一種生產高光學純度d-苯丙氨酸的方法
【專利摘要】本發明公開了一種生產高光學純度D-苯丙氨酸的方法，屬于酶學與酶工程【技術領域】。本發明采用介孔材料MCM-41為載體固定苯丙氨酸脫氨酶，不對稱拆分DL-苯丙氨酸生產高光學純度的D-苯丙氨酸。通過構建重組菌，高效表達，獲得大量的重組酶，將重組酶進行固定化，制備高穩定性的酶催化劑，搭建填充床反應器，半連續生產D-苯丙氨酸。采用本方法可以獲得高純度的D-苯丙氨酸，以滿足工業化生產需求。
【專利說明】一種生產高光學純度D-苯丙氨酸的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種生產高光學純度D-苯丙氨酸的方法，尤其是一種利用重組苯丙 氨酸脫氨酶不對稱拆分DL-苯丙氨酸生產高光學純度D-苯丙氨酸的方法，屬于酶學與酶工 程【技術領域】。

【背景技術】
[0002] D-苯丙氨酸廣泛應用于制藥工業，如用于生產治療2型糖尿病"那格列奈的"。 D-苯丙氨酸的生產主要是化學合成，由于化學合成路線復雜，反應步驟多，副產物多，導致 生產成本高昂。酶學方法由于其專一性高，副產物少，反應條件溫和，產率高等優點，是一種 綠色生產工藝。工業上采用轉氨酶不對稱轉化對消旋的DL-苯丙氨酸中的L-苯丙氨酸，生 成α-酮酸，提純獲得D-苯丙氨酸。由于轉氨酶催化需要輔因子NADH，在催化過程中，輔 因子需要多批次添加以維持酶的活性，而且轉氨酶的穩定性差，半衰期短，生產過程控制復 雜，導致D-苯丙氨酸生產的成本高。為此，需要尋找新的不對稱轉化DL-苯丙氨酸的新方 法。苯丙氨酸脫氨酶能立體選擇性催化L-苯丙氨酸轉化生成反式肉桂酸，肉桂酸的溶解度 較低，容易通過調節pH沉淀除去肉桂酸，從而獲得高純度的D-苯丙氨酸。
[0003] 本方法是通過構建重組大腸桿菌，異源高效表達粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶，獲得 工業級應用的酶，然后將酶固定化，構建填充床酶反應器，用于D-苯丙氨酸的生產。目前固 定化酶采用的載體有海藻酸鈉、殼聚糖、樹脂等材料，這些固定化材料由于機械強度低，高 度擴散限制，固定化酶的重復利用次數低。
[0004] 本發明采用酵母來源的苯丙氨酸脫氨酶具有高活性、高穩定性等優點，一步催化 獲得D-苯丙氨酸，生產過程與轉氨酶相比更加簡單。以介孔二氧化硅材料MCM-41作為固 定化材料，采用化學修飾，將氨基嫁接在MCM-41的表面上，提供酶固定化的錨定位點，與酶 進行共價連接，提高酶的穩定性、重復利用次數。


【發明內容】

[0005] 本發明要解決的技術問題是提供一種應用固定化苯丙氨酸脫氨酶（PAL)生產 D-苯丙氨酸的方法，主要是以DL-苯丙氨酸溶液為底物，將固定化苯丙氨酸脫氨酶填裝入 固定床得到固定床酶反應器，催化L-苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸和氨，最終得到高光學 純的D-苯丙氨酸。
[0006] 所述固定床酶反應器優選將固定化酶與硅藻土混勻后填充玻璃柱得到。
[0007] 所述固定床酶反應器進一步優選將100-200個酶活單位的固定化苯丙氨酸脫 氨酶（MCM-41-NH-GA-RgPAL)與100-120g的硅藻土充分混合，裝進徑高比為5:1，體積為 450mL的玻璃柱中。所述固定化苯丙氨酸脫氨酶與娃藻土的用量分別優選100U和100g。
[0008] 所述固定床酶反應器的溫度優選以循環夾套控制。
[0009] 所述固定化苯丙氨酸脫氨酶的獲得方法，主要包括以下步驟：（1)MCM-41載體的 修飾：以介孔二氧化硅MCM-41為載體，將氨基嫁接在MCM-41材料孔道中硅羥基上得到 MCM-41-NH2，提供共價固定的錨定位點；（2)制備MCM-41-NH-GA :取適量的載體MCM-41-NH2 與0. 5%戊二醛在室溫下反應lh，然后用雙蒸水洗滌，盡可能洗去多余的戊二醛，室溫下干 燥，制備成MCM-41-NH-GA ; (3)固定化酶：lg MCM-41-NH-GA與含有50mg酶活為4. 2U/mg的 酶溶液進行混合，在室溫下反應2h，獲得共價固定化酶MCM-41-NH-GA-RgPAL。
