基于環介導等溫擴增技術的胡蘿卜成分快速檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于環介導等溫擴增技術的胡蘿卜成分快速檢測試劑盒及其檢測方法，屬于食品和飲料中植物源性成分的定性檢測技術，具體地說是用環介導等溫擴增技術檢測食品和飲料中胡蘿卜成分的試劑盒及方法。試劑盒包括10×Bstbuffer、dNTP、硫酸鎂、甜菜堿、上游內引物、下游內引物、上游外引物、下游外引物、上游環引物、下游環引物、BstDNA聚合酶、顯色劑和陽性對照；其中10×Bstbuffer中含有三羥基甲基氨基甲烷、氯化鉀、硫酸銨、硫酸鎂和曲拉通X-100；胡蘿卜成分的環介導等溫擴增檢測方法包括食品和飲料DNA的提取、胡蘿卜成分的環介導等溫擴增和結果判定。本發明的試劑盒快速、特異性強、操作簡便、重復性好，方法靈敏度很高，可檢測含量低至0.001%的胡蘿卜成分。
【專利說明】基于環介導等溫擴增技術的胡蘿卜成分快速檢測試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基于環介導等溫擴增技術的胡蘿卜成分快速檢測試劑盒及其檢測方法，屬于利用核酸擴增技術進行植物源性成分快速檢測的【技術領域】。
【背景技術】
[0002]全球經濟一體化和貿易國際化的的不斷擴大，對于發展中的中國，是機遇也是挑戰。目前，我國已成為世界上第五大農產品出口國，農產品進出口貿易持續增長。美國、歐盟、日本等發達國家和地區為了維護本國的經濟利益，爭奪國際市場，竭力通過名目繁多的檢驗項目和嚴格甚至苛刻的技術標準，對進口農產品設置貿易障礙，導致我國農產品出口增長遭受較大壓力。就進出口的農產品而言，合格的產品，不僅要無毒無害，滿足安全衛生要求；而且要無攙雜攙假，滿足品質要求。其中品質合格，又主要包含兩方面的含義:1.原料來源與標簽一致。2.組分含量與標簽一致。歐盟自2006年I月I日起開始實施新的食品衛生法規，新法規突出了食品生產過程中的可追溯管理與食品的可追溯性，強調食品的身份鑒定標識與健康標識。我國國家標準GB 7718-94《食品標簽通用標準》和國家出入境檢驗檢疫局發布的《進出口食品標簽管理辦法》，也明確提出食品標簽標注內容應與食品相符。為此，國家質檢總局專門發文，要求嚴厲打擊制假制劣的違法行為，對假冒偽劣產品要依法沒收并監督銷毀，追查生產源頭和去向，嚴防流入消費環節。
[0003]在食品和飲料的生產與銷售中，產品無標簽或標簽不規范，利用摻雜摻假、以次充好等手段欺騙消費者謀取暴利的事件，國內、國外均屢屢發生。各種原料被加工成食品和飲料成品后，已無法從外觀 對其組成進行鑒定。生產者受利益驅動，擅自改變產品組成，或摻入價廉的替代品，或直接減少原料用量，導致產品的真實屬性與標簽不符。這種造假行為不僅僅涉及經濟、營養價值，更直接影響著消費者的健康，可能引發食源性過敏反應。
[0004]胡蘿卜是一種質脆味美的家常蔬菜，素有“小人參”之稱，其富含糖類、脂肪、揮發油、胡蘿卜素、維生素A、維生素B1、維生素B2、花青素、鈣、鐵等多種營養成分，常作為食品配料用于制作各種糕點、面食和飲料。胡蘿卜雖營養豐富，但同時也是一種常見的食物過敏原。有文獻報道，胡蘿卜、蘋果、大豆、榛子、獼猴桃、小麥是柏林人最常見的食物過敏原。瑞士專家報道，大約25%的食物過敏者會對胡蘿卜產生過敏反應。《亞運食品安全食品過敏原標識標注》地方技術規范已于2009年頒布實施，規范列出可導致過敏反應的食品名單，要求含有名單上過敏原的亞運食品必須如實標注，胡蘿卜位列其中。鑒于此，盡快建立可靠有效的胡蘿卜成分檢測方法，確保食物標簽真實準確，對于減少食源性過敏反應發生，加強食品過敏原標識管理，改進食品安全，保護消費者利益具有重要意義。
[0005]食品中植物源性成分檢測，常采用蛋白檢測和DNA檢測的方法。兩類方法，對于不同產品中植物源性成分的檢出和定量檢測，各有優、缺點。以DNA為測試對象的方法與以蛋白為測試對象的方法相比，在產品成分復雜的情況下，目標DNA可以有效提取，受產品基質的影響較小；此外，DNA比較穩定，不象蛋白質組成那樣易受加工工藝的影響。當前，基于DNA的檢測方法中，常用的有聚合酶鏈式反應(常規PCR和實時熒光PCR)，該方法靈敏、特異，但需要高品質熱循環儀，而且因為溫度循環導致耗時較長。其他新開發的核酸擴增方法，比如 NASBA (nucleic acid sequence-based amplification)>3SR (self-sustainedsequence replication)^SDA(strand displacement amplification)等，在擴增循環方面，都有各自的創新點。