一株產高產苯丙氨酸的菌株及其生產苯丙氨酸的方法
【專利摘要】本發明涉及一株產L-苯丙氨酸菌株，其分類命名為大腸桿菌WR1001（EscherichiacoliWR1001），已于2013年7月7日保存于中國典型培養物保藏中心保藏,保藏編號：CCTCCNO:M2013319。本發明還提供該菌株的誘變篩選方法及利用該菌株生產L-苯丙氨酸的方法。該菌株通過發酵產L-苯丙氨酸高達15g/L，并且通過8次傳代后，含量無顯著差別，遺傳穩定性較好。
【專利說明】一株產高產苯丙氨酸的菌株及其生產苯丙氨酸的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，特別涉及一株生產L-苯丙氨酸的菌株和利用該菌株生產L-苯丙氨酸的方法。
【背景技術】
[0002]L-苯丙氨酸(L-Phe)是人體內必需的但無法自行合成的八種必需氨基酸之一，其在自然界中普遍存在，卻含量較少。L-苯丙氨酸在醫療藥品、化妝品、食品及其添加劑領域得到了廣泛的應用。尤其是，在甜味劑阿斯巴甜的應用日益廣泛，而作為合成甜味劑阿斯巴甜的原料之一的L-苯丙氨酸的市場需求迅速擴大。目前，L-苯丙氨酸的生產方法一般有天然蛋白質水解法、發酵法、酶法、化學合成法。水解法提取的L-苯丙氨酸含量較低、加工處理復雜、分離提純較困難，生產成本高；化學合成法生產L-苯丙氨酸路線冗長，產品大多是消旋體，分離純化較繁瑣，污染較大；酶法具有產物濃度高、純化步驟少、產能力強等優點，但不足之處是原 料成本高；發酵法因原料易得且便宜，可以大規模生產，被認為是最經濟的方法，被人們廣泛使用。
[0003]微生物大多數具有合成自身所需氨基酸的能力，通過對菌種進行NTG、紫外和離子束等誘變，可以篩選出多種營養缺陷型或抗反饋抑制菌株，從而切斷代謝調控中的不必要途徑和反饋抑制。L-酪氨酸和L-色氨酸是L-苯丙氨酸代謝支路的主要副產物，對目標產物L-苯丙氨酸合成存在底物競爭性抑制作用。為了解除這種抑制作用，提高L-苯丙氨酸合成效率，Maiti和Chatterjee以谷氨酸生產菌AriAroAacier globiformis為出發菌株，通過NTG誘變獲得L-酪氨酸和L-色氨酸的雙重營養缺陷型菌株TT-39，該菌株以葡萄糖為底物可產生L-苯丙氨酸2.6 g/L。由于細菌中L-色氨酸合成量本身就很少，所以目前L-苯丙氨酸生產菌株大多為L-酪氨酸營養缺陷型菌株。例如，中國專利CN 102212569 A公開了一種利用L-酪氨酸營養缺陷型的大腸桿菌生產L-苯丙氨酸的方法。

【發明內容】

[0004]本發明的第一目的是提供一株簡單、高效、安全生產L-苯丙氨酸的菌株。
[0005]本發明的第二目的是提供一種上述菌株的獲取方法。
[0006]本發明第三目的是提供一種利用上述菌株生產L-苯丙氨酸的方法。
[0007]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案如下:
一、一株產L-苯丙氨酸的菌株，其特征在于，其分類命名為大腸桿菌WR1001{Escherichia co7iWR1001)已于2013年7月7日保存于中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號:CCTCC NO: M 2013319。
[0008]本發明菌株的形態學及生理生化特征如下:
菌落顏色:乳白色偏黃。
[0009]菌體形態:圓形菌落，有金屬光澤。
[0010]革蘭氏染色:陰性。[0011 ]菌落大小:0.2-0.8 X 1-4 μ m。
[0012]需氧方式:好氧生長。
[0013]適宜生長溫度:35-40 °C。
[0014]適宜生長pH: 6.5-7.5。
[0015]二、上述大腸桿菌WR1001的獲取方法，是以萬.W3110為出發菌株，通過紫外-氯化鋰誘變，離子束注入誘變，初、復篩選得到。
[0016]所述的大腸桿菌WR1001的獲取方法，具體包括如下步驟:
(1)菌懸液制備
E.coli W3110與添加氯化鋰的無菌水混合制成菌懸液，細菌濃度為IO6個/mL ；
(2)紫外-氯化鋰復合誘變
將步驟(1)的菌懸液轉入含有磁力轉子的無菌空平板中，在100-150 rpm攪拌速度下，進行紫外照射誘變，后取菌懸液涂布于添加氯化鋰的完全培養基中，37 1:下避光倒置培養I d得到的菌株分別點印于基本培養基、篩選培養基中，培養Id后，挑選僅篩選培養基中生長良好而在基本培養基中不生長的菌株，其菌落形態為圓形邊緣整齊，表面光滑，半透明，小凸起；
(3)低能離子注入誘變