[0010] 所述MCM-41載體的修飾優選以下步驟：將lg MCM-41、50mL無水甲苯、2mL3-氨基 丙基三甲氧基硅烷180°C回流12h后用無水甲醇洗滌三次，真空干燥后備用，獲得修飾的載 體 MCM-41-NH2。
[0011] 所述制備MCM-41-NH-GA優選以下步驟：取lg MCM-41-NH2載體與0. 5%戊二醛 (GA)在室溫下反應lh，然后用雙蒸水洗滌三次，盡可能洗去多余的戊二醛，室溫下干燥，制 備成 MCM-41-NH-GA。
[0012] 所述固定化酶優選以下步驟：取lg MCM-41-NH-GA與50mg的酶活性為3-5U/mg的 酶溶液（Tis-HIC緩沖液溶液，50mM，pH8. 5)進行混合，在室溫下反應2h，獲得共價固定化酶 MCM-41-NH-GA-RgPAL〇
[0013] 所述催化生產高光學純度D-苯丙氨酸的方法優選以下步驟：以12mL/min的流速 往固定床酶反應器中泵入100mM的DL-苯丙氨酸，溫度控制在50°C，當L-苯丙氨酸轉化率 達到80%時，調整反應液的pH至5,沉淀產物肉桂酸后再調整至初始pH8. 5,反應液泵入反 應器繼續反應，直至光學純度超過99%時，反應結束。
[0014] 所述苯丙氨酸脫氨酶（PAL)的獲得方法是將來源于紅粘酵母的苯丙氨酸脫氨酶 在大腸桿菌中進行表達。
[0015] 所述苯丙氨酸脫氨酶的獲得方法優選將核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的序列以 pET-28a(+)為表達載體，在E. coli BL21中進行表達得到。
[0016] 所述苯丙氨酸脫氨酶的獲得方法還包括對酶進行純化的步驟：（1)收集重組菌， 破碎菌體后，離心取上清，上清液中加入硫酸銨粉末，至飽和度為35%，緩慢攪拌使其完全 溶解；（2)調節pH值使酶液的pH保持在8. 7,靜置半小時后低溫離心收集上清液，繼續加 入硫酸銨至飽和度為55%，4°C靜置數小時后，低溫離心收集蛋白沉淀；（3)將沉淀溶解在 25mMTris-HCl pH8. 7的緩沖液中并且4°C透析數小時。
[0017] 本發明提供了一種生產高光學純的D-苯丙氨酸的生產工藝，通過分離粘紅酵母 苯丙氨酸脫氨酶基因，構建高效表達的大腸重組菌，大量表達重組酶。采用硫酸銨一步提 純重組酶，獲得工業純的苯丙氨酸脫氨酶，將其固定在介孔材料MCM-41上，制備固定化酶 催化劑，將制備的固定化酶填裝入固定床，搭建高效催化的固定床酶反應器應用于DL-苯 丙氨酸的拆分，生產高光學純的D-苯丙氨酸。固定化酶的最適反應溫度為55°C，最適反應 pH為8. 5,重復催化反應30次后，固定化酶的酶活僅損失15%。D-苯丙氨酸的產率達到 0. 32817^光學純度超過99%，與化學合成和轉氨酶催化相比，光學純度、產率更高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1 :重組酶的高效表達，M，蛋白marker ;1，空白對照；2,重組菌未添加誘導劑； 3,重組菌加入IPTG誘導
[0019] 圖2:固定化酶的流程圖
[0020] 圖3 :紅外光譜分析MCM-41氨基的嫁接；上方曲線：載體MCM-41 ;下方曲線：載體 MCM-41-NH2。
[0021] 圖4 :重復利用次數對固定化酶活性的影響
[0022] 圖5 :填充床反應器
[0023] 圖6 :填充床拆分DL-苯丙氨酸生產D-苯丙氨酸的過程

【具體實施方式】
[0024] 肉桂酸測定方法：采用HPLC測定產物肉桂酸，色譜柱C18, 5μπι，250mmX4. 6mm ;流 動相為5%的甲醇；流速lmL/min ;檢測波長290nm ;柱溫為室溫。
[0025] 苯丙氨酸脫氨酶酶活定義：40°C，每分鐘轉化L-Phe生成1 μ mol反式肉桂酸所需 酶量為1U。