NASBA和3SR使用一系列轉錄和反轉錄過程來循環以避免高溫變性作用，SDA則使用限制性內切酶和修飾過的模板來循環擴增。雖然它們的敏感性都很高，可以檢測并擴增小于10個拷貝的核酸樣本，但是它們還有各自需要克服的缺點。技術要求、材料儀器要求、技術本身特異性缺陷等方面嚴重束縛了這些技術的推廣應用。環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification,簡稱LAMP)技術則在這些方面有所突破。LAMP有比較高的特異性和抗干擾能力，只有當2對引物與目的片段的六個區域都匹配上時才能進行擴增。非目的片段對LAMP反應的干擾比較小，這方面比常規的PCR要強。LAMP的反應體系比較穩定可靠，在室溫下放置2周后仍然穩定并且對于樣品中原有或污染的無關、干擾片段仍然不敏感。同時LAMP的敏感性也比較高，可以以單拷貝的基因為模板進行擴增。LAMP反應的過程簡單快速而且高效，能夠在Ih內將單拷貝的基因模板擴增到IO9-1Oltl個拷貝，如果在體系中增加2條環狀引物，還可使LAMP的反應時間縮短近一半，從而進一步提高檢測效率。LAMP擴增反應過程是在60-70°C的恒溫下進行的。這就擺脫了昂貴儀器的束縛，一個水浴鍋即可完成絕大多數檢測過程。其結果的檢測可使用濁度儀檢測沉淀濁度，也可通過使用染料，在日光下肉眼直接判定。因此，相比于其他基于DNA的檢測方法，LAMP方法更加簡便、快捷，是真正普及型的核酸檢測方法。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種采用環節導等溫擴增技術檢測胡蘿卜成分的試劑盒和檢測方法，克服基于蛋白的檢測方法在某些食品和飲料檢測中的局限性，為胡蘿卜成分檢測提供有效工具，從而確保食品和飲料標簽的一致性，保護消費者利益。
[0007]本發明的主要原理為:設計6條特異引物，依靠一種高活性鏈置換DNA聚合酶，使得鏈置換DNA合成在恒溫條件下不停地自我循環。LAMP擴增分兩個階段:第I階段為起始階段:任何一個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈。上游內部引物FIP的F2序列首先與模板F2c結合，在鏈置換型DNA聚合酶的作用下向前延伸啟動鏈置換合成。外部引物F3與模板F3c結合并延伸，置換出完整的FIP連接的互補單鏈。FIP上的Flc與此單鏈上的Fl為互補結構，自我堿基配對形成環狀結構。以此鏈為模板，下游引物BIP與B3先后啟動類似于FIP和F3的合成，形成啞鈴狀結構的單鏈。迅速以3’末端的Fl區段為起點，以自身為模板，進行DNA合成延伸形成莖環狀結構。該結構是LAMP基因擴增循環的起始結構。第2階段是擴增循環階段:以莖環狀結構為模板，FIP與莖環的F2c區結合，開始鏈置換合成，解離出的單鏈核酸上也會形成環狀結構。迅速以3 ’末端的BI區段為起點，以自身為模板，進行DNA合成延伸及鏈置換，形成長短不一的2條新莖環狀結構的DNA。BIP引物上的B2與其雜交，啟動新一輪擴增，且產物DNA長度增加一倍。在反應體系中添加2條環狀引物LF和LB，它們也分別與莖環狀結構結合啟動鏈置換合成，周而復始。該循環反應可使靶DNA累積到IO9-1Oltl拷貝。擴增結果通過熒光染料染色肉眼觀察。[0008]本發明涉及的胡蘿卜環介導等溫擴增檢測試劑盒，其中包括的試劑如下:
(1)環介導等溫擴增反應液A
包括 IOXBst buffer 反應緩沖液、l-2mmol/L dNTP、5_7mmol/L硫酸鎂、0.8-lMmol/L上游內引物、0.8-lMmol/L下游內引物、0.1-0.2Mmol/L上游外引物、0.1-0.2Mmol/L下游外引物、0.4-0.6Mmol/L上游環引物、0.4-0.6Mmol/L下游環引物和0.7-0.9mol/L甜菜堿；
其中IOXBst buffer反應緩沖液含有200mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和I %曲拉通X-100 ；
其中上游內引物的序列為:5’- AACCACCGATGTCGCGATGCCTTTTGTGTGCGGTTGGC -3’ ；下游內引物的序列為:5’_ GTCGTTGTGTATACCCGCCGCGGGTCACMTCGAAGTGCA -3’ ；上游外引物的序列為:5’_ GAAATTGGCCTCCCGTGC -3’ ；下游外引物的序列為:5’- GCTTAAACTCAGCGGGTAGT-3’ ；上游環引物的序列為:5’_ CGTCACCAGAGACTCATTTTTGA -3’ ；下游環引物的序列為:5’-GGCCCTTGGGCACAGCAAA -3，；