將步驟(2)中培養后的菌株用無菌水洗滌，菌懸液涂布于無菌空平皿上，制成單層菌液，吹干后，注入氮離子，后洗脫、涂布到完全培養基上。37 1:下避光倒置培養I d得到的菌株分別點印于篩選培養基中，培養Id后，挑選生長良好的菌株，其菌落形態為圓形邊緣整齊，表面光滑，半透明，小凸起；
(4)初篩
將步驟(3)培養得到的單菌落在LB斜面培養基上培養16 h，活化的菌株在種子培養基攪拌培養8-12 h后按一定接種量轉入發酵培養基中，發酵48 h后檢測發酵液中L-苯丙氨酸含量，初篩出L-苯丙氨酸含量大于5 g/L的菌落；
(5)復篩
將步驟(4)初篩得到的單菌落接種經斜面活化、種子培養后，按一定接種量分別接種至5L發酵罐中，初始發酵液體積為1.5 L，攪拌發酵72 h ;檢測發酵液中L-苯丙氨酸含量，篩選出L-苯丙氨酸產量高的菌落；
重復步驟(1)至步驟(5)，最終篩選出發酵液中L-苯丙氨酸含量穩定在15g/L的目標菌株萬.coli WR 1001。
[0017]上述大腸桿菌WR1001的獲取方法中，所述步驟(1)中氯化鋰的添加量為無菌水質量的3-5%。
[0018]所述步驟(2)中完全培養基平板中氯化鋰質量濃度為3-5% ;紫外誘變條件為15W，30cm;培養皿中的菌懸液在紫外燈下關蓋照射30-60 S，再開蓋照射30-60 S。
[0019]所述步驟(3)中，菌液吹干后，在能量IOkeV,劑量為3X 1015、6X 1015、9X 1015、12X1015ions/cm2條件下進行氮離子注入實驗。
[0020]所述步驟(4)中，種子培養的條件是溫度37°C、攪拌速度200 rpm、接種量是5%-10% (v/v)0
[0021] 所述步驟(5)中，發酵培養條件溫度37°C、攪拌速度200-800 rpm、接種量是5%-10% (v/v)、通氣量 1-3 vvm、溶氧 10% 以上。
[0022]本發明中所述完全培養基組成為葡萄糖2 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl5g/L，ρΗ7.0,固體培養基加瓊脂15 g/L ；
所述基本培養基組成為葡萄糖20 g/L、檸檬酸鈉5 g/L、K2HPO4 7 g/L、KH2PO4 7 g/L、MgSO4 0.1 g/L、(NH4)2SO4 2 g/L, pH 7.0，固體培養基加瓊脂 15 g/L ；
所述篩選培養基為在基本培養基中添加40 μ g/mL酪氨酸；
所述LB斜面培養基/種子培養基為蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L,NaCl 5g/L, pH7.0,固體培養基加瓊脂15 g/L ；
所述發酵培養基為葡萄糖 25 g/L、(NH4)2SO4 5 g/L、KH2PO4 3 g/L、MgSO4 3 g/L、NaCllg/L、檸檬酸鈉 1.5 g/L, CaCl2.2H20 0.015 g/L、FeSO4.7H20 0.1125g/L、L_Tyr 0.3g/L、蛋白胨 5 g/L、酵母粉 5 g/L、維生素 B1 0.075 g/L,TES 1.5mL/L，其中 TES 含有:Al2 (SO4)
3.18Η20 2 g/L、CoSO4.7H20 0.75 g/L、CuSO4.5H20 0.25 g/L, H3BO3 0.5 g/L、MnSO4.7H2024 g/L、Na2MoO4.2Η20 3 g/L、NiSO4.6H20 2.5 g/L、ZnSO4.7H20 15 g/L。當葡萄糖耗完后，補加700g/ L的葡萄糖；當發酵22h后，以0.06 g/h的速度流加10 g/L的L-酪氨酸。發酵過程中用氨水和2mol/L鹽酸控制發酵液pH。
[0023]三、一種利用大腸桿菌WR1001生產L-苯丙氨酸的方法，包括如下步驟:
(1)斜面培養
將實施例1獲取的大腸桿菌WR1001接種到LB斜面培養基中，在37°C下培養I d。
[0024](2)種子培養
按接種量5%-10%(v/v)，將大腸桿菌WR1001接種于種子培養基中，37°C、200 rpm培養
12h。
[0025](3)發酵培養
將步驟(2)培養后的種子液接入發酵培養基，培養條件如下:溫度37°C、攪拌速度200_800rpm、接種量是5-10% (v/v)、通氣量l_3vvm、溶氧10%以上。
[0026]在利用大腸桿菌WR1001生產L-苯丙氨酸中，所述步驟(1)、(2)和(3)的培養基成分同上述獲得大腸桿菌WR1001方法中所用的LB斜面培養基、種子培養基和發酵培養基。
[0027]本發明有益效果:
