一種pEGF基因工程乳酸乳球菌的發酵優化培養基的制作方法
【專利摘要】本發明對一種pEGF基因工程乳酸乳球菌基礎發酵培養基進行優化，優化內容包括了培養基成分優化、發酵時間優化以及接種量優化。優化后的培養基成分為：每1L培養基含低蛋白乳清粉6.5g，葡萄糖5g，蛋白胨15g，牛肉膏1g，酵母浸粉1g，維生素C0.1g，硫酸鎂0.25g，硝酸鈉2g，硫酸亞鐵0.4g。對于優化后的發酵培養基，培養基pH為7.0，最佳發酵時間為27h，最佳接種量為10%。本發明優化后的發酵培養基，菌體濃度達到2×109CFU/ml，明顯高于基礎發酵培養基，顯著提高了發酵效果。同時，本發明的優化基礎發酵培養基大大降低了pEGF基因工程乳酸乳球菌的發酵成本。
【專利說明】一種pEGF基因工程乳酸乳球菌的發酵優化培養基
[0001]【技術領域】
本發明屬于微生態學，微生物發酵領域，更具體涉及一種可顯著提高PEGF基因工程乳酸乳球菌生物量的發酵培養基。
[0002]技術背景
豬表皮生長因子(porcine epidermal growth factor，pEGF)是表皮生長因子的一種，是豬乳中含量最豐富的生長因子之一。在豬初乳和常乳中表皮生長因子濃度含量很高，且其受體在豬小腸的分布研究得最多，EGF與其受體結合可發揮生理功能。有研究表明豬表皮生長因子具有多種生物學功能，如可刺激表皮和內皮細胞的增殖；可刺激胃腸道的生長以及誘導小腸消化酶的表達。對于初生的仔豬和早期斷奶仔豬，PEGF能夠影響其生產性能、免疫應答和小腸的發育，誘導小腸消化酶的表達。此外，PEGF具有促進靜止期的初級母卵泡變成活化卵泡，從而加速卵子的排出，因此具有提高哺乳動物的窩產仔數的功能。
[0003]乳酸乳球菌是一類能夠代謝糖類，產生50%以上乳酸的細菌通稱，包括乳酸乳球菌屬、乳球菌屬、雙歧桿菌屬、明串珠菌屬等至少23個屬。其本身具有調節腸道微生態，促進營養成分在腸道的消化吸收，降低血清中的膽固醇含量，緩解高血壓以及抗腫瘤作用。乳酸乳球菌為兼性厭氧菌是全球公認的食品級微生物，隨著分子生物學技術的不斷發展，通過基因重組對其改造，有目的、有選擇地使乳酸乳球菌產生有益的異源基因的產物，制成微生態制劑和活菌疫苗等保健品或藥品，是乳酸乳球菌分子生物學研究的一個重要方向。
[0004]隨著基因工程技術的飛速發展，我們可以通過對乳酸乳球菌質粒編碼特性的研究來構建我們所需要的質粒載體，通過一系列分子生物學手段例如轉導、結合、電轉化等，將其轉移到乳酸乳球菌中，使我們所需要的目的基因得以表達，從而使基因工程乳酸乳球菌集菌體、自身分泌物、外源蛋白于一體。將基因工程乳酸乳球菌應用到飼料中，可以作為一種新型的飼料添加劑，其能夠產生抗微生物(尤其致病菌)物質，還能夠調節動物機體腸道內的微生態平衡，增強動物機體免疫力，從而促進動物生長，提高飼料轉化率。
[0005]
【發明內容】

本發明提供了一種可以顯著提高PEGF基因工程乳酸乳球菌生物量的發酵優化培養基。
[0006]本發明中，所述的發酵培養基有如下組分組成:
1)低蛋白乳清粉6.5^15g/L;
2)無水葡萄糖5~20g/L;
3)蛋白胨5~15g/L;
4)牛肉膏r1g/L;
5)酵母浸出粉5g/L;
6)維生素C 0.1~0.5g/L;
7)硫酸鎂(Π).25g/L;
8)硝酸鈉(T2g/L;
9)硫酸亞鐵(T0.4g/L;10)所述發酵優化培養基的pH值為5.8-7.0;所述發酵優化培養基的培養時間為24^39h ;所述發酵優化培養基的接種量為2%~10% ;所述發酵優化培養方式為靜置培養；所述發酵培養溫度為37°C。
[0007]本發明中，所述的發酵培養基中含有低蛋白乳清粉6.5~15g/L;較佳地，所述的發酵優化培養基中含有低蛋白乳清粉6.5g/L。
[0008]本發明中,所述的發酵培養基中含有無水葡萄糖5~20g/L ;較佳地,所述的發酵優化培養基中含有無水葡萄糖5g/L。
[0009]本發明中，所述的發酵培養基中含有蛋白胨5~15g/L ;較佳地，所述的發酵優化培養基中含有蛋白胨15g/L。
[0010]本發明中，所述的發酵培養基中含有牛肉膏f 10g/L ;較佳地，所述的發酵優化培養基中含有牛肉膏lg/L。
[0011]本發明中，所述的發酵培養基中含有酵母浸出粉f5g/L;較佳地，所述的發酵優化培養基中含有酵母浸粉lg/L。