[0026] D-苯丙氨酸的光學純度（eeD)計算公式如下：
[0027] eeD = [ ([Dphe，Wt-Lphe，QUt]) ADphe，QUt+Lphe，QUt) ] X 100 % ;Lphe，in 表示泵入反應器中底物 中L-苯丙氨酸的濃度（mM) ;Lphe;()Ut反應過程中流出反應器的產物中殘余的L-苯丙氨酸的 濃度（mM) ;Dph^ut是泵入反應器中底物中D-苯丙氨酸的濃度。
[0028] 實施例1構建高效表達粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶的工程菌；
[0029] 1、獲得粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶的基因序列（pal)
[0030] (1)裝有50mL培養基的250mL的三角瓶中接入粘紅酵母，30°C培養18-20h至生長 對數期（〇D_ = 1. 0)，采用酸性酚提取總RNA
[0031] ⑵RNA的提取按照分子克隆實驗手冊（第三版）方法進行；
[0032] (3)反轉錄克隆粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶（pal)的基因
[0033] 以引物 primer F :5，-GGAATTCCATATGATGGCCCCCTCCGTCGACTCGATC-3，；primer R : 5' -CGGAATTCCTAGTATGGTCTACGTCCAAAGG-3'，PCR 擴增目的基因 ，PCR 的條件是：94°C預變性 4min，94°C變性lmin，58°C退火30sec，72°C延伸2min，25個循環，瓊脂糖凝膠電泳檢測。所 得苯丙氨酸脫氨酶的基因（pal)序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0034] 2、構建克隆載體pUCm-T-pal
[0035] 0· 25mL離心管中加入 5μ L上述PCR產物，1 μ L lOXTaqbuffer，1 μ L dATP(2mM)， 1 μ L Taq酶（5U/ μ L)加水至10 μ L，70°C反應30min采用磁珠法提純，10 μ L無菌水重懸。 取 5yL，加入 lyL連接buffer，lyL 50%PEG，lyL pUCm-T載體，lyL T4連接酶，加去 離子水至 10yL，于 16°C過夜連接。然后加入 10yL 5XKCM(0.5M KC1，0. 15Μ CaCl2,0.25M MgCl2)，去離子水30 μ L混勻后加入至50 μ L的E. coli JM109感受態中，冰浴30min，42°C熱 擊90sec，冰上2min，加入100μ L的新鮮LB培養基，37°C培養30-60min，取100μ L涂布含 有氨芐青霉素（50ug/mL)的LB平板，37°C培養10h，挑取單菌落，接入5mL含50ug/mL的氨 芐青霉素的LB培養基中37°C培養10h，取2mL菌液，提質粒，PCR驗證構建的pUCm-T-pal， 樣品進行測序。
[0036] 3、構建表達載體 pET_28a(+)_pal
[0037] Ndel和EcoRl分別對pUCm-T-pal和空載體pET_28a(+)進行雙酶切，膠回收后于 16°C連接過夜，轉化E. coli JM109,在含有卡那霉素抗性的LB平板挑陽性重組子，提取重 組質粒并進行PCR和雙酶切驗證，陽性克隆即pET-28a (+)-pal。
[0038] 實施例2苯丙氨酸脫氨酶的生產
[0039] 1、誘導表達
[0040] 取lyL pET-28a(+)-pal，轉入E.coli BL21，取100yL涂布含有卡那霉素（50ug/ mL)的LB平板，37°C培養10h，挑取單菌落至5mL的LB培養基中37°C培養10h，取lmL培養 液至100mL的LB培養基中37°C培養至0D 6QQ為0. 6時加入至終濃度為0. 4mM的IPTG，26°C 誘導表達12h后離心收集菌體，進行SDS-PAGE檢測和酶活性測定（圖1)。