其中上游內引物、下游內引物、上游外引物、下游外引物、上游環引物、下游環引物體積比為:8:8:1:1:4:4 ；
(2)Bst DNA 聚合酶 B:8U/^L ;
(3)顯色劑C:熒光染料SYBR Green ；
(4)陽性對照D:胡 蘿卜基因組DNA，20ng/^L。
[0009]上面所述環介導等溫擴增反應液A,每管20μL的最佳組成為:10XBst buffer反應緩沖液 2.5PL、25mmol/L dNTPl.3μL、100mmol/L 硫酸鎂 1.5PL、5mol/L 甜菜堿 4μL、10Mmol/L上游內引物2.4pL、10Mmol/L下游內引物2.4pL、10Mmol/L上游外引物0.3μL,10Mmol/L下游外引物0.3μL、10Mmol/L上游環引物1.2μL、10Mmol/L下游外引物1.2μL,ddH20 (滅菌雙蒸水)2.9PL。
[0010]使用上述引物，檢測產品中胡蘿卜成分的方法，依次包括下列步驟(1) - (3):
(I)待檢樣品DNA的提取
DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取試劑盒。
[0011](2)胡蘿卜環介導等溫擴增
A.在反應管中分別加入20μL環介導等溫擴增反應液A、WLBst DNA聚合酶B和4μL待檢樣品DNA，混勾；
B.于恒溫水浴上63°C放置40min；
C.將水浴調到85°C中止反應，5min后取出待檢。
[0012]擴增時，應設立2個對照:陽性對照(胡蘿卜基因組DNA作為模板)、空白對照(不含DNA模板，以水代替)。
[0013](3)顯色檢測
在待檢的每個反應管中加入WL顯色劑C，直接用肉眼觀察顏色變化。在陽性對照和空白對照都成立的情況下(即胡蘿卜DNA出現擴增，加入顯色劑后，擴增反應液顏色變為綠色；空白對照無擴增，加入顯色劑后，擴增反應液顏色為橙色)，如果樣品的反應管中擴增反應液顏色變為綠色，說明待檢樣品含有胡蘿卜成分，如果顏色為橙色，則說明待檢樣品中不含有胡蘿卜成分。
[0014]本發明建立了胡蘿卜成分的環介導等溫擴增檢測試劑盒及檢測方法。該發明具有特異性強、靈敏度高、操作簡便的特點。使用本試劑盒及檢測方法，可檢測含量低至0.001%的胡蘿卜DNA，其絕對檢測限為4.128pg ;而且與包括同屬傘形科的孜然、香芹、香菜、大茴香、小茴香在內的其他近緣物種及非近緣物種沒有交叉反應，特別適用于一些成分復雜的加工食品和飲料中胡蘿卜成分的檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為用胡蘿卜環介導等溫擴增檢測方法檢測同屬傘形科植物的孜然、香芹、香菜、大茴香、小茴香，常見蔬菜青椒、黃瓜、菜花、圓白菜、洋蔥以及常見食品花生、牛奶、大豆、小麥、雞蛋、豬肉、牛肉DNA，上述樣品的顯色反應，圖中管I為陽性對照(胡蘿卜DNA)顯色結果。管2為空白對照(水)的顯色結果；管3-管19依次為孜然、香芹、香菜、大茴香、小茴香、青椒、黃瓜、菜花、圓白菜、洋蔥、花生、牛奶、大豆、小麥、雞蛋、豬肉、牛肉的顯色結果。
[0016]圖2為用胡蘿卜環介導等溫擴增檢測方法檢測不同含量胡蘿卜成分DNA溶液的顯色反應。圖中管I為空白對照(水)的顯色結果。管2-管7依次為含10%、1%、0.1%、0.01%、
0.001%,0.0001%胡蘿卜成分DNA溶液的顯色結果。
[0017]圖3為用胡蘿卜環介導等溫擴增檢測方法檢測米粉樣品DNA，樣品的顯色反應。圖中管I為陽性對照(胡蘿卜DNA)的顯色結果，管2為空白對照(水)的顯色結果，管3為米粉樣品的顯色結果。
[0018]圖4為胡蘿卜環介導等溫擴增檢測方法檢測面條樣品DNA，樣品的顯色反應。圖中管I為陽性對照(胡蘿卜DNA)顯色結果，管2為空白對照(水)的顯色結果，管3為面條樣品的顯色結果。
【具體實施方式】
[0019]下面結合實施例對本發明做進一步說明。
[0020]實施例1
按照以下程序進行檢測:
(I)非胡蘿卜樣品DNA的提取
A.稱取0.1g樣品，轉至1.5mL離心管中。加入600μL預熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；
B.在管中加入等體積酚/氯仿600μL，上下顛倒充分混勻，抽提2min；
C.12000g離心5min,吸取上清到一新的離心管中,加入與上清等體積的沉淀液,混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min,去上清,保留沉淀；