本發明采用將低能氮離子注入和紫外-氯化鋰復合誘變相結合，最終篩選獲得一株生產L-苯丙氨酸的大腸桿菌WR1001，利用該菌株生產L-苯丙氨酸，發酵液中L-苯丙氨酸含量為15 g/L左右，大幅度提高了發酵產物中L-苯丙氨酸含量，同時，該菌株連續傳代8次后，無顯著變化，遺傳穩定性好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為大腸桿菌WR1001篩選流程。
[0029]本發明所述的生物材料，其分類命名為大腸桿菌WR1001 {EscherichiacolimiOOl),已于2013年7月7日保存于中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC，地址是:中國.武漢.武漢大學)保藏，保藏編號=CCTCC NO: M 2013319。
【具體實施方式】[0030]下面列舉實施例對本發明進行進一步說明，但并不因此限制本發明的內容。
[0031]實施例1本實施例說明將疋W3110作為出發菌誘變篩選大腸桿菌疋coliWR 1001的方法。
[0032]本實施例中:
1)完全培養基組成為:葡萄糖2g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 5g/L，pH7.0，固體培養基加瓊脂15 g/L ；
2)基本培養基組成為:葡萄糖20g/L、檸檬酸鈉5 g/L、K2HPO4 7 g/L、KH2PO4 7 g/L、MgSO4 0.1 g/L、(NH4)2SO4 2 g/L, pH 7.0，固體培養基加瓊脂 15 g/L ；
3)篩選培養基為:在基本培養基中添加40μ g/mL酪氨酸；
4)LB斜面培養基/種子培養基為:蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 5g/L，ρΗ7.0，固體培養基加瓊脂15 g/L ；
5)發酵培養基為:葡萄糖25 g/L、(NH4)2SO4 5 g/L、KH2PO4 3 g/L、MgSO4 3 g/L、NaCllg/L、檸檬酸鈉 1.5 g/L, CaCl2.2H20 0.015 g/L、FeSO4.7H20 0.1125g/L、L_Tyr 0.3g/L、蛋白胨 5 g/L、酵母粉 5 g/L、維生素 B1 0.075 g/L,TES 1.5mL/L，其中 TES 含有:Al2 (SO4)3.18Η20 2 g/L、CoSO4.7H20 0.75 g/L、CuSO4.5H20 0.25 g/L, H3BO3 0.5 g/L、MnSO4.7H2024 g/L、Na2MoO4.2Η20 3 g/L、NiSO4.6H20 2.5 g/L、ZnSO4.7H20 15 g/L。當葡萄糖耗完后，補加700g/L的葡萄糖；當發酵22h后，以0.06 g/h的速度流加10 g/L的L-酪氨酸。發酵過程中用氨水和2mol/L鹽酸控制發酵液pH。
[0033]以大腸桿菌疋coli W3110 (岳芳芳等，中國釀造，2010年第2期，25_28)為出發菌株。該出發菌株系 申請人:擁有的在先公開文獻公開的菌株，由 申請人:自行保藏， 申請人:在此聲明從本專利申請日起免費發送該出發菌株。
[0034]如圖1所示，獲取大腸菌WR1001的具體步驟如下:
(1)菌懸液制備
E.coli W3110與添加氯化鋰的無菌水混合制成菌懸液，氯化鋰的添加量為無菌水質量的5%，細菌濃度為IO6個/mL ；
(2)紫外-氯化鋰復合誘變
將步驟(1)的菌懸液轉入含有磁力轉子的無菌空平板中，在150 rpm攪拌速度下，進行紫外照射誘變，紫外誘變條件為15W，30cm;培養皿中的菌懸液在紫外燈下關蓋照射30 s,再開蓋照射30 s ;后取菌懸液涂布于添加5%氯化鋰的完全培養基中，37 °C下避光倒置培養I d得到的菌株分別點印于基本培養基、篩選培養基中，培養Id后，挑選僅篩選培養基中生長良好而在基本培養基中不生長的菌株，其菌落形態為圓形邊緣整齊，表面光滑，半透明，小凸起；
(3)低能離子注入誘變 將步驟(2)中培養后的菌株用無菌水洗滌，菌懸液涂布于無菌空平皿上，制成單層菌液，吹干后，在能量lOkeV，劑量為3X1015ionS/cm2條件下進行氮離子注入實驗，后洗脫、涂布到完全培養基上。37 1:下避光倒置培養I d得到的菌株分別點印于基本培養基、篩選培養基中，培養Id后，挑選篩選培養基中生長良好的菌株，其菌落形態為圓形邊緣整齊，表面光滑，半透明，小凸起；
(4)初篩將步驟(3)培養得到的單菌落在LB斜面培養基上培養16 h，以接種量5% (v/v)，將活化的菌株接入種子培養基，在37°C下攪拌200 rpm培養8 h，后按5% (v/v)接種量轉入發酵培養基中，發酵48 h后檢測發酵液中L-苯丙氨酸含量,初篩出L-苯丙氨酸含量大于5g/L的菌落；