[0041] 2、工業純酶的制備
[0042] 重組菌發酵液離心去上清后，菌體洗滌2次，菌體采用超聲波破碎，10000g離心 5min，取上清，上清液中加入硫酸銨粉末，至飽和度為35%，緩慢攪拌使其完全溶解。調節 pH值，使酶液的pH保持在8. 7,靜置半小時后10000 X g低溫離心10min，收集上清液繼續加 入硫酸銨至飽和度為55%，4°C靜置數小時后，低溫離心收集蛋白沉淀。將沉淀溶解在25mM Tris-HCl pH8. 7的緩沖液中并且4°C透析數小時后檢測酶的活性，活性達到4. 2U/mg。
[0043] 實施例3固定化酶的制備
[0044] 1、載體的化學修飾
[0045] 以介孔二氧化硅MCM-41為載體，將氨基嫁接在MCM-41材料孔道中硅羥基上，提供 共價固定的錨定位點。具體地，將lg MCM-41、50mL無水甲苯、2mL 3-氨基丙基三甲氧基硅 烷180°C回流12h后用無水甲醇洗滌三次，真空干燥后備用。獲得修飾的載體MCM-41-NH 2， 采用紅外光譜進行分析，確定氨基的嫁接（圖2, 3)，由圖3可知，氨基成功嫁接在介孔材料 MCM-41 上。
[0046] 2、固定化酶的制備
[0047] 取^的載體1--1-見12與0.5%戊二醛（64)在室溫下反應111，然后用雙蒸水洗 滌三次，盡可能洗去多余的戊二醒，室溫下干燥，制備成MCM-41-NH-GA。取1 g MCM-41-NH-GA 與50mg的酶活性為4. 2U/mg的酶溶液（Tis-HIC緩沖液溶液，50mM，pH8. 5)進行混合，在室 溫下反應2h，獲得共價固定化酶MCM-41-NH-GA-RgPAL，流程如圖2所示。獲得的固定化酶 的活力達到4. 08U/mg。
[0048] 3、固定化酶的酶學性質
[0049] 取適量的固定化酶和游離酶分別加入至250 μ L Tris-HIC緩沖溶液（50Mm， pH8. 5)，然后加入250 μ L的40mM的L-苯丙氨酸溶液，于50°C反應30min后，測定反式肉桂 酸的含量。酶單位的定義為：在50°C下每min形成1 μ mol的反式肉桂酸所需的酶為1個 單位。固定化PAL的酶活為游離酶的92%，酶活為4. 08U/mg。酶的最適反應溫度為55°C， 最適反應pH為8. 5,重復催化反應30次后，固定化酶的酶活僅損失15% (圖4)，表面該方 法制備的酶穩定好，能適應工業化的應用。
[0050] 實施例4固定化酶催化DL-苯丙氨酸產D-苯丙氨酸
[0051] 填充床酶反應器的構建：100個酶活單位的MCM-41-NH-GA-RgPAL與100g的硅藻 土充分混合，裝進50cmX 25cm的玻璃柱中，反應液從底部由蠕動泵泵入酶床，反應液從柱 上部流出，反應液循環進出填充床反應器，反應器的溫度由循環夾套控制在50°C (圖5)。
[0052] 生產工藝：以12mL/min的流速往填充床酶反應器中泵入lOOmM的DL-苯丙氨酸， 溫度控制在50°C，每隔4h取樣分析反應液中D-苯丙氨酸的光學純度和L-苯丙氨酸的轉化 率，當L-苯丙氨酸轉化率達到80%時，調整反應液的pH至5,沉淀產物肉桂酸后再調整至 初始pH8. 5,反應液泵入反應器繼續反應，直至光學純度（ee值）超過99 %時，反應結束，反 應過程中D-苯丙氨酸的光學純度變化圖6所示。
[0053] 雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
【權利要求】
1. 一種應用固定化苯丙氨酸脫氨酶生產D-苯丙氨酸的方法，其特征在于，以DL-苯丙 氨酸溶液為底物，將固定化苯丙氨酸脫氨酶填裝入固定床得到固定床酶反應器，催化L-苯 丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸，得到高光學純的D-苯丙氨酸。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定床酶反應器是由固定化苯丙氨 酸脫氨酶與硅藻土混勻后填充玻璃柱得到。