D.在沉淀中加入60μLRNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C溶解沉淀，5min后加入300μL緩沖液，上下顛倒混勻10次；
Ε.取出離心柱，將離心柱放置在I個2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ；
F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加入200μL洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；
G.在離心柱中加入200μL70%乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；
H.12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；1.將離心柱放置在一個新的1.5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50μL洗脫緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作LAMP反應的模板。
[0021](2)非胡蘿卜樣品DNA的環介導等溫擴增:
A.在反應管中加入20μL環介導等溫擴增反應液A、WLBst DNA聚合酶B和4μL待檢樣品DNA，混勻；
B.于恒溫水浴上63°C放置40min；
C.將水浴調到85°C中止反應，5min后取出待檢。
[0022](3)加入顯色劑SYBR Green,顯色檢測
管3-管19，即孜然、香芳\香菜、大茴香、小茴香、青椒、黃瓜、菜花、圓白菜、洋蔥、花生、牛奶、大豆、小麥、雞蛋、豬肉、牛肉DNA均無擴增，反應液顏色為橙色；陽性對照管管I (胡蘿卜基因組DNA作為反應模板)反應液顏色變為綠色、空白對照管管2 (以水作為反應模板)反應液顏色為橙色，見圖1。
[0023]該組引物，經在線BLAST的結果證實，具有很高的特異性，不會與其他物種發生交叉反應。胡蘿卜為傘形科植物，因此在特異性實驗中特別選擇同屬傘形科的孜然、香芹、香菜、大茴香、小茴香，以及其他常見食品青椒、黃瓜、花生、牛奶、大豆、小麥、雞蛋DNA等進行實驗。經驗證，除胡蘿卜基因組DNA出現陽性擴增，反應液顏色變為綠色外，其他物種均無擴增，反應液顏色為橙色，與預期相符，表明該組引物有良好的特異性，與上述物種沒有交叉反應。
[0024]實施例2
按照以下程序進行檢測:
(I)不同含量胡蘿卜樣品DNA的提取
A.將胡蘿卜和大豆，加入液氮，研磨成粉末狀后，各稱取0.1 g，轉至1.5mL離心管中。加入600μL預熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；
B.在管中加入等體積酚/氯仿600μL，上下顛倒充分混勻，抽提2min;；
C.將胡蘿卜和大豆樣品的DNA抽提緩沖液按比例(10%,1%，0.1%，0.01%, 0.001%,
0.0001%)進行混合；
D.加入與上清等體積的沉淀液，混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min，去上清，保留沉淀；
E.在沉淀中加入60μLRNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C溶解沉淀，5min后加入300μL緩沖液，上下顛倒混勻10次；
F.取出離心柱，將離心柱放置在I個2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ；
G將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加入200μL洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；
H.在離心柱中加入200μL70%乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；
1.12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；
J.將離心柱放置在一個新的1.5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50μL洗脫緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作LAMP反應的模板。