(5)復篩
將步驟(4)初篩得到的單菌落接種經斜面活化、種子培養后，按一定接種量分別接種至5L發酵罐中，初始發酵液體積為1.5 L，攪拌發酵72 h ;發酵培養條件為溫度37°C、攪拌速度200rpm、接種量是5% (v/v)、通氣量1-3 vvm、溶氧10%以上；檢測發酵液中L-苯丙氨酸含量，篩選出L-苯丙氨酸產量高的菌落；
重復步驟(1)至步驟(5)，最終篩選出發酵液中L-苯丙氨酸含量穩定在15 g/L的目標菌株萬.coli WR 1001。
[0035]實施例2
按照實施例1的方法獲取大腸桿菌WR1001
其中氯化鋰質量濃度為3 %; 15W紫外燈下照射120s;離子束在能量lOkeV，劑量為9X 1015ions/cm2條件下進行。
[0036]實施例3
按照實施例1的方法獲取大腸桿菌WR1001
其中氯化鋰質量濃度為3.5 %;離子束在能量IOkeV,劑量為6X 1015ionS/cm2條件下進行。
[0037]上述實施例1-3獲得導入大腸桿菌WR1001的形態學及生理生化特征如下:
菌落顏色:乳白色偏黃。
[0038]菌體形態:圓形菌落，有金屬光澤。
[0039]革蘭氏染色:陰性。
[0040]菌落大小:0.2-0.8 X 1-4 μ m。
[0041]需氧方式:好氧生長。
[0042]適宜生長溫度:37°C左右。
[0043]適宜生長pH: 7.0左右。
[0044] 實施例1-3的大腸桿菌WR1001的遺傳穩定性測試，菌株傳代發酵實驗如表1所
/Jn ο
[0045]表1為大腸桿菌WR1001的遺傳穩定性測試
【權利要求】
1.一株產L-苯丙氨酸的菌株，其特征在于，其分類命名為大腸桿菌WRlOOl(Escherichia co7iffR1001),已于2013年7月7日保存于中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號:CCTCC NO: M 2013319。
2.一種利用權利要求1所述的大腸桿菌WR1001生產L-苯丙氨酸的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)斜面培養 將實施例1獲取的大腸桿菌WR1001接種到LB斜面培養基中，在37°C下培養I d ； (2)種子培養 按步驟(1)所得的菌株接種量體積比5%-10%接種于種子培養基中，37°C、200rpm培養.12h ； (3)發酵培養 將步驟(2)培養后的種子液接入發酵培養基，培養條件如下:溫度37°C、攪拌速度.200-800 rpm、接種量是體積比5%_10%、通氣量1-3 vvm、溶氧10%_20%。
3.根據權利要求2所述的大腸桿菌WR1001生產L-苯丙氨酸的方法，其特征在于，所述LB斜面培養基/種子培養基配方為蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L, NaCl 5g/L，pH7.0,固體培養基加瓊脂15 g/L。
4.根據權利要求2所述的大腸桿菌WR1001生產L-苯丙氨酸的方法，其特征在于，所述發酵培養基配方為葡萄糖 25 g/L、(NH4)2SO4 5 g/L、KH2PO4 3 g/L、MgSO4 3 g/L、NaCl lg/L、檸檬酸鈉 1.5 g/L, CaCl2.2Η20 0.015 g/L,FeSO4.7Η20 0.1125g/L、L_Tyr 0.3g/L、蛋白胨5 g/L或者玉米漿5.75g/L、酵母粉5 g/L、維生素B1 0.075 g/L,TES 1.5mL/L ;其中TES組成為:Al2(SO4) 3.18H20 2 g/L、CoSO4.7H20 0.75 g/L、CuSO4.5H20 0.25 g/L、H3BO3.0.5 g/L、MnSO4.7H20 24 g/L、Na2MoO4.2H20 3 g/L、NiSO4.6H20 2.5 g/L、ZnSO4.7H20.15 g/L;當葡萄糖耗完后，補加700g/L的葡萄糖；當發酵22 h后，以0.06 g/h的速度流加.10 g/L的L-酪氨酸。
【文檔編號】C12N1/20GK103911333SQ201410152517
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月16日 優先權日:2014年4月16日
【發明者】陳可泉, 袁佩佩, 何珣, 曹偉佳, 王震, 肖文, 趙艷, 歐陽平凱 申請人:南京工業大學