3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述固定床酶反應器是將100-200個酶活 單位的固定化苯丙氨酸脫氨酶與100 -120g的娃藻土充分混合，裝進徑高比為5:1，體積為 450mL的玻璃柱中，固定床酶反應器的溫度以循環夾套控制。
4. 根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述固定化苯丙氨酸脫氨酶主 要通過以下步驟獲得：（1)MCM-41載體的修飾：以介孔二氧化硅MCM-41為載體，將氨基嫁 接在MCM-41材料孔道中硅羥基上得到MCM-41-NH 2，提供共價固定的錨定位點；（2)制備 1〇1-41-順-64:取適量的載體1〇1-41-順2與0.5%戊二醛在室溫下反應111，然后用雙蒸 水洗滌，洗去多余的戊二醛，室溫下干燥，制備成MCM-41-NH-GA ;(3)固定化酶：取適量的 MCM-41-NH-GA與酶溶液進行混合，在室溫下反應2h，獲得共價固定化酶。
5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟⑴具體是將lg MCM-41、50mL 無水甲苯、2mL 3-氨基丙基三甲氧基硅烷180°C回流12h后用無水甲醇洗滌三次，真空干燥 后獲得修飾的載體MCM-41-NH2 ;所述步驟（2)取lg MCM-41-NH2載體與0. 5%戊二醛在室溫 下反應lh，然后用雙蒸水洗滌三次，洗去多余的戊二醛，室溫下干燥，制成MCM-41-NH-GA。
6. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟（3)取lg MCM-41-NH-GA 與50mg的酶活性為3-5U/mg的酶溶液進行混合，在室溫下反應2h，獲得共價固定化酶 MCM-41-NH-GA-RgPAL〇
7. 根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述催化L-苯丙氨酸脫氨生成反 式肉桂酸包括以下步驟：以12mL/min的流速往固定床酶反應器中泵入lOOmM的DL-苯丙氨 酸，溫度控制在50°C，當流出的反應液中L-苯丙氨酸轉化率達到80%時，調整反應液的pH 至5,沉淀產物肉桂酸后再調整至初始pH8. 5,將反應液泵入反應器繼續反應，直至流出的 反應液中D-苯丙氨酸的光學純度超過99%時，反應結束。
8. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述苯丙氨酸脫氨酶是將苯丙氨酸脫氨 酶在大腸桿菌中進行表達后獲得的。
9. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于，將SEQ ID NO. 1所示的基因以pET-28a(+) 為表達載體，在E.coli BL21中進行表達得到苯丙氨酸脫氨酶。
10. 根據權利要求9所述的方法，其特征在于，還包括對酶進行純化：（1)收集重組菌， 破碎菌體后，離心取上清，上清液中加入硫酸銨粉末，至飽和度為35%，緩慢攪拌使其完全 溶解；（2)調節pH值使酶液的pH保持在8. 7,靜置半小時后低溫離心收集上清液，繼續加 入硫酸銨至飽和度為55%，4°C靜置數小時后，低溫離心收集蛋白沉淀；（3)將沉淀溶解在 25mM Tris-HCl pH8. 7的緩沖液中并且4°C透析數小時。
【文檔編號】C12P13/22GK104152523SQ201410364770
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月28日 優先權日:2014年7月28日
【發明者】房月芹, 周哲敏, 朱龍寶, 肖克, 周麗, 崔文璟 申請人:江南大學