[0025](2)不同含量胡蘿卜樣品DNA的環介導等溫擴增:A.在反應管中加入20μL環介導等溫擴增反應液A、WLBst DNA聚合酶B和4μL待檢樣品DNA，混勻；
B.于恒溫水浴上63°C放置40min；
C.將水浴調到85°C中止反應，5min后取出待檢。
[0026](3)加入顯色劑SYBR Green,顯色檢測
管2-管6，即胡蘿卜含量為10%、1%、0.1%、0.01%,0.001%的DNA樣品均出現陽性擴增，反應液顏色變為綠色；空白對照管管I (以水作為反應模板)反應液顏色為橙色，見圖2。
[0027]胡蘿卜樣品取0.lg，提取得到的核酸濃度為103.2ng/yL。檢測中使用4yL，據此可粗略估計當DNA抽提緩沖液中的胡蘿卜成分含量為0.001%,胡蘿卜成分DNA總量為
4.128pg，即該方法的絕對檢測限為4.128pg。
[0028]實施例3
按照以下程序進行檢測:
(I)待測米粉樣品DNA的提取
A.稱取0.1g米粉，轉至1.5mL離心管中。加入600μL預熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；
B.在管中加入等體積酚/氯仿600μL，上下顛倒充分混勻，抽提2min；
C.12000g離心5min,吸取上清到一新的離心管中,加入與上清等體積的沉淀液,混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min,去上清,保留沉淀；
D.在沉淀中加入60μLRNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C溶解沉淀，5min后加入300μL緩沖液，上下顛倒混勻10次；
Ε.取出離心柱，將離心柱放置在I個2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ；
F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加入200μL洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；
G.在離心柱中加入200μL70%乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；
H.12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；
1.將離心柱放置在一個新的1.5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50μL洗脫緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作LAMP反應的模板。
[0029](2)待測米粉樣品DNA的環介導等溫擴增
A.在反應管中加入20μL環介導等溫擴增反應液A、WLBst DNA聚合酶B和4μL待檢樣品DNA，混勻；
B.于恒溫水浴上63°C放置40min；
C.將水浴調到85°C中止反應，5min后取出待檢。
[0030](3)加入顯色劑SYBR Green,顯色檢測
樣品管管3反應液顏色變為綠色，見圖3。陽性對照管管I (胡蘿卜基因組DNA作為反應模板)反應液顏色變為綠色、空白對照管管2 (以水作為反應模板)反應液顏色為橙色，結果均正常，據此可判定該樣品檢出胡蘿卜成分。
[0031]實施例4
按照以下程序進行檢測:(I)待測面條樣品DNA的提取
A.取面條適量，磨碎后，稱取0.1g轉至1.5mL離心管中。加入600μL預熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；
B.在管中加入等體積酚/氯仿600μL，上下顛倒充分混勻，抽提2min；
C.12000g離心5min,吸取上清到一新的離心管中,加入與上清等體積的沉淀液,混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min,去上清,保留沉淀；
D.在沉淀中加入60μLRNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C溶解沉淀，5min后加入300μL緩沖液，上下顛倒混勻10次；
Ε.取出離心柱，將離心柱放置在I個2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ；
