCTC-3'，以上引物由上海生物工程有限公司合成。用H9N2AIV HA基因的特異性引物對分離病毒的雞胚尿囊液進行RT-PCR擴增，另設空白對照。
[0035]2、實驗結果
[0036]2.1病毒株的分離
[0037]病料經過4代雞胚培養后，HA血凝價逐漸穩定，雞胚死亡數開始增長，胚體病變逐漸明顯。病毒經適當稀釋后，接種SPF雞胚尿囊腔，收集接種后48h雞胚的尿囊液，經菌檢證明無污染后，分裝于小管中作為種毒貯存于_70°C。
[0038]2.2病毒株的血清學鑒定
[0039] 取病毒分離為陽性的尿囊液，用ND、IB、IBD及EDS-76抗血清進行HI試驗，不產生抑制現象，表明分離株并非上述病毒株，結果只能被H9AIV陽性血清所抑制。神經氨酸酶抑制試驗檢測，該病毒只能被N2亞型陽性血清特異性抑制，因此，鑒定結果為H9N2亞型禽流感病毒，并命名為A/Chicken/Jilin/J/ZY (縮寫為J/ZY)。
[0040]2.3病毒株的RT-PCR鑒定
[0041]用H9N2AIV HA基因的特異性引物對分離的病毒的雞胚尿囊液進行RT-PCR擴增，得到753bp的目的基因片段(圖1)，與預期結果相符。
[0042]對分離的病毒所做分型鑒定結果為H9N2亞型禽流感病毒，命名為A/Chicken/Ji I in/J/ZY (縮寫為 J/ZY)。
[0043]實驗例I分離的H9N2亞型禽流感病毒J/ZY株的致病性測定
[0044]1、實驗方法
[0045]1.1病毒J/ZY株在MDCK細胞中的增殖
[0046]將純化的組織毒用滅菌生理鹽水稀釋后，接種90%長成單層后的MDCK細胞，37°C培養48~72h，細胞病變達75%以上，放入_70°C中反復凍融3次，收獲病毒液。傳代10次，直至病毒在MDCK細胞增殖良好。
[0047]1.2 病毒 EID5tl 測定
[0048]將分離的病毒用滅菌生理鹽水作10倍梯度稀釋，設置KT1~10_99個稀釋梯度，并設立空白對照組， 每個稀釋度接種5枚10日齡非免疫雞胚，棄24h死亡胚，于接種后72h4°C過夜凍死雞胚，收獲雞胚尿囊液，測定其HA效價，并參考Reed-Muench方法計算出病毒EID50。
[0049]根據EID5tl結果，將病毒J/ZY株以I X IO7EID50劑量接種SPF雞胚(0.1ml/胚)，35°C溫箱孵育，詳細記錄雞胚死亡情況，以評定分離的病毒J/ZY株對雞胚的致病性。
[0050]1.3 病毒 TCID5tl 測定
[0051 ] 將狀態良好的MDCK細胞以2~3 X IO5個/孔接種96孔細胞培養板，置37°C，6%C02培養箱培養12~24h。棄去培養基，用無菌PBS洗滌已培養成單層的MDCK細胞3遍，以去除培養基中的血清成分，避免血清對病毒吸附的影響。
[0052]用超純水配制的無菌PBS(pH7.2)將J/ZY株病毒液進行10倍梯度稀釋，設置IO-3~10,8個稀釋梯度。將每個稀釋度的病毒接種于MDCK細胞，每個稀釋度接種8孔，100 μ L/孔，37°C吸附Ih左右。棄去吸附液，用滅菌PBS洗滌MDCK細胞一遍，加入含終濃度2 μ g/ml的TPCK-trypsin的細胞維持液(含2萬單位雙抗的無血清DMEM培養基)，置350C，6%C02培養箱培養，每隔12h觀察I次。待到細胞病變(CPE)和HA效價不再發生變化時，用 Reed-Muench 公式計算 TCID5tl。
[0053]1.4靜脈接種致病指數(IVPI)的測定
[0054]取6周齡非免疫雞8只，按中華人民共和國獸用生物制品質量標準的方法測定IVP1引起禽流感的A型流感病毒對6周齡雞的靜脈致病指數(IVPI)大于1.2或感染的A型流感病毒H5或H7亞型的核苷酸序列在血凝素的裂解位點上有多個堿性氨基酸，即確定為高致病性禽流感病毒。
[0055]2、實驗結果
[0056]根據EID5tl結果，將病毒J/ZY株以I X IO7EID5tl劑量接種10只10日齡SPF雞胚(0.1ml/胚)后，24h內無雞胚死亡。在36~96h孵育期間致死4枚雞胚,死亡率為40%。病毒J/ZY株的HA、EID5(1、TCID5(I和IVPI測定結果見表1。測定結果顯示本發明所分離的病毒J/ZY株為低致病性禽流感病毒。[0057]表1分離的病毒J/ZY株致病性測定
[0058]
【權利要求】
1.一株H9N2亞型禽流感病毒(Avain Influenza Virus) J/ZY毒株，其特征在于，其微生物保藏編號為:CGMCC N0.8853。
2.權利要求1所述的H9N2亞型禽流感病毒J/ZY毒株在制備預防禽流感疫苗中的用途。
3.一種預防禽流感的疫苗組合物，其特征在于，包括:預防上有效量的權利要求1所述的H9N2亞型禽流感病毒J/ZY毒株和藥學上可接受的佐劑。
4.一種制備H9N2亞型禽流感滅活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)培養權利要求1所述的H9N2亞型禽流感病毒J/ZY毒株，得到病毒液，離心取上清； (2)向病毒液上清中加入滅活劑,將病毒液上清滅活； (3)滅活后的病毒液上清與佐劑混合均勻，乳化，即得。
5.按照權利要求4所述的方法，其特征在于:步驟(1)中將權利要求1所述的H9N2亞型禽流感病毒J/ZY毒株接種病毒宿主細胞或SPF雞胚得到擴增的病毒液。
6.按照權利要求4所述的方法，其特征在于:步驟(2)中向病毒液上清中加入的滅活劑是福爾馬林。
7.按照權利要求4所述的方法，其特征在于:步驟(2)中向病毒液上清中加入福爾馬林至其終濃度為病毒液上清總量的0.1%。
8.按照權利要求4所述的方法，其特征在于:步驟(2)中所述的滅活時間為48小時。
9.按照權利要求4所述的方法，其特征在于:按體積比計，步驟(3)中滅活后的病毒液上清和油佐劑的比例為1:1.5。
10.由權利要求4~ 9任一項方法制備得到的預防H9N2亞型禽流感病毒的滅活疫苗。
【文檔編號】C12N7/00GK103937753SQ201410150556
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月14日 優先權日:2014年4月14日
【發明者】何玉友, 馮建民, 李彥偉, 吳艷麗, 張闖, 田麗華, 王石, 王國輝, 劉斌, 楊鍵, 李長艷, 廉維, 楊澤彬, 柳志光, 馮會, 白楊 申請人:吉林正業生物制品股份有限公司