[0012]本發明中，所述的發酵培養基中含有維生素C0.1~0.5g/L ;較佳地,所述的發酵優化培養基中含有維生素C0.lg/L。
[0013]本發明優選地，所 述的發酵優化培養基中含有硫酸鎂0.25g/L ;所述的硝酸鈉2g/L ;所述的硫酸亞鐵0.4g/L。
[0014]本發明優選地,所述的發酵優化培養基pH值為7.0 ;所述的發酵培養時間為27h ；所述的接種量為10% ;所述的培養方式為厭氧靜置培養；所述的發酵培養溫度為37°c。
[0015]本發明更優選地，所述的發酵優化培養基由如下組分組成:每IL培養基含低蛋白乳清粉6.5g,葡萄糖5g,蛋白胨15g,牛肉膏Ig,酵母浸粉Ig,維生素C0.1g,硫酸鎂0.25g,硝酸鈉2g,硫酸亞鐵0.4g。
[0016]本發明中，溶解所述發酵優化培養基的介質為本領域常規，較佳地為水；所述水為本領域常規所述，如蒸餾水、雙蒸水等。
[0017]本發明中，所述的發酵優化培養基的制備方法為本領域常規，只需將其包含的各組分簡單混合，然后按照本領域常規微生物培養基的制備條件制備即可；所述的常規制備條件為121 °C，高壓濕熱滅菌15min。
[0018]本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0019]本發明所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌發酵優化培養基的積極進步效果在于:本發明的發酵優化培養基可提供PEGF基因工程乳酸乳球菌良好生長，顯著提高了 pEGF基因工程乳酸乳球菌的發酵生物量；同時，本發明的發酵優化培養基大大降低了 pEGF基因工程乳酸乳球菌發酵培養基的成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]附圖1 pEGF基因工程乳酸乳球菌的生長曲線。
[0021]附圖2 pEGF表達量測定。
【具體實施方式】
[0022]下面通過實驗實例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實例范圍之中。
[0023]實施例1:pEGF基因工程乳酸乳球菌的活化
液體活化培養基的制備:M17培養基3.76g，無水葡萄糖lg，蒸餾水100ml，121°C，高壓濕熱滅菌，15min,超凈臺中冷卻后，加入100 μ I紅霉素溶液,紅霉素溶液濃度為lmg/ml,4 °C保存備用。
[0024]活化培養基平板的制備:M17培養基3.76g，無水葡萄糖lg，瓊脂粉15g，蒸餾水100ml，12rC，高壓濕熱滅菌，15min，加入100 μ I紅霉素溶液，紅霉素溶液濃度為lmg/ml，每塊平板倒入20-25ml培養基，超凈工作臺中冷卻凝固后，封口，4°C保存備用。
[0025]將保存于40%甘油中的菌種拿于室溫下，在超凈工作臺中用高壓滅菌過的接種環挑取菌種，然后劃在平板上，封口，37°C下倒置培養24小時。
[0026]24小時后，用滅菌的接種環挑取單菌落，接種于液體培養基中，所述的培養基為上述液體活化培養基，37°C下靜置培養24小時。
[0027]24小時后，用移液器移取10% (v/v)的菌液，重新接種于一瓶液體活化培養基中，37°C下靜置培養24小時，即得到種子液，收集菌液，4°C保存，備用。
[0028]實施例2:pEGF基因工程乳 酸乳球菌生長曲線的測定
將pEGF基因工程乳酸乳球菌活化后，以10% (v/v)的接種量接種到基礎發酵培養基中，所述的基礎發酵培養基的組分如下:蛋白乳清粉6.5g,葡萄糖1g,蛋白胨1g,牛肉膏5g，酵母浸粉2.5g,硫酸鎂0.25g,硝酸鈉Ig,氯化鈉2g,硫酸亞鐵0.4g,維生素C 0.3g,蒸餾水 100mL, ρΗ7.0。
[0029]裝液量為10ml的三角牌裝80ml培養基，在37°C下靜置培養，每隔3個小時，采用血球平板計數法測定不同時間的菌落單位數，以培養時間為橫坐標、菌落單位數為縱坐標繪制生長曲線圖(圖1)。
[0030]由生長曲線確定pEGF基因工程乳酸乳球菌的最佳培樣時間為27h。
[0031]實施例3:調整培養基各成分比例對pEGF基因工程乳酸乳球菌發酵生物量的影響 在以下實驗中，采用兩因子，每次優化兩種培養基成分比例，其余成分不便，37°C下靜