F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加入200μL洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；
G.在離心柱中加入200μL70%乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；
H.12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；
1.將離心柱放置在 一個新的1.5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50μL洗脫緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作LAMP反應的模板。
[0032](2)待測面條樣品DNA的環介導等溫擴增
A.在反應管中加入20μL環介導等溫擴增反應液A、WLBst DNA聚合酶B和4μL待檢樣品DNA，混勻；
B.于恒溫水浴上63°C放置40min；
C.將水浴調到85°C中止反應，5min后取出待檢。
[0033](3)加入顯色劑SYBR Green,顯色檢測
樣品管管3反應液顏色為橙色，見圖4。陽性對照管管I (以胡蘿卜基因組DNA作為反應模板)反應液顏色為綠色、空白對照管管2 (以水作為反應模板)反應液顏色為橙色，結果均正常，據此可判定該樣品未檢出胡蘿卜成分。
【權利要求】
1.一種基于環介導等溫擴增技術的胡蘿卜成分快速檢測試劑盒，其特征在于，其中的試劑包括(I) - (4): (1)環介導等溫擴增反應液A 包括 IOXBst buffer 反應緩沖液、l-2mmol/L dNTP、5_7mmol/L硫酸鎂、0.8_lMmol/L上游內引物、0.8-lMmol/L下游內引物、0.1-0.2Mmol/L上游外引物、0.1-0.2Mmol/L下游外引物、0.4-0.6Mmol/L上游環引物、0.4-0.6Mmol/L下游環引物和0.7-0.9mol/L甜菜堿； 其中IOXBst buffer反應緩沖液含有200mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和I %曲拉通X-100 ； 其中上游內引物的序列為:5’-AACCACCGATGTCGCGATGCCTTTTGTGTGCGGTTGGC-3’ ；下游內引物的序列為:5’ - GTCGTTGTGTATACCCGCCGCGGGTCACAATCGAAGTGCA-3’ ；上游外引物的序列為:5’ - GAAATTGGCCTCCCGTGC-3’ ；下游外引物的序列為:5’ -GCTTAAACTCAGCGGGTAGT-3’ ；上游環引物的序列為:5’ -CGTCACCAGAGACTCAITITTGA-3’ ；下游環引物的序列為:5’-GGCCCTTGGGCACAGCAAA-3’ ； 其中上游內引物、下游內引物、上游外引物、下游外引物、上游環引物、下游環引物體積比為:8:8:1:1:4:4 ；
(2)Bst DNA 聚 合酶 B:8U/^L ; (3)顯色劑C:熒光染料SYBR Green ； (4)陽性對照D:胡蘿卜基因組DNA，20ng/^L。
2.一種利用權利要求1所述的試劑盒檢測胡蘿卜成分的方法，其特征是依次包括下列步驟: (1)待檢樣品DNA的提取； (2)胡蘿卜成分的環介導等溫擴增: A.在裝有20μL如權利要求1所述的環介導等溫擴增反應液A的反應管中加入WLBstDNA聚合酶B和4PL待檢樣品DNA，混勻； B.于恒溫水浴上63°C放置40min； C.將水浴調到85°C中止反應，5min后取出待檢； 擴增時，設立2個對照:陽性對照為胡蘿卜基因組DNA、空白對照為不含DNA模板的水； (3)顯色檢測 在待檢的每個反應管中加入WL顯色劑C，直接用肉眼觀察顏色變化。
3.如果樣品的擴增反應液顏色變為綠色，說明待檢樣品含有胡蘿卜成分；如果顏色為橙色，則說明待檢樣品不含有胡蘿卜成分。
【文檔編號】C12N15/11GK103993075SQ201410171512
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年4月26日 優先權日:2014年4月26日
【發明者】孫敏, 高宏偉, 肖西志, 劉彩霞 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心