置培養27h，用血球平板計數法測定菌落單位數。
[0032]3.1其他成分不變，設置低蛋白乳清粉濃度6.5g/L、10g/L、15g/L和葡萄糖濃度5g/L、10g/L、20g/L，每個組合重復3次，求平均值，(如表1)。結果表明，當低蛋白乳清粉濃度為6.5g/L，葡萄糖濃度為5g/L時，菌落單位數達到最高。
[0033]表1細菌生物量IgCFU
【權利要求】
1.一種PEGF基因工程乳酸乳球菌的發酵優化培養基，其特征在于:優化后的發酵培養基由如下組分組成: 1)低蛋白乳清粉6.5^15g/L; 2)無水葡萄糖5~20g/L; 3)蛋白胨5~15g/L; 4)牛肉膏r1g/L; 5)酵母浸出粉5g/L;
6)維生素C 0.1~0.5g/L; 7)硫酸鎂(Π).25g/L;
8)硝酸鈉(T2g/L; 9)硫酸亞鐵(T0.4g/L; 10)所述pEGF基因工程乳酸乳球菌發酵優化培養基的pH值為5.8-7.0 ;所述pEGF基因工程乳酸乳球菌發酵優化培養基的培養時間為24~39h ;所述pEGF基因工程乳酸乳球菌發酵優化培養基的接種量為29TlO% ;所述pEGF基因工程乳酸乳球菌發酵優化培養方式為厭氧靜置培養；所述PEGF基因工程乳酸乳球菌發酵培養溫度為37°C ;所述的pEGF基因工程乳酸菌發酵優化培養基中添加lml/L的紅霉素溶液；所述的紅霉素溶液濃度為10mg/ml。
2.如權利要求1所述的PEGF基因工程乳酸乳球菌發酵優化培養基，其特征在于，所述的發酵優化培養基中含有低蛋白乳清粉6.5g/L ;所述的無水葡萄糖5g/L。
3.如權利要求2所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌發酵優化培養基，其特征在于，所述的發酵優化培養基中含有蛋白胨15g/L;所述的牛肉膏lg/L。
4.如權利要求3所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌發酵優化培養基，其特征在于，所述的發酵優化培養基中含有酵母浸出粉lg/L ;所述的維生素C 0.lg/L。
5.如權利要求4所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌發酵優化培養基，其特征在于，所述的發酵優化培養基中含有硫酸鎂0.25g/L ;所述的硝酸鈉2g/L ;所述的硫酸亞鐵0.4g/L。
6.如權利要求5所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌發酵優化培養基，其特征在于，所述的發酵優化培養基中包括以下組分:每IL培養基含低蛋白乳清粉6.5g，葡萄糖5g，蛋白胨15g，牛肉膏Ig,酵母浸粉Ig,維生素C0.1g,硫酸鎂0.25g,硝酸鈉2g,硫酸亞鐵0.4g。
7.如權利要求6所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌發酵優化培養基，其特征在于，所述的發酵優化培養基最佳發酵時間為27h ;所述的發酵培養基最佳接種量為10% ;所述發酵培養基的PH為7.0。
8.如權利要求7所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌發酵優化培養基，其特征在于，所述的發酵優化培養基中添加100 μ I的紅霉素溶液；所述的紅霉素溶液濃度為10mg/ml ;所述的發酵優化培養基裝液量為10ml瓶裝80ml。
9.如權利要求8所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌發酵優化培養基，其特征在于，所述的發酵優化培養基培養方式為靜置培養；所述培養溫度為37°C。
10.如權利要求1~9所述任一項的pEGF基因工程乳酸乳球菌發酵優化培養基在pEGF基因工程乳酸乳球菌發酵培養中的應用。
【文檔編號】C12N1/20GK104031962SQ201410183934
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月5日 優先權日:2014年5月5日
【發明者】潘康成, 周堯, 賈賢奇 申請人:四川農業大學